牛體內(nèi)囊胚經(jīng)體外共培養(yǎng)誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞整合素αv，β3基因差異的表達(dá)

倪茜瞵，倪和民，潘興乾，齊曉龍，盛熙暉，邢書涵，劉云海，郭勇*

（北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）北京市重點(diǎn)實驗室，北京 102206）

?

牛體內(nèi)囊胚經(jīng)體外共培養(yǎng)誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞整合素αv，β3基因差異的表達(dá)

倪茜瞵，倪和民，潘興乾，齊曉龍，盛熙暉，邢書涵，劉云海，郭勇*

（北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）北京市重點(diǎn)實驗室，北京 102206）

【摘要】目的 利用牛體內(nèi)胚胎與其子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞體外共培養(yǎng)的方式，探究共培養(yǎng)前、后子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中整合素αv，β3基因差異表達(dá)的變化，為今后建立快捷有效的牛子宮容受態(tài)預(yù)判方法提供參考。方法 將體內(nèi)沖出的牛囊胚與原代培養(yǎng)并傳代純化至第5代的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞進(jìn)行24 h體外共培養(yǎng)，利用RT-PCR技術(shù)對共培養(yǎng)前、后的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞進(jìn)行αv，β3基因的表達(dá)檢測。結(jié)果 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，共培養(yǎng)前、后均有整合素αv，β3的表達(dá)；共培養(yǎng)I組（囊胚組），其共培養(yǎng)后誘導(dǎo)整合素αv，β3基因的表達(dá)與未共培養(yǎng)對照組二者之間差異無顯著性（P＞0.05）；共培養(yǎng)II組（孵化囊胚組），其共培養(yǎng)后整合素αv，β3基因的表達(dá)顯著高于對照組和共培養(yǎng)I組（P＜0.05）。結(jié)論 牛體內(nèi)孵化囊胚經(jīng)體外共培養(yǎng)誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞表達(dá)整合素αv，β3的效果，明顯優(yōu)于早期囊胚；整合素αv，β3基因具有作為牛子宮容受態(tài)體外檢測標(biāo)志的潛力。

【關(guān)鍵詞】牛；體內(nèi)胚胎；子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞；共培養(yǎng)；αv，β3基因

家畜胚胎移植技術(shù)可顯著提高良種母畜的繁殖效率，但移植后其胚胎著床率偏低的問題卻一直影響著該技術(shù)的實際應(yīng)用、推廣效果［1］。在牛的妊娠過程中，大約有一半的胚胎在第8～17天之間發(fā)生著床失敗，其原因普遍認(rèn)為是由于孕體與子宮間交流不足所致［2］。有研究表明，胚胎的附植是通過母體子宮與胚胎之間的雙向溝通（cross-talking）而建立起來的［3］。因此，通過對動物胚胎早期著床機(jī)理的研究，將有助于認(rèn)識母體與胚胎間的相互作用機(jī)理及相關(guān)的調(diào)節(jié)機(jī)制，并為日后人為調(diào)控母畜子宮生理狀態(tài)，以及進(jìn)一步提高體外制備家畜胚胎的移植妊娠率提供理論基礎(chǔ)。

目前，公認(rèn)的反芻動物胚胎源信號僅有IFN-τ一種［4］，與此同時，與妊娠相關(guān)并在母畜子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中表達(dá)的基因簇，也逐漸被人們發(fā)現(xiàn)并得到關(guān)注，現(xiàn)已知的主要基因包括：整聯(lián)蛋白、骨橋蛋白、ISG15以及白細(xì)胞介素等［5，6］。其中整合素主要參與調(diào)控細(xì)胞間的粘附，遷移等過程［7］，是一種以異二聚體形態(tài)存在的細(xì)胞表面糖蛋白，由兩種非共價連接的亞基α和β組成，被認(rèn)為是動物細(xì)胞間最重要的連接細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)骨架的受體［8］。人們最早在人類子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了整合素，并有研究顯示：整合素αv，β3（由編碼構(gòu)成該整合素蛋白的2個不同亞基的2個不同基因的表達(dá)產(chǎn)物組成）的表達(dá)量在妊娠期會大幅上升，因此推測其可能與胚胎著床有關(guān)。目前，整合素αv，β3已成為判斷人類子宮建立容受態(tài)的標(biāo)志之一。此外，國外近年來有報道指出，在牛、羊等反芻動物的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中也檢測到了整合素的表達(dá)，但是有關(guān)利用反芻動物體內(nèi)胚胎，進(jìn)行其相應(yīng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外共培養(yǎng)，以及體外誘導(dǎo)相關(guān)子宮源基因差異變化的研究，尚未見任何報道。目前對于反芻動物子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中整合素的表達(dá)規(guī)律及調(diào)控機(jī)理仍不明確。

