HPLC法測定大鼠血漿及糞便中新疆紫草3種萘醌類色素的含量

古力扎努·阿合買提， 買爾旦·馬合木提

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院； 2附屬腫瘤醫(yī)院， 烏魯木齊　830011)

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HPLC法測定大鼠血漿及糞便中新疆紫草3種萘醌類色素的含量

古力扎努·阿合買提1， 買爾旦·馬合木提2

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院；2附屬腫瘤醫(yī)院， 烏魯木齊830011)

摘要:目的建立測定大鼠血漿及糞便中新疆紫草3種萘醌類成分含量的高效液相色譜法(HPLC法)。方法采用COSMOIL C18-AR-Ⅱ(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相A乙腈(A)-0.15%甲酸(B)(v/v)溶液，進(jìn)行洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長275 nm ，柱溫25℃，檢測時(shí)間35 min。結(jié)果血漿中左旋紫草素在0.40～6.40 μg、乙酰紫草素在25.0～600.0 μg、β,β′-二甲基丙烯酰紫草素在25.0～600.0 μg 范圍內(nèi)均與峰面積呈線性關(guān)系，左旋紫草素回收率為97.78%～100.1%、乙酰紫草素為100.1%～100.2%、β-β′-二甲基丙烯酰紫草素為97.78%～100.1%，日間、日內(nèi)RSD均<1.5%。糞便中各組分在10～400 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，平均回收率分別為(78.2±2.5)%、(82.0±2.9)%和(79.5±3.5)%。0～12、12～24、24～48 h糞便中左旋紫草素絕對回收量分別為23.61、38.28、4.13 mg；乙酰紫草素分別為7.20、70.78、11.53 mg；β-β′二甲基丙烯酰紫草素分別為46.32、60.15、16.88 mg。結(jié)論HPLC法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，適用于測定血漿及糞便中新疆紫草萘醌類成分含量。

關(guān)鍵詞：新疆紫草； 左旋紫草素； 乙酰紫草素； β,β′-二甲基丙烯酰紫草素； HPLC； 大鼠血漿； 大鼠糞便

新疆紫草[Arnebia euchroma (Royle) Johnst]習(xí)稱軟紫草,又名假紫草、新疆軟紫草、新疆假紫草, 為紫草科多年生草本植物新疆紫草的根, 分布于我國新疆、甘肅及西藏西部地區(qū), 是藥材紫草的主要來源[1]。其具有涼血、活血、解毒透疹的功效，被臨床廣泛應(yīng)用[2]。新疆紫草中含有多種化學(xué)成分，包括萘醌類、苯醌類、生物堿類、苯酚、酚酸類、三萜酸、甾醇類、黃酮類以及多糖類等物質(zhì)。目前研究較多的是脂溶性很強(qiáng)的萘醌類化合物。萘醌類化合物主要有去氧紫草素(deoxyshikonin)、β,β-甲基丙烯酰紫草素(β,β-dimethylacrylshikonin,DS)、β-羥基異戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin,AS)、左旋紫草素(shikonin，SK)、去氫阿卡寧(dehydroalkanin)和β-羥基異戊酰阿卡寧(β- hydroxyisovalerylalkanin)等物質(zhì)[3]，其具有抗菌抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保肝、止血等作用[4-6]。本研究旨在建立HPLC法測定大鼠生物樣品血漿及糞便中新疆紫草3種萘醌類成分含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1儀器與試藥

1.1實(shí)驗(yàn)儀器LC-2010C高效液相色譜儀(日本島津)，CLASS-VP V6.14 SP1數(shù)據(jù)工作站(日本島津)，BP211D型十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)，SK3300H型超聲波清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)，DT-500A型電子天平(常熟市金羊砝碼儀器有限公司)，TDL-4型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，EDTA k2抗凝真空采血管(奧地利VACUETTE)。

1.2試藥新疆紫草對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121430-201103)，左旋紫草素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110769-200405)，乙酰紫草素對照品(德瑞試劑公司，批號(hào)：20130507-2)，β,β′-二甲基丙烯酰紫草素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111689-200503)。新疆紫草藥材(購自新疆參茸中藥飲片公司批號(hào)：15072402)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)/生藥學(xué)教研室帕麗達(dá)·阿布力孜教授鑒定為擬紫草屬植物新疆紫草(Arnebia euchroma (Royle) Johnst)的根。乙腈為色譜純(美國Fisher公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(新)2011-0004，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～220 g。

