毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分析藥桑多糖中單糖的組成

張　暉， 宋峰峰， 謝　睆， 李松雅， 馬曉麗

(1新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師奇臺(tái)醫(yī)院藥劑科， 新疆　奇臺(tái)　831800； 新疆醫(yī)科大學(xué)2藥學(xué)院； 3分析測試中心， 烏魯木齊　830011)

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毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分析藥桑多糖中單糖的組成

張暉1， 宋峰峰2， 謝睆2， 李松雅2， 馬曉麗3

(1新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師奇臺(tái)醫(yī)院藥劑科， 新疆奇臺(tái)831800； 新疆醫(yī)科大學(xué)2藥學(xué)院；3分析測試中心， 烏魯木齊830011)

摘要：目的了解高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分析藥桑多糖中單糖組成的作用。方法將藥桑多糖經(jīng)酸水解后,經(jīng)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化,采用高效毛細(xì)管電泳法分析各單糖組成。電泳條件：180 mmol/L 硼酸緩沖液溶液，pH=10.05,柱溫25℃,電壓15 kV,氣壓進(jìn)樣3. 447 5 kPa下進(jìn)樣10 s,檢測波長245 nm。結(jié)果藥桑多糖中主要由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸組成,其物質(zhì)的量之比為1∶7.4∶15.8∶3.4∶10.8∶14.3∶4.5。結(jié)論高效毛細(xì)管電泳法用于多糖中單糖的組成分析具有快速、簡便、精度高的特點(diǎn)，可用于藥桑多糖中單糖組成測定和質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：高效毛細(xì)管電泳; 藥桑多糖; 單糖組成

藥桑屬黑桑種(Morus nigra Linn) ，為天然22倍體半栽培類型野生桑樹種質(zhì)資源[1]，僅分布于新疆阿克蘇、和田和喀什地區(qū)，是新疆獨(dú)特的藥用果桑種質(zhì)資源，藥桑為維吾爾族重要的民間藥材，維吾爾族稱其為“夏圖土”[2-5]，具有健腦安神、益脾胃、補(bǔ)血養(yǎng)肝的作用，用于治療心悸失眠、健忘、脾胃虛寒和黃疸肝炎等疾病[6]。對藥桑組分研究的相關(guān)報(bào)道較多[7-10]，目前主要集中在藥理學(xué)和藥效學(xué)研究，未見采用高效毛細(xì)管電泳法對藥桑多糖的單糖組成的分析報(bào)道。本研究采用柱前衍生化方法，用毛細(xì)管電泳法研究藥桑多糖的單糖組成，以期為新疆道地資源藥桑的開發(fā)和利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1儀器與試劑

1.1材料與試劑藥桑采自喀什市，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)教授鑒定為藥桑黑桑種(Morus nigra Linn)的果實(shí)。單糖對照品葡萄糖(D-Glucose anhydrous，110833-200904)、甘露糖(Mannose，140651-200602)、半乳糖(Galactose,100226-201105)、鼠李糖(Rhamnose，111683-200401)、半乳糖醛酸(GalUA,111201-200609)、木糖(D-xylose,111508-200404)、阿拉伯糖(Arabinose，1506-200001)均購自中國食品藥品鑒定研究院；甲醇、無水乙醇、氯仿、三氟乙酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純),HCl、NaOH(洛陽市化學(xué)試劑廠，分析純),衍生化試劑：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(上海試劑二廠，分析純),水為超純水。

1.2儀器P/ACE MDQ型高效毛細(xì)管電泳儀(美國 Beckman公司),32 Karat Sofware(美國Benkman公司),未涂層毛細(xì)管柱(河北永年縣銳灃色譜器件公司,d=75 μm),BS110S型分析天平(北京賽多利斯天平有限公司),phsj-3F型 pH計(jì)(上海儀電科學(xué)股份有限公司),KQ-500PE型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)DZKW-S-4型水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

2方法與結(jié)果

2.1藥桑多糖的粗提取稱取10.0 g藥桑粉末至錐形瓶，加入100 mL超純水，進(jìn)行超聲提取，溫度60℃,功率59 kHz，時(shí)間30 min,提取1次。抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移至燒杯中，隨后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮至約剩10 mL縮液，轉(zhuǎn)至燒杯，按乙醇-濃縮液=4∶1的比例進(jìn)行醇沉。室溫靜置24 h，得到多糖沉淀，棄上清液，將沉淀轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，放入減壓烘箱干燥12 h，即得藥桑多糖粗提取物，備用。

