扶正柔肝顆粒HHLSE制備過程控制的指紋圖譜研究

周紹春，劉常青，李曼莎，段海霞，宋力飛

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扶正柔肝顆粒HHLSE制備過程控制的指紋圖譜研究

周紹春1，劉常青1，李曼莎1，段海霞2，宋力飛1

（1.廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司，廣東廣州510663；2.廣州中澤生物技術(shù)有限公司，廣東廣州510663）

摘要：目的運用指紋圖譜方法，評價扶正柔肝顆粒在采用高效高壓差低溫連續(xù)式提取分離濃縮技術(shù)（HHLSE）制備過程中所產(chǎn)生的中間體，建立起過程控制模式。方法通過對生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的復(fù)方藥粉、醇提濃縮液、水提濃縮液、混合濃縮液、真空濃縮液、噴霧干燥粉分別進行指紋圖譜的測試，考察生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。結(jié)果10批扶正柔肝顆粒的復(fù)方藥粉、5種中間體各自指紋圖譜的相似度均在0.95以上。結(jié)論采用指紋圖譜方法對扶正柔肝顆粒HHLSE制備工藝過程進行監(jiān)控，方法準(zhǔn)確、有效，可用于扶正柔肝顆粒HHLSE制備過程的質(zhì)量控制和產(chǎn)品的質(zhì)量評價。

關(guān)鍵詞：指紋圖譜；扶正柔肝顆粒；過程質(zhì)量控制；HHLSE

中成藥是由很多不同成分組成的集合體，若只將其中某1個或2個成分作為質(zhì)量控制手段，顯然不能充分體現(xiàn)出藥物在各工序中的變化和傳遞情況。中藥指紋圖譜作為中藥質(zhì)量穩(wěn)定性的重要鑒定方法，在中藥制劑的質(zhì)量評價和中藥生產(chǎn)的質(zhì)量控制過程中有著廣泛的應(yīng)用［1-3］。運用指紋圖譜方法，可以很好地將物質(zhì)群在整個工藝過程中的變化傳遞情況呈現(xiàn)出來，是一種可行的中藥生產(chǎn)過程質(zhì)量控制模式［4-6］。

扶正柔肝顆粒由丹參、葉下珠、柴胡、苦參等11味中藥配伍而成，具有清熱解毒、疏肝解郁、活血化瘀的功效，主要應(yīng)用于肝纖維化、肝硬化和慢性肝炎治療，是一種具有抗肝癌和抗肝纖維化雙重作用的中藥制劑［7-8］。我公司首次采用高效高壓差低溫連續(xù)式提取分離濃縮技術(shù)（HHLSE，專利號：ZL200920304058.X）制備該中藥制劑，運用指紋圖

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-06-12 15：09 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.r.20160612.1509.002.html譜方法對工藝的制備過程進行中間過程跟蹤，能更好地對制備過程進行控制。

1 儀器與試藥

島津LC-10AT vp PLus型高效液相色譜儀（自動進樣，SPD-20A檢測器）；KQ-300VDE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AUW220D電子天平（日本島津公司）；TB-114電子天平（美國丹佛儀器公司）；GWF-20B高效渦輪粉碎機（江陰市瑞通機械設(shè)備有限公司）；ZLUPD-350A連續(xù)式高效低溫提取濃縮器（廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司）；R2003KE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（陜西太康生物科技有限公司）；MDR P-5噴霧干燥機（無錫市現(xiàn)代噴霧干燥設(shè)備有限公司）。

丹酚酸B對照品（批號：111562-201212）、苦杏仁苷對照品（批號：110832-201008）、柯里拉京對照品（批號：111623-200301）、蘆丁對照品（批號：100080-200707）、特女貞苷對照品（批號：111926-201203）、丹參酮IIA對照品（批號：0766-9606）、齊墩果酸對照品（批號：110709-200505）均購自中國食品藥品檢定研究院，供質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定用；乙腈為色譜純（Dikmarure公司）；純水（怡寶純凈水）；H3PO4（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；其余化學(xué)試劑均為分析純。

丹參、葉下珠、柴胡、苦參等中藥材均購自廣東眾康中藥飲片有限公司，經(jīng)本公司宋力飛高級工程師依據(jù)《中國藥典》（2015年版）版及《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009年版）檢驗均為合格品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取丹酚酸B、苦杏仁苷、柯里拉京、蘆丁、特女貞苷、丹參酮ⅡA、齊墩果酸對照品適量，分別置于25 mL棕色容量瓶中，分別加入50%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇、70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇、50%甲醇、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇，分別制成質(zhì)量濃度為0.301、0.164、0.584、0.107、0.231、0.27、0.25 mg/mL的各對照品溶液。