2方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備分別精密稱取左旋紫草素、乙酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰紫草素對照品適量，分別溶于甲醇中，制成100 mg/mL的對照品儲(chǔ)備液。再分別量取儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋制成含左旋紫草素、乙酰紫草素和β.β′-二甲基丙烯酰紫草素分別為1.00、60.0 和60.0 mg/mL的混合對照品溶液,備用。取本品適量，按遞減法，分別用流動(dòng)相稀釋制成含左旋紫草素0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mg/mL，乙酰紫草素0.125、2.50、5.00、10.0、20.0、40.0、60.0 mg/mL，β,β′-二甲基丙烯酰紫草素0.125、2.50、5.00、10.0、20.0、40.0、60.0 mg/mL的混合對照品系列溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2供試品溶液的制備分別稱取對照藥材和供試品藥材粉末各5.0 g，各加入12倍量(V/V)的95%乙醇溶液,置于150 mL具塞錐形瓶中，混勻，室溫放置，密封遮光，冷浸8 h后，過濾并收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至約5.0 mL，用5.0 mL 95%乙醇潤洗，合并濃縮液和潤洗液，置于真空干燥箱40℃干燥12 h，得干浸膏。分別稱取干浸膏粉末0.1 g，加入1.0 mL甲醇，稱重，超聲使其完全溶解，冷卻至室溫，補(bǔ)足重量，過(0.45 μm)微孔濾膜，作為對照藥材和樣品的供試品溶液，備用。

2.3色譜條件COSMOILC18-AR-Ⅱ色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈(A)-0.15%甲酸(B)(v/v)溶液，洗脫流程0～10 min,A(%)=60%;10～15 min,A(%)=60%～70%;15～30 min,A(%)=70%;30～35 min,A(%)=70%～60%，流速1.0 mL/min；柱溫25℃，檢測波長275 nm ，檢測時(shí)間35 min，進(jìn)樣量20 μL。

2.4血漿樣品的處理取SD大鼠血漿48 μL于離心管中，加入對照品藥材溶液2.0 μL，渦旋混合1 min,加入等體積的稀鹽酸酸化，10 000 r/min離心2 min,取上清液50 μL于另一離心管中，加入乙腈50 μL渦旋混合1 min，10 000 r/min離心，取上清液，氮?dú)獯蹈?加入50 μL乙腈復(fù)溶，10 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

2.4.1專屬性考察精密量取1 mg/mL的對照藥材儲(chǔ)備液0.2 mL于離心管中，揮干溶劑，加入空白血漿50 μL混勻。另取空白血漿、對照藥材和供試品溶液各50 μL與不同的離心管中，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件檢測，記錄色譜峰。在該色譜條件下，左旋紫草素、乙酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰紫草素分離效果好，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定，結(jié)果見圖1～4。

1：左旋紫草素；2：乙酰紫草素；3：β,β-二甲基丙烯酰紫草素

1：左旋紫草素；2：乙酰紫草素；3：β,β-二甲基丙烯酰紫草素

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢測限取空白血漿 7份，每份50 μL，分別加入混合對照品系列溶液10 μL,使?jié)舛确謩e成為：左旋紫草素0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40 mg/mL，乙酰紫草素和β,β′-二甲基丙烯酰紫草素成為：1.25、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、600.0 μg/mL，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件檢測，記錄色譜峰，以歸一化法計(jì)算處理。以各組分相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，各組分加入量為橫坐標(biāo)(X),進(jìn)行線性回歸，左旋紫草素在0.40～6.40 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，線性方程為:Y=154.75X+896.75,R=0.997 0，最低檢測限為0.40 mg/mL；乙酰紫草素在25.0～600.0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，線性方程為：Y=378.09 X+9 611.3,R=0.994 3;最低檢測限為25 μg/mL；β,β′-二甲基丙烯酰紫草素在25.0～600.0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，線性方程為：Y=1 005.9X-1 832，R=0.992 1，最低檢測限為25 μg/mL。

2.4.3精密度試驗(yàn)取空白血漿，按“2.4”項(xiàng)下方法分別制備左旋紫草素、乙酰紫草素和β,β′-二甲基丙烯酰紫草素低、中、高3個(gè)濃度(含左旋紫草素0.10、0.80、6.40 μg/mL；含乙酰紫草素和β,β′-二甲基丙烯酰紫草素均為1.25、100.00、600.00 μg/mL)溶液各6份，每個(gè)濃度的樣品分別每天測定1次，連續(xù)測定3 d，以當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測定樣品的濃度，分別計(jì)算日內(nèi)精密度與日間精密度，見表1。