2.2藥桑多糖的水解精確稱取藥桑多糖10 mg置于安瓿瓶，加入三氟乙酸2 mL，置于105℃烘箱中，進(jìn)行酸水解，4 h后得單糖混合試液。將該試液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用甲醇濃縮3次，每次3 mL,最終用超純水轉(zhuǎn)移4次，至5 mL容量瓶定容，即得。

2.3衍生化處理

2.3.1單糖混合對照品溶液的配制及衍生化分別精密稱取單糖對照品木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸30.0、30.0、36.0、32.8、36.0、36.0、39.2 mg(純度≥98%)，置于10 mL 容量瓶中，加水溶解并定容，制成濃度均為20 mmol/L 的單糖對照品溶液備用。分別精密吸取1 mL 20 mmol/L的7種單糖對照品溶液于10 mL量瓶中，用超純水定容，混勻，得到各單糖濃度均為2 mmol/L的單糖混合對照品溶液。取該溶液500 μL于炮彈管，加入PMP甲醇溶液500 μL與0.3 mol/L NaOH溶液500 μL，渦旋30 s,然后置于70℃水浴30 min,冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCL溶液，渦旋進(jìn)行中和。再加2 mL氯仿，上下翻轉(zhuǎn)10次，吸取下層液棄去，重復(fù)2次，第3次吸取上層液體，過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣, 記錄圖譜。

2.3.2多糖樣品衍生化精密吸取藥桑多糖酸水解液500 μL，按照“2.3.1”項(xiàng)下衍生化方法對酸水解液進(jìn)行衍生化， 過0.45 μm 微孔濾膜, 進(jìn)樣, 記錄圖譜。

2.4電泳條件未涂層毛細(xì)管柱(永年縣銳灃色譜器件公司，d=75 μm)，緩沖液：180 mmol/L硼酸溶液，pH=10.05，柱溫25℃，電壓15 kV，壓力進(jìn)樣3.447 5 kPa下進(jìn)樣10 s，檢測波長245 nm。毛細(xì)管電泳儀每次使用之前，依次用水、0.1 mol/L NaOH溶液、水、0.1 mol/L HCl溶液、水、緩沖液各沖洗3 min，再用緩沖液平衡 5 min。通過單糖混合對照品 PMP 衍生物電泳條件的優(yōu)化 ,最終選擇上述分離體系,能得到較理想的分離效果 , 混合對照品及樣品的分離圖見圖1、2 。

1: PMP; 2: 木糖; 3: 阿拉伯糖; 4: 葡萄糖; 5: 鼠李糖; 6: 甘露糖; 7: 半乳糖; 8: 半乳糖醛酸圖1　混合單糖對照品的PMP衍生物高效毛細(xì)管電泳圖

2.5線性關(guān)系考察配置濃度為0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、0.75、1、2 mmol/L的混合標(biāo)品溶液。經(jīng)“2.3.1”項(xiàng)下衍生化后，按“2.4”項(xiàng)下最終選定的色譜條件分別進(jìn)樣、測定。以對照品濃度X (mmol/L)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，相關(guān)系數(shù)r>0.995 0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:藥桑多對照品溶液濃度在0.031 2～2.000 0 mmol/L范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。7種單糖的回歸方程見表1。

1: PMP; 2: 木糖; 3: 阿拉伯糖; 4: 葡萄糖; 5: 鼠李糖; 6: 甘露糖; 7: 半乳糖; 8: 半乳糖醛酸圖2　多糖水解樣品PMP衍生物高效毛細(xì)管電泳圖

表 1　7種單糖線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批藥桑樣品，按供試品溶液的制備法制備并衍生，進(jìn)樣6次，測定藥桑多糖中各單糖峰面積的RSD為1%～6%，表明本方法重復(fù)性好，見表2。

表2　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.6”項(xiàng)下供試品溶液在0、2、4、6、8、12、24、48 h分別進(jìn)樣測定，結(jié)果48 h內(nèi)各單糖色譜峰面積無明顯變化， RSD分別為3.76%、1.20%、1.24%、5.34%、3.07%、2.83%、6.62%，表明被測樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8精密度試驗(yàn)取同一對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。精密度試驗(yàn)符合要求。各個(gè)單糖的RSD分別為木糖1.72%、阿拉伯糖1.78%、葡萄糖2.36%、鼠李糖3.80%、甘露糖4.16%、半乳糖3.57%、半乳糖醛酸3.60%。

