8味中藥對腸道特征菌的調(diào)節(jié)作用研究

葉清清，王雅茹，方偉彬，劉廣鋒，馮娟，管淑玉

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8味中藥對腸道特征菌的調(diào)節(jié)作用研究

葉清清1，2，3，王雅茹1，2，3，方偉彬1，2，3，劉廣鋒4，馮娟4，管淑玉1，2，3

（1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州510006；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006；3.廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州510006；4.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東廣州510300）

摘要：目的研究白術(shù)、炙甘草、益智、當(dāng)歸、制首烏、白芍、黃連、連翹8味中藥對腸道特征菌的調(diào)節(jié)作用。

方法以嗜酸乳桿菌、糞腸球菌和大腸埃希菌為試驗(yàn)菌株，采用比濁法比較8味中藥水提液對以上3株菌株增殖活性的影響，并采用SPSS19.0軟件對結(jié)果進(jìn)行聚類分析，探討上述中藥的作用規(guī)律。結(jié)果 與對照組比較，終質(zhì)量濃度為0.01 g/mL（以生藥計(jì)）的白術(shù)、炙甘草、益智、當(dāng)歸、制首烏、白芍顯著促進(jìn)嗜酸乳桿菌的增殖（P＜0.05）；炙甘草、益智、制首烏、白芍顯著促進(jìn)糞腸球菌的增殖（P＜0.05），益智、當(dāng)歸顯著促進(jìn)大腸埃希菌的增殖（P＜0.05），白術(shù)、炙甘草顯著抑制大腸埃希菌的增殖（P＜0.05）；黃連、連翹顯著抑制以上3株菌株的增殖（P＜0.05）。聚類分析發(fā)現(xiàn)8味中藥對腸道特征菌的作用可分為兩類：白術(shù)、炙甘草、益智、當(dāng)歸、制首烏、白芍為一類，黃連、連翹為一類。結(jié)論8味中藥對腸道特征菌的增殖活性有不同的影響，白術(shù)、炙甘草、益智、當(dāng)歸、制首烏、白芍對腸道特征菌的增殖活性作用相似，均能促進(jìn)嗜酸乳桿菌的增殖；黃連、連翹對腸道特征菌的增殖活性作用相似，能抑制以上3株試驗(yàn)菌株的增殖。

關(guān)鍵詞：中藥；腸道菌；菌群失調(diào)；增殖活性；規(guī)律分析

腸道菌群一般保持著動態(tài)平衡，一旦失衡容易引起腸道菌群失調(diào)癥，引發(fā)各種疾?。?-2］。定植于健康人體腸道的正常菌群主要分為有益菌（也稱共生菌）和條件致病菌。有益菌緊貼腸道黏膜表面并與黏膜上皮細(xì)胞粘連形成生物屏障，發(fā)揮營養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)等作用，它們是腸道優(yōu)勢菌群，主要包括雙歧桿菌屬和乳桿菌屬等。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，L.a）是腸道乳桿菌中的重要成員，其數(shù)量多少是衡量腸道菌群正常與否的重要指標(biāo)之一。

條件致病菌不是優(yōu)勢菌群，但是人體正常菌群的重要組成部分，主要包括腸球菌屬和腸桿菌屬。糞腸球菌（Enterococcus faecalis，E.f）和大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）是腸道內(nèi)普遍存在的條件致病菌［3］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，中藥在治療腸道菌群失調(diào)方面有較好的治療效果［2］。為此，本文以L.a、E.f和E.coli為腸道菌代表，選用白術(shù)、炙甘草、益智、當(dāng)歸、制首烏、白芍、黃連、連翹8種臨床常用中藥，研究它們對腸道特征菌L.a、E.f、E.coli的調(diào)節(jié)作用，并分析其作用規(guī)律，以期為臨床用藥提供參考和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥材

白術(shù)Atractylodis Macrocephalae Rhizoma，批號：YPA5F0002；炙甘草 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cumMelle，批號：YPA5D0003；益智Alpinae Oxyphyllae Fructus，批號：YPA4G0001；當(dāng)歸Swertiae Herba，批號：YPA5E0001；制首烏 Polygoni Multiflori Radix Preparata，批號：YPAL0001；白芍Paeoniae Radix Alba，批號：YPA5E000；黃連Coptidis Rhizome，批號：YPA5D0001；連翹Forsythiae Fructus，批號：YPA5A0001，以上藥材購于廣州采芝林藥店，經(jīng)廣東藥科大學(xué)姬生國教授鑒定符合藥典規(guī)定。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