有鑒于此，本實驗將體內(nèi)沖胚獲得的牛體內(nèi)胚胎，經(jīng)與其子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞體外共培養(yǎng)之后，利用RT-PCR技術(shù)檢測共培養(yǎng)前、后整合素αv，β3在牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的差異表達(dá)情況，為今后有效建立牛的子宮容受態(tài)體外（快速）檢測體系提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗選用生殖器官正常且未受孕的小牛子宮，取自河北省大廠縣屠宰場。于屠宰場取下保存于25～30℃且含有雙抗（青霉素100 IU/mL和鏈霉素100 IU/mL）的鈣鎂水中，保證4 h內(nèi)運(yùn)回實驗室。牛體內(nèi)胚胎：購自北京奶牛中心（編號：021-10012）。

1.2 實驗試劑

胎牛血清（Gibco）、DMEM、DPBS、NEAA、EAA、丙酮酸鈉、胰蛋白酶（TE）、二甲基亞砜（DMSO）、青霉素（penicillin）、鏈霉素等均購自Sigma公司；SDS（十二烷基硫酸鈉）、EDTANa購自北京奇華盛；Trizol（Invitrogon）；EDTANa2（北京奇華盛）；50*TAE buffer（博邁德生物）；異丙醇、無水乙醇、三氯甲烷均購自北京化工廠；M-MLV RT試劑盒、GV-1、DNA MarkerMix E、瓊脂糖凝膠均購自北京賽百盛公司。

1.3 實驗儀器

體視顯微鏡：江南XTB-1；倒置顯微鏡：江南；培養(yǎng)箱：Thermo CO2培養(yǎng)箱，371；電子天平：西德，Sartorius BS124S；超凈工作臺：蘇州市醫(yī)用凈化設(shè)備廠；掌心離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)LDZ4-0.8。

1.4 實驗方法及分組

1.4.1 牛子宮內(nèi)膜組織的分離、原代培養(yǎng)

①將帶回的子宮用預(yù)先加熱到37℃且含有雙抗的鈣鎂水清洗至無血無雜質(zhì)；②根據(jù)實驗需求，取適量的子宮角，縱向剖開，用PBS清洗2～3遍；③用剪刀，鑷子及刀片將外層脂肪等剝離，留下最內(nèi)層半透明狀內(nèi)膜上皮，PBS沖洗6～8遍至無細(xì)碎組織掉落；④將其剪成1 mm2的小塊，DPBS清洗數(shù)遍至上清透亮；⑤取約200 mL的組織塊懸液以小滴的形式均勻接種于6 cm培養(yǎng)皿中，植塊間距約在0.3 cm，然后補(bǔ)充DMEM（20%FBS）液500 mL，輕搖培養(yǎng)皿，使組織塊均勻的平鋪于培養(yǎng)皿上（液體很薄，但一定要鋪滿全皿）；⑥培養(yǎng)于5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中；⑦約5～10 d后，組織邊緣有細(xì)胞長出。

1.4.2 牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞傳代培養(yǎng)