2.9回收率試驗(yàn)精密吸取2 mmol/L的單糖對照品混合液0.4、0.5、0.6 mL，得低中高3個(gè)濃度對照品試液。按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。用移液槍吸取供試液和高中低對照品試液各250 μL L,各3份，進(jìn)行衍生。按上述色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，見表3。

表3　回收率測定結(jié)果(n=6)

2.10樣品分析結(jié)果精確稱取藥桑多糖依“2.2”、“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，將混合單糖對照品圖譜與樣品的圖譜對照，由遷移時(shí)間可知，藥桑多糖由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸7種單糖組成，采用校正因子計(jì)算單糖組成比例，求得藥桑多糖中木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸的物質(zhì)的量之比為1∶7.4∶15.8∶3.4∶10.8∶14.3∶4.5。

3討論

3.1多糖提取及衍生本研究使用了超聲法和水浴法提取多糖，超聲法提取的產(chǎn)率較水浴法高，并且超聲法簡便，快速，因此選擇了超聲法提取多糖。除了糖醛酸外，其他中性糖的電離能力非常弱，PMP衍生物電離能力也非常弱，但單糖屬于多羥基化合物，能和硼酸根形成帶負(fù)電荷的絡(luò)離子，可以選用硼砂液為電泳緩沖液[3]，PMP產(chǎn)生的峰可與各單糖衍生物很好地分離，不影響樣品的測定。

3.2電泳條件優(yōu)化結(jié)果電泳緩沖液對分離的影響:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，緩沖液的酸度和濃度對分離具有明顯的影響。7種單糖對照品PMP衍生物的分離度隨硼酸緩沖液pH值增加而提高，同時(shí)增加緩沖液中硼砂濃度，分離度提高，但單糖的出峰時(shí)間亦有所延長，且電流增加較明顯，影響重現(xiàn)性。在本實(shí)驗(yàn)

條件下，硼酸濃度為180 mmol/L時(shí)分離效果最為理想，7種單糖基本達(dá)到基線分離。通過單糖對照品PMP衍生物CZE分離條件的優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)選擇硼酸緩沖液濃度180 mmol/L，pH=10.5，電壓15 kV，柱溫25℃的CZE分離體系，能得到較理想的分離效果。

采用HPCE法測定藥桑多糖，與原有的總多糖測定方法相比，有分離效率高，使用簡便、快速，供試品需要量少等顯著優(yōu)點(diǎn)。其定性、定量結(jié)果不僅為其它糖類化合物提供了有益的啟示，而且證明HPCE法具有廣闊的應(yīng)用前景。

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(本文編輯施洋)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81460493；81260144)

作者簡介：張暉(1994-)，男，本科，藥士，研究方向：天然藥物分析。 通信作者：馬曉麗，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病新藥研究，E-mail: mxl108@sohu.com。

中圖分類號(hào)：R914

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-5551(2016)08-1017-04

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.08.020

[收稿日期：2015-12-16]

The quantitative determination of monosaccharide compositions in polysaccharide of Morus nigra Linn by High Performance Capillary Zone Electrophoresis

ZHANG Hui1, SONG Fengfeng2, XIE Huan2, LI Songya2, MA Xiaoli3

(1DepartmentofPharmacyQitaiHospital,SixthDivisionofXinjiangProductionandConstructionCorps,XinjiangQitai, 831800,China；2CollegeofPharmacy；3CenterofInstrumentalAnalysis,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011，China)

Abstract:ObjectiveThe High Performance Capillary Zone Electrophoresis was used to analysis monosaccharide composition in polysaccharide of Morus nigra Linn. MethodsThe polysaccharide of Morus nigra Linn were derivatization with 1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) after hydrolyzed into monosaccharides with Trifluoroacetic Acid (TFA) and were separated by HPCE. The CE condition: Buffer: 180 mmol/L boric acid solution ( pH 10.05), column temperature: 25℃；Voltage: 15kV; injection time: 3.447 5 kPa×10 s, the detection: 245 nm. ResultsThe polysaccharide was mainly composed of xylose, Arabinose, Glucose, Rhamnose, Mannose, Galactose, GalUA. The amount of the substance is 1∶7.4∶15.8∶3.4∶10.8∶14.3∶4.5. ConclusionHigh performance capillary electrophoresis method for the analysis of polysaccharide is rapid, simple and high accuracy. It can be used for the determination and quality control of polysaccharide in Morus nigra Linn.

Keywords：High Performance Capillary Zone Electrophoresis; polysaccharide of Morus nigra Linn; monosaccharide composition