L.a、E.f由本實(shí)驗(yàn)室從益生菌制劑中分離并鑒定；E.coli（菌株號：ATCC25922）由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所鑒定保藏。MRS培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)［4］配制，營養(yǎng)肉湯與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)［5］配制。

1.3 儀器與材料

BLx800全自動酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；SWCJ-1F超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；MJ-78A高壓滅菌鍋（美國 STIK）；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 中藥對腸道特征菌增殖活性的影響

2.1.1 中藥水煎液的制備 分別稱取8味藥材粗粉各5 g，加水煎煮2次，每次100 mL，合并濾液濃縮并定容至50 mL，得折合生藥量為0.1 g/mL的藥液。根據(jù)文獻(xiàn)［6］，使用時稀釋至終質(zhì)量濃度0.01 g/mL（折合生藥計(jì)）。

2.1.2 菌液的制備 取活化后的L.a和E.f，按1%的接種量分別接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，L.a培養(yǎng)18 h，E.f培養(yǎng)12 h；E.coli活化后，挑取單菌落于營養(yǎng)瓊脂試管斜面37℃培養(yǎng)24 h，用2 mL營養(yǎng)肉湯洗脫，菌液加入裝有8 mL營養(yǎng)肉湯的試管中混合。L.a菌液濃度稀釋至108CFU/mL，E.f、E.coli菌液稀釋至107CFU/mL。

2.1.3 比濁法測定8味中藥對腸道特征菌的增殖活性 各試驗(yàn)組按表1加入相應(yīng)體積的中藥藥液、液體培養(yǎng)基和菌液混合均勻，L.a 37℃培養(yǎng)48 h，E.f 37℃培養(yǎng)24 h，490 nm下測定各組吸光度（A）；E.coli 37℃培養(yǎng)18 h，630 nm下測定各組A值，其中A給藥組=A1-A2，A對照組=A3-A4。采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，給藥組和對照組比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按公式“增殖率=（A給藥組/A對照組）×100%”計(jì)算增殖率，見圖1。

表1 中藥活性測定各試驗(yàn)組的組成與體積Table 1 The composition and volume of the test group for the activity of TCMs

與對照組比較：促進(jìn)作用，*P＜0.05，**P＜0.01；抑制作用，#P＜0.05，##P＜0.01。圖1 8味中藥對腸道特征菌的增殖活性影響Figure 1 Effect of 8 herbs on the proliferation of representative intestinal bacteria

可見，與對照組比較，終質(zhì)量濃度為0.01 g/mL（以生藥計(jì)）的白術(shù)、炙甘草、益智、當(dāng)歸、制首烏、白芍可顯著促進(jìn)L.a的增殖（P＜0.05）；炙甘草、益智、制首烏、白芍顯著促進(jìn)E.f的增殖（P＜0.05），益智、當(dāng)歸顯著促進(jìn)E.coli的增殖（P＜0.05），白術(shù)、炙甘草顯著抑制E.coli的增殖（P＜0.05）；黃連、連翹顯著抑制3株菌株增殖（P＜0.05）。

2.2 8味中藥對L.a、E.f、E.coli調(diào)節(jié)作用的規(guī)律分析

為判斷8味中藥之間作用的相似性，找到作用規(guī)律，以8味中藥對L.a、E.f、E.coli的增殖率為指標(biāo)，采用SPSS19.0軟件進(jìn)行聚類分析。本研究采用系統(tǒng)聚類法中的組間連接法對樣本進(jìn)行聚類，得到的樹狀圖見圖2。

圖2　8味中藥的聚類分析結(jié)果Figure 2 Results of cluster analysis of 8 herbs

可見，8味中藥對腸道特征菌的調(diào)節(jié)作用被聚為兩類：第一類有益智、白芍、炙甘草、白術(shù)、當(dāng)歸、制首烏，這類中藥能顯著促進(jìn)L.a菌株增殖；第二類有黃連、連翹，這類中藥對3株試驗(yàn)菌株均有顯著抑制作用。