①自接種后每48 h換一次液，待匯合度達(dá)到90%時，利用胰酶消化法進(jìn)行傳代；②吸去皿中的培養(yǎng)液，挑除組織塊；③加入1 mL 0.25%胰酶，放入37℃培養(yǎng)箱中消化8～12 min，期間可拿出培養(yǎng)箱在倒置顯微鏡下觀察，若細(xì)胞大部分變圓，則應(yīng)立即加入1 mL DMEM（10%FBS）終止消化；④利用移液槍輕輕吹打培養(yǎng)皿底部，使細(xì)胞漂浮，后吸取細(xì)胞懸濁液于1.5 L離心管中，3000 r/min，離心3 min，棄上清；⑤加入1 mL DMEM輕輕吹打混勻，接種到新的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.3 牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

①子宮內(nèi)膜傳至第3代，若暫不進(jìn)行共培養(yǎng)實驗，則將其凍存。②吸出培養(yǎng)液，DPBS緩沖液清洗兩遍，胰酶消化；③細(xì)胞變圓后，移入離心管，離心3000 r/min，3 min，棄上清，加入1 mL預(yù)先配置好的凍存液，混勻后轉(zhuǎn)移至凍存管；④放入凍存盒中，-80℃冰箱18 h，轉(zhuǎn)入液氮，可長期保存。當(dāng)準(zhǔn)備進(jìn)行共培養(yǎng)時，對第3代凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。

①將細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃的溫水中進(jìn)行解凍，邊水浴加熱邊晃動，當(dāng)內(nèi)容物完全呈液態(tài)時即可，總時間不超過2 min；②酒精擦拭凍存管外部，細(xì)胞液移入1.5 mL EP管中，離心3000 r/ min，3 min，棄上清；③加入DMEM（10%FBS）培養(yǎng)液輕輕吹打混勻，接種于四孔板中，待匯合度達(dá)到85%以上即可使用。

1.4.4 牛體內(nèi)胚胎的解凍復(fù)蘇

①預(yù)先準(zhǔn)備好37℃的溫水，室溫保持在25～28℃，將液氮中保存的胚胎管取出，空氣浴5 s，37℃水浴10 s，見管內(nèi)乳白色變?yōu)橥该魃后w即可；②撥出棉塞，將胚胎打入培養(yǎng)液中，觀察形態(tài)是否完整；③撿入Hepes清洗2～3遍，CR2后期液潤洗2～3遍后，入滴培養(yǎng)；④觀察12 h，若胚胎有擴(kuò)張，則可以進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4.5 牛體內(nèi)胚胎與牛子宮上皮細(xì)胞共培養(yǎng)

①細(xì)胞傳入四孔板培養(yǎng)至第5代，匯合度達(dá)到85%以上，可進(jìn)行后續(xù)實驗；②在共培養(yǎng)前2 h，換上含有20%FBS的CR2后期培養(yǎng)液；③復(fù)蘇五枚牛體內(nèi)囊胚，培養(yǎng)12 h后觀察，選取形態(tài)良好的大腔囊胚與牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，一孔一囊胚，用CR2后期培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃，5%CO2的環(huán)境中24 h；④實驗重復(fù)五次，每次三枚胚胎分別與一孔上皮細(xì)胞共培養(yǎng)；⑤設(shè)對照組為未共培養(yǎng)的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。

1.4.6 共培養(yǎng)后子宮內(nèi)膜細(xì)胞總RNA提取及相關(guān)基因的表達(dá)檢測

①撿出囊胚，細(xì)胞用DPBS洗2遍，加入500 μL TRIzol，若不能立即提取，放入-80℃冰箱保存；②提取時，常溫融化，冰上靜置5 min，加入200 μL氯仿，顛倒混勻10次，冰上靜置5 min，4℃高速離心，12 000 r/min，10 min；③取上層液相移入新EP管中，加入500 μL異丙醇，顛倒混勻10次，冰上靜置10 min，4℃高速離心，12 000 r/min，10 min；④離心后，可見管底有極少量沉淀，棄上清，加入1 mL 85%的冰乙醇，4℃高速離心，10 500 r/min，5 min；⑥棄上清，晾干5 min，加入ddH2O溶解RNA樣品，測定總RNA濃度及純度；⑦合格樣品進(jìn)行10倍稀釋作為檢測模板，反應(yīng)體系及程序如下：95℃ 5 min；95℃ 45 s；55℃45 s；72℃1 min，共30個循環(huán)后，進(jìn)行72℃延伸5 min；以?-actin作為內(nèi)參；⑧擴(kuò)增引物由英俊生物公司合成。αv的上游引物 5′-gagctgagaaacaacggtcc-3′，下游引物5′-atcccgcttcgtgatgagat-3′；β3的上游引物5′-cagagggtggttttgatgcc-3′，下游引物5′-catcattgggctggacgatg-3′，β-actin的上游引物5′-cctgcggcattcacgaaactac-3′，下游引物5′-actcctgcttgctgatccactc-3′；⑨制備2%瓊脂糖凝膠，每孔加入7 μL 的PCR產(chǎn)物，在120 V/cm的恒定電壓下電泳20 min，放入凝膠成像儀觀察，拍照。