2.2 扶正柔肝復(fù)方藥粉及各中間品的制備

扶正柔肝顆粒HHLSE制備工藝：按處方稱取藥材10 kg，粉碎機粉碎，即為扶正柔肝復(fù)方藥粉，加入15倍50%乙醇進行HHLSE提取過濾濃縮，得到醇提濃縮液；醇提藥渣再加入15倍水進行HHLSE提取過濾濃縮，得到水提濃縮液。將上述醇提、水提濃縮液混合，進一步真空濃縮，再進行噴霧干燥，得到噴霧干燥粉，加入輔料進行制粒，干燥，即得。

分別取上述工藝中扶正柔肝醇提（反滲透）濃縮液、水提（反滲透）濃縮液、混合濃縮液、真空濃縮液、噴霧干燥粉共5處中間品。按工藝方法生產(chǎn)10批次，批號依次為S20150101至S20150110，每批次分別取上述5處工藝過程的中間品。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 扶正柔肝復(fù)方藥粉供試品溶液的制備 取“2.2”項下扶正柔肝復(fù)方藥粉約1.0 g，精密稱定，加入50%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。?00 W，45 kHz，35～45℃）120 min，放冷至室溫，50%乙醇補足減失質(zhì)量，濾過，續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得扶正柔肝復(fù)方藥粉供試品溶液。

2.3.2 單味藥材供試品溶液的制備 按照各藥材占處方中的比例，以2 g總處方量計算出單味藥材的質(zhì)量，精密稱定，加入50%乙醇100 mL，稱定質(zhì)量，其余按“2.3.1”項下“超聲提取”后方法操作，即得單味藥材供試品溶液。

2.3.3 陰性樣品溶液的制備 按照各藥材占處方中的比例，以2 g總處方量計算出每味藥材的質(zhì)量，除陰性對應(yīng)的單味藥材不稱量外，其他10味藥材按照計算質(zhì)量進行稱量，混合。加入50%乙醇100 mL，稱定質(zhì)量，其余按“2.3.1”項下“超聲提取”后方法操作，即得單味藥材對應(yīng)的陰性樣品溶液。

2.3.4 制備工藝中間品供試品溶液的制備 取“2.2”項下各中間品適量，折算成生藥量，按照1 g生藥稀釋至50倍質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)，分別加50%乙醇進行稀釋，濾過，取續(xù)濾液，再用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 色譜條件

色譜柱為 InertsiL ODS-SP柱 （5 μm，4.6 mm× 250 mm）；流動相為乙腈（A）-0.2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）H3PO4（B），梯度洗脫：0～10 min，5%A；10～12 min，9%A；12～25 min，9%A→16%A；25～35 min，16%A；35～40 min，16%A→17%A；40～45 min，17%A→20%A；45～50 min，20%A；50～60 min，20%A→25%A，60～80 min，25%A→35%A；80～100 min，35%A→60%A；100～110 min，60%A→70%A；110～120 min，70%A→95%A；120～130 min，95%A；檢測波長為 210 nm，流速為 1 mL/min，柱溫為35℃，進樣量為20 μL。分別精密吸取各對照品溶液和復(fù)方藥粉（批號：S20150101）溶液20 μL，按上述條件進行測定。結(jié)果如圖1所示。通過對扶正柔肝復(fù)方藥粉指紋圖譜的比較、觀察和計算，選定色譜峰面積較大且分離度較好的27個色譜峰，作為扶正柔肝復(fù)方指紋圖譜共有峰。

4.苦杏仁苷；5.柯里拉京；9.蘆丁；10.特女貞苷；15.丹酚酸B；24.丹參酮ⅡA；26.齊墩果酸。圖1 各對照品（A）、扶正柔肝復(fù)方藥粉（B）溶液的色譜圖Figure 1 Chromatograms of references（A）and the compound powder（B）of Fuzheng Rougan granules

2.5 指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 精密吸取同一批扶正柔肝復(fù)方藥粉的供試品溶液20 μL，按“2.4”項下色譜條件測定，重復(fù)進樣6次，記錄色譜圖。以丹酚酸B為參照峰，計算27個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”（下同）對其色譜圖進行相似度評價。結(jié)果27個共有峰相對保留時間RSD值均在1%以下，相對峰面積RSD值在5%以下，6次測定所得色譜圖相似度達到0.990以上，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗 取同一批（批號：S20150101）扶正柔肝復(fù)方藥粉6份，分別按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以丹酚酸B為參照峰，計算各主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并進行相似度評價。結(jié)果27個共有峰的相對保留時間RSD值均在1%以下，相對峰面積RSD值在5%以下，6次色譜圖相似度達到0.990以上，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批扶正柔肝復(fù)方藥粉供試品溶液各20 μL，分別在制備后0、2.5、5、7.5、12、24 h進樣，按“2.4”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以丹酚酸B為參照峰，計算27個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并進行相似度評價。結(jié)果27個共有峰的相對保留時間RSD值均在1%以下，相對峰面積RSD值在5%以下，6次色譜圖相似度達到0.970以上，表明供試品溶液在常溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 扶正柔肝復(fù)方指紋圖譜色譜峰歸屬試驗