3 討論

近年來，中藥對腸道菌群的調(diào)節(jié)研究已在國內(nèi)外廣泛開展。成揚(yáng)等［7］發(fā)現(xiàn)健脾活血方可以改善酒精性脂肪肝模型腸道細(xì)菌群落的構(gòu)成。鄢偉倫等［8］發(fā)現(xiàn)白術(shù)會使小鼠腸道雙歧桿菌、乳桿菌增多，腸桿菌減少，腸球菌無變化，進(jìn)而改善腸道內(nèi)菌群狀況。羅艷春等［9］發(fā)現(xiàn)，白術(shù)能增加鹽酸林可霉素導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)大鼠模型腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量，降低腸桿菌數(shù)量。本研究經(jīng)聚類分析發(fā)現(xiàn)，歸脾經(jīng)藥物益智、白芍、炙甘草、白術(shù)、當(dāng)歸和歸肝經(jīng)藥物制首烏對腸道特征菌調(diào)節(jié)作用相似，均能顯著促進(jìn)有益菌的增殖。聚類結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)分析提示，調(diào)肝健脾藥可能具有通過促進(jìn)有益菌增殖而改善腸道菌群的作用。

黃連、連翹對腸道特征菌的調(diào)節(jié)作用相似，均能抑制E.f、E.coli和L.a的增殖。黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒之功，連翹具有清熱解毒、疏風(fēng)散熱之功?，F(xiàn)代研究證明，黃連、連翹具有抗病原微生物、解熱、抗感染等藥理作用，其治療細(xì)菌感染性疾病的顯著功效已被臨床驗(yàn)證［10］。黃連、連翹性味苦寒，抗菌譜廣，本研究結(jié)果顯示黃連、連翹抑制E.f和E.coli生長的同時也會抑制有益菌L.a的生長，故臨床使用應(yīng)在中醫(yī)指導(dǎo)下用藥，以免引起腸道菌群紊亂。

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（責(zé)任編輯：陳翔）

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0291-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016012901

收稿日期：2016-01-29

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81001702）；廣州市科技計(jì)劃產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)項(xiàng)目（201508020016）；海南省科技興海專項(xiàng)項(xiàng)目（2015XH03）

作者簡介：葉清清（1990—），女，2013級碩士研究生，Email：412911504@qq.com；通信作者：管淑玉（1976—），女，博士，副教授，主要從事中藥質(zhì)量控制與生物活性研究，Email：guanshy3@163.com；馮娟（1974—），女，博士，研究員，主要從事細(xì)菌性疾病及免疫防治技術(shù)研究，Email：juanf@21cn.com。

Study on the regulation effect of 8 herbs on intestinal diagnostic flora growth

YE Qingqing1，2，3，WANG Yaru1，2，3，F(xiàn)ANG Weibin1，2，3，LIU Guangfeng4，F(xiàn)ENG Juan4，GUAN Shuyu1，2，3
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmacutical Univercity，Guangzhou 510006，China；2.Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of TCM，Guangzhou 510006，China；3.Engineering Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universities of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China；4.South China Sea Fisheries Research Institute，China Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300，China）

AbstractObjective To study the regulation effect on intestinal diagnostic flora of eight herbs including Atractylodis Macrocephalae Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle Alpiniae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba Coptidis Rhizoma and Forsythiae Fructus.Methods Lactobacillus acidophilus L.a Enterococcus faecalis E.f and Escherichia coli E.coli used as experimental bacteria the bacterial multiplication was measured by the optical density and SPSS19.0 was used to cluster analysis to explore the role of 8 herbs.Results The multiplication results showed that Atractylodis Macrocephalae Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-05-23 16：38 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160523.1638.005.htmlPraeparata cum Melle Alpinae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba could promote the proliferation rate of L.a significantly P＜0.05 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle Alpinae Oxyphyllae Fructus Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba could promote the multiplication of E.f significantly P＜0.05 Alpinae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba could promote the multiplication of E.coli significantly P＜0.05 and Atractylodis Macrocephala Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle could inhibite the multiplication of E.coli significantly P＜0.05 at the final crude herbal concentration of 0.01 g/mL. Coptidis Rhizoma and Forsythiae Fructus inhibited the multiplication of L.a E.f and E.coli significantly P＜0.05 at final crude herbal concetration of 0.01 g/mL.Cluster analysis found that Atractylodes Macrocephala Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle Alpinae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba were divided a same class while Coptidis Rhizoma and Forsythiae Fructus divided another class.Conclusion 8 herbs showed differrent regulation effects on intestinal diagnostic flora.Atractylodis Macrocephalae Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle Alpinae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba showed a similar proliferative activity on intestinal flora and promoted the proliferation of L.a.Both of Coptidis Rhizoma and Forsythiae Fructus showed a similar proliferative activity on intestinal flora and inhibited the proliferation of L.a E.f and E.coli.

Key wordstraditional chinese medicine；intestinal bacteria；alteration of intestina；proliferative activity；regularity analysis