1.4.7 圖像分析

用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，對信號表達(dá)進(jìn)行比較。

1.4.8 統(tǒng)計方法

用SPSS 19.0-for Windows進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析（數(shù)據(jù)相關(guān)分析結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示）。平行對比，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞

體外培養(yǎng)的牛子宮內(nèi)膜上皮原代細(xì)胞（圖1）與傳代細(xì)胞（圖2），長勢良好，可進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 解凍的體內(nèi)胚胎

剛復(fù)蘇時，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)聚集在一起，無明顯空腔；待培養(yǎng)12 h后，囊胚恢復(fù)擴(kuò)張狀態(tài)，腔體清晰可見，結(jié)構(gòu)完整，說明情況良好，可用于后續(xù)實驗（見圖3）。

2.3 共培養(yǎng)

如圖4所示，共培養(yǎng)時間為24 h，胚胎稍有擴(kuò)張，囊胚腔變大，透明帶變薄。

注：A.箭頭所指為子宮內(nèi)膜組織塊；B.箭頭所指為原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。圖1 組織塊接種第10天的原代細(xì)胞（bar=60 μm，10×20）Note.Arrow A indicates bovine uterine tissue bloc.Arrow B indicates the original generation of bovine endometrial epithelial cells.Fig.1 Primary bovine uterine endometrial epithelial cells derived from the tissue block cultured for 10 days（bar=60 μm，10×20）

注：C.箭頭所指為1代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞；D.箭頭所指為4代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。圖2 子宮內(nèi)膜上皮傳代細(xì)胞（bar=60 μm，10×20）Note.Arrow C and D indicate bovine endometrial epithelial cells.Fig.2 Passaged bovine endometrial epithelium cells（bar=60 μm，10×20）

注：E.為剛解凍的牛桑葚胚；F.為體外培養(yǎng)12 h的牛早期囊胚。圖3 解凍后的牛體內(nèi)胚胎（bar=80 μm，10×40）Note.E indicates a bovine morula；F indicates an early bovine blastocyst after being in vitro cultured for 12 h.Fig.3 In vivo bovine embryos after freezing-thawing （bar=80 μm，10×40）

注：G.剛進(jìn)行共培養(yǎng)的牛囊胚；H.共培養(yǎng)24 h后的牛囊胚。圖4 共培養(yǎng)前、后的牛體內(nèi)胚胎（bar=80 μm，10×40）Note.G indicates a bovine blastocyst co-cultured with endometrial epithelial cells at the beginning. H indicates bovine blastocyst co-cultured with endometrial epithelial cells for 24 h.Fig.4 Bovine blastocysts before and after co-culture with endomerial epithelial cell for 24 hours（bar=80 μm，10×40）

2.4 子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞αv，β3共培養(yǎng)前、后的RTPCR檢測結(jié)果

2.4.1 凝膠成像

每個PCR實驗各重復(fù)5次，從電泳結(jié)果看出，看家基因β-actin正常表達(dá)，表明提取的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)后，可穩(wěn)定用于后續(xù)實驗。見圖5。

注：A.陽性對照；B.對照組；C.共培養(yǎng)I組；D.共培養(yǎng)II組。圖5 單枚牛體內(nèi)胚胎與其子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)24 h前、后αv，β3基因的差異表達(dá)情況Note.A.Positive control sample；B.Control group；C.Co-culture group I；D.Co-culture group IIFig.5 Differential expression of integrin αv，β3 after in vivo bovine blastosysts being co-cultured with endometrial epithelial cells