分別按“2.3.1”項下方法制備1份復(fù)方藥粉（批號：S20150101）溶液、11份各單味藥材的供試品溶液、11份分別缺各單味藥材的陰性樣品溶液，按“2.4”項下色譜條件測定并記錄色譜圖，對復(fù)方指紋圖譜中的27個共有峰進行歸屬，結(jié)果見表1。其中因三七和甘草占復(fù)方比例較小，無專一歸屬峰。另通過比對，4、5、9、10、15、24、26號峰分別確定為苦杏仁苷、柯里拉京、蘆丁、特女貞苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、齊墩果酸，詳見圖1。

表1 扶正柔肝顆粒指紋圖譜色譜峰的歸屬Table 1 Identification of chromatographic peaks of Fuzheng Rougan granules

2.7 扶正柔肝顆粒制備過程中各中間品指紋圖譜的測定

分別取“2.1”項下丹酚酸B對照品溶液，10批扶正柔肝顆粒復(fù)方藥粉、HHLSE制備工藝過程的中間品醇提濃縮液、水提濃縮液、混合濃縮液、真空濃縮液及噴霧干燥粉，精密稱定，分別按照“2.3.4”項下方法制備供試品溶液，分別按“2.4”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，計算各中間品指紋圖譜的相似度，評價扶正柔肝顆粒HHLSE制備工藝的穩(wěn)定性及物料傳遞的規(guī)律性。結(jié)果見表2、圖2～圖8。表2中10批復(fù)方藥粉、各對應(yīng)中間品的指紋圖譜相似度均大于0.950，表明10批中間品的質(zhì)量是穩(wěn)定的，制備工藝也是穩(wěn)定的、可重復(fù)的。圖2～圖8為復(fù)方藥粉、不同中間品的指紋圖譜，色譜行為不盡相同，說明藥材中的物質(zhì)群在不同的工藝階段變化是不一致的，這可能由溶劑不同造成，也可能由不同工序條件，如加熱與否等造成。通過不同工序的指紋圖譜比較，可以直觀地看到物質(zhì)群的變化轉(zhuǎn)移過程。

表2 扶正柔肝顆粒復(fù)方藥粉、制備過程中各中間品指紋圖譜的相似度Table 2 Fingerprint similarity of the process quality control of Fuzheng Rougan granules and the intermediate products

S.丹酚酸B；a.復(fù)方藥粉；b.醇提濃縮液；c.水提濃縮液；d.混合濃縮液；e.真空濃縮液；f.噴霧干燥粉。圖2 丹酚酸B對照品（S）、扶正柔肝顆粒復(fù)方藥粉、各中間品的指紋圖譜Figure 2 　Chromatograms of the control sample of salvianolic acid B（S），the compound powder and the intermediate products of Fuzheng Rougan granules

S1～S10.批號S20150101～S20150110的復(fù)方藥粉。圖3 10批扶正柔肝復(fù)方藥粉及其對照指紋圖譜（R）Figure 3 Fingerprints of 10 batches of the compound powder of Fuzheng Rougan granules and their comparison（R）

S1～S10.批號S20150101～S20150110的醇提濃縮液。圖4 10批扶正柔肝顆粒HHLSE制備過程中醇提濃縮液及其對照指紋圖譜（R）Figure 4 　Fingerprints of 10 batches of concentrate of the ethanol extract in the Fuzheng Rougan granules′HHLSE preparation process and their comparison（R）

S1～S10.批號S20150101～S20150110的水提濃縮液。圖5 10批扶正柔肝顆粒HHLSE制備過程中水提濃縮液及其對照指紋圖譜（R）Figure 5 Fingerprints of 10 batches of concentrates of the aqueous extracts in the Fuzheng Rougan granules′HHLSE preparation process and their comparison（R）

S1～S10.批號S20150101～S20150110的混合濃縮液。圖6 10批扶正柔肝顆粒HHLSE制備過程中混合濃縮液及其對照指紋圖譜（R）Figure 6 Fingerprints of 10 batches of mixed concentrated solutions in the Fuzheng Rougan granules′HHLSE preparation process and their comparison（R）