2.4.4回收率試驗(yàn)取“2.4.3”項(xiàng)下低、中、高3個(gè)濃度的樣品，以空白血漿加混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液提取處理樣品與直接測定的對照品的峰面積比值計(jì)算提取回收率，左旋紫草素低、中、高3個(gè)樣品的回收率分別為(97.78±2.50)%、(99.20±2.50)%和(100.10±2.51)%；乙酰紫草素為(100.10±2.12)%、(100.00±3.12)%和(100.2±3.01)%；β,β′-二甲基丙烯酰紫草素為(97.78±2.50)%、(99.90±2.12)%和(100.10±3.20)%。

2.4.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取精“2.4.3”項(xiàng)下低、中、高3個(gè)濃度的血漿樣品，室溫放置6 h，反復(fù)凍融3次，-20℃冰凍保存20 d,按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)條件下，血漿樣品中左旋紫草素、乙酰紫草素和β,β′-二甲基丙烯酰紫草素反復(fù)凍融3次仍保持穩(wěn)定,見表2。

表1　精密度試驗(yàn)

表2　穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5糞便樣品的處理

2.5.1糞便樣品的處理稱取空白大鼠糞便30 mg于離心管中，加入乙酸乙酯200 μL，渦旋混合1 min，10 000 r/min離心10 min，分離上清液，殘?jiān)俅渭尤肷鲜鋈軇?00 μL重復(fù)上述操作，萃取3次，合并上清液，用氮?dú)獯蹈?，?0 μL乙腈復(fù)溶，離心1 min，取上清液。

2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與回收率稱取空白大鼠糞便約40 mg于7個(gè)離心管中，分別加入混合對照品系列溶液適量，使各組分的濃度為10～400 μg/mL，混勻后，各加入1 200 μL水勻漿，吸取勻漿100 μL于另一離心管中，加入200 μL乙酸乙酯，渦旋混合5 min，10 000 r/min離心10 min，分離上清液，殘?jiān)俅渭尤胍宜嵋阴?00 μL重復(fù)萃取3次，合并上清液，用氮?dú)獯蹈桑?0 μL乙腈復(fù)溶，取上清液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件檢測。結(jié)果，各組分在10～400 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，左旋紫草素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=91.768X+759.666(R2=0.997 6)，乙酰紫草素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=383.99X-1 488.3(R2=0.993 7)，β,β′-二甲基丙烯酰紫草素：Y=725.13X-1 536.4(R2=0.993 2)，最低檢測濃度為6 μg/mL。經(jīng)測定左旋紫草素、乙酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰紫草素的平均提取回收率分別為(78.2±2.5)%、(82.0±2.9)%和(79.5±3.5)%。

2.6大鼠血漿及糞便中3種萘醌類成分的含量測定

2.6.1收集血漿及糞便取正常SD大鼠20只，隨機(jī)分為給藥組和空白對照組，每組10只，同一條件飼養(yǎng)，兩組動(dòng)物均禁食不禁水12 h。給藥組按0.024 g/kg體質(zhì)量灌胃給予新疆紫草藥提取物0.5% CMC-Na溶液混懸，對照組給予0.5% CMC-Na溶液混懸，分別于給藥前及給藥后15、30 min及1、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h 從眼底靜脈取血，分離血漿。同時(shí)收集給藥前及給藥后0～12、12～36、36～48、48～72 h的糞便，-20℃冰箱冷凍保存。

2.6.2血漿樣品中藥物含量的測定血漿樣品按“2.4”項(xiàng)下方法處理，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件檢測。結(jié)果大鼠灌胃后0～48 h內(nèi)，血漿樣品中均未檢測到紫草萘醌類成分的特有峰。

2.6.3糞便樣品中藥物含量的測定稱取收集的糞便樣品40 mg，各加入1 200 μL水勻漿，吸取勻漿100 μL于另一離心管中，加入200 μL乙酸乙酯，渦旋混合5 min，10 000 r/min離心10 min，分離上清液，殘?jiān)俅渭尤胍宜嵋阴?00 μL重復(fù)萃取3次，合并上清液，用氮?dú)獯蹈桑?0 μL乙腈復(fù)溶，取上清液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件檢測，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組分的濃度。結(jié)果0～12、12～24、24～28 h糞便中左旋紫草素絕對回收量分別為23.61、38.28、4.13 mg；乙酰紫草素分別為7.20、70.78、11.53 mg；β-β′二甲基丙烯酰紫草素分別為46.32、60.15、16.88 mg。