2.4.2 灰度值分析結(jié)果

每組實驗平行重復(fù)5次，凝膠成像所得的圖片用ImageJ軟件分析得到灰度值。利用SPSS 19.0軟件中的ANOVA單因素方差分析處理灰度值數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖6，圖7所示：共培養(yǎng)前、后均有整合素αv，β3的表達(dá)；共培養(yǎng)I組（未孵化囊胚組），其共培養(yǎng)后整合素αv，β3的表達(dá)變化與未共培養(yǎng)對照組相比，差異無顯著性（P＞0.05）；共培養(yǎng)II組為孵化囊胚組，其共培養(yǎng)后整合素αv，β3的表達(dá)顯著高于未共培養(yǎng)對照組和共培養(yǎng)I組（P＜0.05）。

注：A.為共培養(yǎng)組；B.共培養(yǎng)I組；C.共培養(yǎng)II組；上標(biāo)相同字母表示差異無顯著性，P＞0.05不同字母表示差異有顯著性，P＜0.05（下同）。圖6 牛體內(nèi)囊胚與子宮內(nèi)膜共培養(yǎng)24 h前后αv相對灰度值比較Note.A：Control group.B：Co-culture group I.C：Co-culture group II. The same superscript letters indicate non-significant difference （P＞0.05）.The different superscript letters indicate a significant difference（P＜0.05）（same as below）.Fig.6 Comparison of the mRNA levels of integrin αv mRNA in endometrial epithelial cells before and after co-culture with the bovine blastocyst for 24 h

圖7 牛體內(nèi)囊胚與子宮內(nèi)膜共培養(yǎng)24 h前后β3相對灰度值比較Fig.7 Comparison of the mRNA level of integrin β3in the endometrial epithelial cells before and after co-culture with bovine blastocyst for 24 h.

3 討論

哺乳動物胚胎著床的過程是通過胚胎與母體子宮間正常的信息交流實現(xiàn)的。不僅需要良好質(zhì)量的胚胎，也需要母體子宮處于容受態(tài)，才能接受附植，否則就會發(fā)生妊娠失敗。整合素屬于粘附蛋白家族因子，主要參與細(xì)胞間的粘附，遷移過程。在反芻動物的胚胎著床過程中，大量涉及細(xì)胞的粘附，增殖，分化與遷移。因此，我們猜想，整合素可能參與了反芻動物的胚胎著床過程，本試驗欲通過體外共培養(yǎng)模型來探究其整合素在胚胎附植中的變化，并對未來體外檢測子宮容受態(tài)的工作提供實踐基礎(chǔ)。