S1～S10.批號S20150101～S20150110的真空濃縮液。圖7 10批扶正柔肝顆粒HHLSE制備過程中真空濃縮液及其對照指紋圖譜（R）Figure 7 Fingerprints of 10 batches of vacuum concentrates in theFuzhengRougan　granules′HHLSE　preparation process and their comparison（R）

S1～S10.批號S20150101～S20150110的噴霧干燥粉。圖8 10批扶正柔肝顆粒HHLSE制備過程中噴霧干燥粉及其對照指紋圖譜（R）Figure 8 Fingerprints of 10 batches of spray-dried powder in theFuzhengRougan　granules′HHLSE　preparation process and their comparison（R）

3 討論

3.1 色譜條件及參照色譜峰的選擇

扶正柔肝指紋圖譜，采用二極管陣列檢測器考察了不同吸收波長下的扶正柔肝指紋圖譜，重點觀察了波長分別為203、210、254、280、365 nm時的色譜圖。結(jié)果表明，在210 nm下檢測到的色譜指紋圖譜信息量大、特征性強、基線平穩(wěn)，具有較好的代表性，因此選擇210 nm作為指紋圖譜的檢測波長。同時還考察了乙腈-水、乙腈-0.2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）H3PO4、乙腈-0.4%H3PO4、乙腈-1.0%醋酸、甲醇-水、甲醇-0.2%H3PO4、甲醇-0.4%H3PO4、甲醇-1.0%醋酸8種不同的流動相，結(jié)果表明乙腈-0.2%H3PO4洗脫效果最好。此外還對6根色譜柱、4種不同柱溫進行比較優(yōu)化，最終確定為“2.4”項下色譜條件。

扶正柔肝復(fù)方藥粉指紋圖譜的27個共有峰中，丹酚酸B在整個色譜圖中所占峰面積最大、峰高最高，具有明顯特征，故選擇為參照峰。

3.2 指紋圖譜監(jiān)控與HHLSE工藝的優(yōu)化結(jié)合

從指紋圖譜中可以看出，醇提和水提所得物質(zhì)群是不一樣的，將兩者混合，與藥材對應(yīng)的指紋圖譜比較，可以很好地保留原藥材的物質(zhì)成分，即最終的提取物能很好地保持物料的原特征，這是HHLSE制備工藝的特征和優(yōu)勢。HHLSE工藝是在室溫下對物料進行提取，能很好保證物料的色、香、味傳遞，提取后結(jié)合陶瓷膜過濾、反滲透膜濃縮，整個濃縮液的制備過程避免了加熱處理。這在中藥制備工藝方面，有著得天獨厚的優(yōu)勢［9］。在整個HHLSE制備過程中，運用指紋圖譜進行監(jiān)控，可以直觀地看到整個復(fù)方化學(xué)物質(zhì)群的變化，從而對工藝過程進行控制，也可以為工藝的設(shè)定和優(yōu)化提供充分的依據(jù)。

本文以指紋圖譜為技術(shù)手段，對扶正柔肝顆粒的HHLSE制備工藝過程進行研究，可以很好地觀察到物質(zhì)群的變化，對制備過程進行監(jiān)控，使扶正柔肝顆粒制備的整個質(zhì)量控制體系更加嚴(yán)謹(jǐn)。

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（責(zé)任編輯：劉曉涵）

中圖分類號：R284.1

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0320-05

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016032401

收稿日期：2016-03-24

基金項目：廣東省重大科技專項（2012A080202009）；廣州市重大科技專項（201300000047）；廣州市科技創(chuàng)新基金項目（2013J4400040）

作者簡介：周紹春（1984—），男，初級工程師，從事中藥工藝研發(fā)，Email：zhoushaochun1218@163.com。

Study on the application of fingerprint in the HHLSE preparation and process quality control of Fuzheng Rougan granules

ZHOU Shaochun1，LIU Changqing1，LI Mansha1，DUAN Haixia2，SONG Lifei1
（1.Guangzhou Zeli Pharmatech Co.Ltd，Guangzhou 510663，China；2.Guangzhou Zhongze Biotechnology Co.，Ltd，Guangzhou 510663，China）

AbstractObjective To establish an in-process quality control mode with the fingerprint method for intermediates of Fuzheng Rougan granules prepared by high performance high pressure and low temperature continuous extraction separation and concentration technology HHLSE .Methods The stability and repeatability were observed by fingerprint tests of drug powder ethanol extract aqueous extract the mixture concentrated solution vacuum concentrate and spray drying powder.Results The fingerprint similarities of compound medicines powder and 5 kinds of intermediates from 10 batches of Fuzheng Rougan granules were above 0.95.Conclusion It is an accurate and effective method to monitor the process of HHLSE preparation for Fuzheng Rougan granules.

Key wordsfingerprint Fuzheng Rougan granules process quality control HHLSE