3討論

關(guān)于紫草萘醌類成分的體內(nèi)藥物濃度測定，主要采用單一成分的測定方法。孫東曉等[7]采用衍生化高效液相色譜法研究了靜脈注射乙酰紫草素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)；李慧義等[8]給予大鼠腹腔注射左旋紫草素，收集到的膽汁和血樣分別經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶水解后，采用RP-HPLC/DAD方法初步考察了紫草素的體內(nèi)分布，初步檢測到大鼠的膽汁和尿樣中分別有10種代謝物。Zhou等[9]采用氧化燃燒爐技術(shù)處理小鼠灌胃給予3H-β,β-二甲基丙烯酰紫草素后的組織、糞樣(尿樣直接加閃爍液測定)，用HPLC法分離后用液閃計(jì)數(shù)儀測定其放射性水平，研究了小鼠體內(nèi)的組織分布與排泄情況。結(jié)果顯示，3H-β,β-二甲基丙烯酰紫草素在胃腸道放射性濃度最高，肝臟、肺、腎臟、心臟等組織內(nèi)放射性濃度次之，骨骼肌、脊髓、腦中分布較少。小鼠灌服 3H-β,β-二甲基丙烯酰紫草素后36 h從糞中收集到給藥總放射劑量的72.87%，從尿液中回收到6.81%，糞、尿液中回收到(79.68±0.18)%，血漿中未檢測到原形藥物。說明3H-β,β-二甲基丙烯酰紫草素在小鼠體內(nèi)分布廣，排泄較完全，主要以原形藥物經(jīng)糞便排泄為主，經(jīng)腎排泄為輔。在本研究建立的色譜條件下，給予大鼠灌胃紫草提取物后0～48 h，大鼠血漿和尿液中未檢測到紫草萘醌類成分，而糞便檢測到了紫草萘醌類的3個(gè)主要成分，該結(jié)果與田慧芳等[10]報(bào)告的結(jié)果基本一致。說明紫草萘醌類成分在體內(nèi)分布廣，與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合呈結(jié)合狀態(tài)，以游離狀態(tài)分布在血液中的量相對較少,結(jié)合態(tài)的萘醌類很快被代謝后經(jīng)糞便排泄。

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(本文編輯施洋)

基金項(xiàng)目：天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京大學(xué))開放研究課題(20130215)

作者簡介：古力扎努·阿合買提(1989-) ,女(維吾爾族),在讀碩士，研究方向:中藥民族藥基礎(chǔ)研究。 通信作者：買爾旦·馬合木提,男(維吾爾族)，主任藥師，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥民族藥開發(fā)；E-mail:maierdan60@sina.com。

中圖分類號(hào)：R914

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-5551(2016)08-1012-05

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.08.019

[收稿日期：2016-04-05]

Determination of three naphthaquinone concentration from Arnebia euchroma (Royle) Johnst in rats plasma and faeces by HPLC methods

Gulizhanu Ahemaiti1, Maierdan Mahemuti2

(1CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity;2AffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo establish a HPLC method for determine of three contents of naphthaquinone from Arnebia euchroma (Royle) Johnst in rats plasma and faeces. MethodsCOSMOIL C18-AR-Ⅱ (4.6 mm×250 mm, 5 μm)， column was used with acetonitrile (A) -0.15% formic acid (B)(v/v)as mobile phase by gradient eluting with the flow rate of 1.0 mL/min for 35 min，and the column temperature was maintained at 25℃, detecting wavelength at 274 nm. ResultsThe linear range in plasma of shikonin, acetylshikonin and β-β, -dimethylacrylshikonin were between 0.40 to 6.40 μg, 25.0 to 600.0 μg and 25.0 to 600.0 μg, respectively. The recoveries of these ingredients correspondingly were between 97.78 to 100.1%, 100.1 to100.2% and 97.78 to100.1%. The RSD of intra-day and inter-day were less than 1.5%. The linear range in faeces of shikonin, acetylshikonin and β-β, -dimethylacrylshikonin were between 10-400 μg/mL with the average recoveries of (78.2±2.5)%, (82.0±2.9)% and (79.5±3.5)%, respectively. Absolute recovery amount of Naphthoquinone in feces as: shikonin 0-12 h：23.61 mg，12-24 h：38.28 mg，24-48 h：4.13 mg； acetylshikonin 0-12 h：7.20 mg，12-24 h：70.78 mg， 24-48 h：11.53 mg and β-β, -dimethylacrylshikonin 0-12 h：46.32 mg， 12-24 h：60.15 mg， 24-48h：16.88 mg. ConclusionThe established method has a good selectivity and reproducibility for the determination of naphthaquinone from Arnebia euchroma (Royle) Johnst in plasma and faeces of rats.

Keywords:Arnebia euchroma (Royle) Johnst; shikonin; acetylshikonin; β-β, -dimethylacrylshikonin; HPLC； rat plasma; rat faece