20世紀(jì)后期，F(xiàn)isher及Sueoka［9，10］兩個團(tuán)隊首先在人類的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了整合素的表達(dá)，并證實其參與了子宮容受態(tài)的建立，隨后，Johnson、Burghardt等［11，12］分別在綿羊和豬的子宮內(nèi)膜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了整合素的表達(dá)。1995年，MacLaren與Wildeman［13-15］最早在牛的胚胎上檢測到了整合素亞基β1，然而其α配體尚不明確，并最終發(fā)現(xiàn)，整合素表達(dá)于植入期牛子宮胚胎界面，以及整個妊娠中期的胎盤細(xì)胞表面。近幾年，Zeiler［16］，Nardo等［17］在研究中發(fā)現(xiàn)，牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中有整合素αv、β3的表達(dá)，子宮基質(zhì)成纖維細(xì)胞中有α6β1的表達(dá)，其中，整合素αv，β3在胚泡著床的整個時期都表達(dá)。這與我們的試驗結(jié)果相吻合。有趣的是，我們還發(fā)現(xiàn)，雖然前期報道指出整合素αv，β3屬于一個結(jié)合體，但胚胎體外（共培養(yǎng)）誘導(dǎo)試驗結(jié)果卻顯示：αv，β3亞基并沒有呈現(xiàn)出相同的變化規(guī)律，這可能提示子宮內(nèi)膜中起到附植關(guān)鍵作用的整合素受體類型，不止αv，β3一個，且在著床過程中，可能存在部分變構(gòu)的現(xiàn)象，即亞基與配體間的親和力發(fā)生了變化。另一方面，我們的實驗結(jié)果顯示：經(jīng)體外共培養(yǎng)誘導(dǎo)處理后，牛孵化胚胎組整合素表達(dá)的增幅遠(yuǎn)高于未孵化胚胎組。這與Robert等［18］的牛體內(nèi)胚胎相關(guān)實驗結(jié)果存在一定差異，他們首先在牛的桑葚胚及后期囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞中檢測到IFN-τ，它于妊娠的第6或7天，即囊胚腔出現(xiàn)擴(kuò)張時開始表達(dá)，此后，隨著囊胚的孵化，IFN-τ分泌量急劇上升，并于妊娠第14～16天達(dá)到高峰，并持續(xù)到第19～21天。2015年，Bao［19］團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)IFN-τ可上調(diào)鈣粘蛋白的表達(dá)，2016年2月，Keeley［16］團(tuán)隊再次證實鈣粘蛋白與整合素間有緊密的相互調(diào)節(jié)作用，而在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)：整合素明顯上升的趨勢是在孵化囊胚組，與其滋養(yǎng)層細(xì)胞自身IFN-τ大量分泌的時間相吻合。因此可以推測：整合素αv，β3的上調(diào)是由于IFN-τ在囊胚孵化前后的差異分泌所造成的，這也預(yù)示著αv，β3具有作為牛子宮容受態(tài)體外檢測標(biāo)志基因的潛力。

參考文獻(xiàn)

［1］ Achache H，Revel A.Endometrial receptivity markers，the journey to successful embryo implantation［J］.Hum Reprod Update，2006，12：731-746.

［2］ Spencer TE，Hayashi K，Hu J，et al.Comparative developmental biology of the mammalian uters.In：Schatten G（ed.）：Current Topics in Developmental Biology［M］.Burlington，MA：Elsevier，2005，68：85-122.

［3］ MacIntyre DM，Lim HC，Ryan K，et al.Implantation-associated changes in bovine uterine expression of integrins and extracellular matrix［J］.Biol Reprod，2002，66：1430-1436.

［4］ Bazer FW，Spencer TE，Johnson GA.Interferons and uterine receptivity［J］.Semin Report Med，2009，27（1）：90-102

［5］ Bartol FF，Wiley AA，F(xiàn)loyd JG，et al.Uterine differentiation as a foundation for subsequent fertility［J］.Repord Feritl Suppl，1999，54：287-302.

［6］ Chung TW，Park MJ，Kim HS，et al.Integrin αVβ3 and αVβ5 are required for leukemia inhibitory factor mediated the adhesion of trophoblast cells to the endometrial cells［J］.Biochem Biophys Res Commun.2016，469（4）：936-940.

［7］ Mui KL，Chen CS，Assoian RK.The mechanical regulation of integrin-cadherin crosstalk organizes cells，signaling and forces ［J］.J Cell Sci，2016，129：1093-1100.

［8］ 劉能輝.OPN和integrinβ3在圍植入期小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及其抗體對著床的影響［D］.中南大學(xué)，2008.

［9］ Fisher SJ，Damsky CH.Human cytotrophoblast invasion［J］. Semin Cell Biol，1993，4：183-188.

［10］ Sueoka K，Shiokawa S，Miyazaki T，et al.Integrins and reproductive physiology：expression and modulation in fertilization，embryogenesis，and implantation［J］.Fertil Steril，1997，67：799-811.

［11］ Johnson GA，F(xiàn)W Bazer，LA Jaeger，et al.Muc-1，integrin，and osteopontin expression during the implantation cascade in sheep ［J］.Biol Reprod，2001，6（5）：820-828.

［12］ Burghardt RC，Johnson GA，Jaeger LA，et al.Integrins and extracellular matrix proteins at the maternal-fetal interface in domestic animals［J］.Cells Tissues Organs，2007，172：202-217.

［13］ Hernandez-Nieto CA，Soto Cossio LE，Basurto Diaz D.Assisted hatching for improving embryo implantation［J］.Ginecol Obstet Mex，2015，83（4）：232-239.

［14］ Pfarrer C，Hirsch P，Guillomot M，et al.Interaction of integrin receptors with extracellular matrix is involved in trophoblast giant cell migration in bovine placentomes［J］.Placenta，2003；4：588-597.

［15］ MacLaren LA，Wildeman AG.Fibronectin receptors in preimplantation development：cloning，expression，and localization of the alpha5 and beta1 integrin subunits in bovine trophoblast［J］. Biol Reprod，1995，5（3）：153-165.

［16］ Zeiler M，Leiser R，Johnson GA，et al.Development of an in vitro model for bovine placentation：a comparison of the in vivo and in vitro expression of integrins and components of extracellular matrix in bovine placental cells［J］.Cells Tissues Organs，2007，186（4）：229-242.

［17］ Nardo LG，Bartoloni G，Di Memurio S，et al.Expression of αvβ3 and α4β1 integrins throughout the putative window of implantation in a cohort of healthy fertile women［J］.Acta Obstet Gynecol Scand，2002，81（8）：753-758.

［18］ Pfarrer CD.Characterization of the bovin placenta by cytoskeleton，integrin receptors，and extracellular matrix［J］.In：Michael J.Soares，Joan S.Hunt（Ed.）.Placenta and Trophoblast，Methods and Protocols Volume 1.Humana Press，Totowa New Jersey.2006，121：323-335.

［19］ Bao ZJ，Zhao S，Haq IU，et al.Recombinant bovine interferon -τ enhances in vitro development of bovine embryos by upregulating expression of connexin 43 and E-cadherin［J］.J Dairy Sci，2015，97：6917-6925.

【中圖分類號】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）03-0273-07

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.011

［基金項目］2013年度北京市教委北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)與教師職業(yè)發(fā)展計劃項目（No.PXM2013_014207_000067）；國家自然基金面上項目（No.31272526）。

［作者簡介］倪茜瞵（1990-），女，碩士生，研究方向：動物產(chǎn)科及胚胎工程。E-mail：niqianlin@sina.com

［通訊作者］郭勇，男，教授，研究方向：動物生殖生理與生物技術(shù)。E-mail：y63guo@126.com

Corresponding author：GUO Yong.E-mail：y63guo@126.com

［收稿日期］2016-02-29

Differential expression of integrin αv，β3 in bovine endometrial epithelial cells before and after co-culture with bovine blastocysts

NI Qian-lin，NI He-min，PAN Xing-qian，QI Xiao-long，SHENG Xi-hui，
XING Shu-han，LIU Yun-hai，GUO Yong*
（1.College of Animal Science and Technology；2.Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Veterinary Medicine，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China）

【Abstract】Objective To investigate the differential expression of integrin alpha v beta 3（αv，β3）on bovine endometrial epithelial cells before and after co-culture with bovine blastocysts，and to explore whether this specific signal might be applied as a new marker for identifying the bovine uterine receptivity.Methods The in vivo bovine embryos were cocultured with their endometrial epithelial cells for 24 h，then，RT-PCR was used to detect the differential expression of αv，β3 among those groups.Result The results showed that αv，β3 can be expressed on bovine endometrial epithelial cells both before and after co-culture with their in vivo embryos.There were no significant differences of expression of αv，β3 between Group I（only bovine blastocyst）and the control one（P＞0.05），but there were significant differences of αv，β3 among Group II（the hatched bovine blastocyst），and Group I，the control one（P＜0.05）.Conclusions The in vivo hatched bovine blastocysts are more suitable for induction of intergrin αv，β3 in bovine endometrial epithelial cells after their co-culture than that of co-cultured with early stage blastocyst.Integrin αv，β3 might be applied as a new molecular marker for detecting bovine uterine receptive status of the bovine endometrium.

【Key words】Bovine；In vivo hatched blastocyst；Co-culture；Endometrial epithelial cells；Integrin αv，β3 gene