小鼠異位肢體復(fù)合組織移植模型的建立

黃健兵，徐高俊，劉浩，梅舉，丁芳寶*

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院心胸外科，上海 200092）

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小鼠異位肢體復(fù)合組織移植模型的建立

黃健兵，徐高俊，劉浩，梅舉，丁芳寶*

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院心胸外科，上海 200092）

【摘要】目的 建立穩(wěn)定的小鼠異位肢體復(fù)合組織移植模型。方法 選用25對C57BL/6小鼠行同品系異位肢體復(fù)合組織移植手術(shù)。取供體小鼠后肢，于腹股溝韌帶下緣起沿股動脈、股靜脈向上游離，電凝切斷除股靜脈、股動脈外所有分枝血管至髂外動脈、髂外靜脈，斷髂外動脈、髂外靜脈后，橫斷股骨、股部肌肉。將供體髂外動脈、髂外靜脈分別與受體小鼠右側(cè)頸總動脈、頸外靜脈行端側(cè)吻合。連續(xù)縫合供體皮緣于受體皮膚切緣固定肢體。于供肢脛骨遠端關(guān)節(jié)處切斷，結(jié)扎殘端。結(jié)果 手術(shù)成功率76%，總手術(shù)時間（87.1±10.1）min，供體獲取時間（23.8±4.9）min，血管吻合時間（55.3±9.6）min。結(jié)論 小鼠異位肢體復(fù)合組織移植成功率較高，穩(wěn)定可靠，是一種新的研究移植免疫的理想的動物模型。

【關(guān)鍵詞】小鼠；肢體；復(fù)合組織；移植；動物模型

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動物器官移植模型成為從分子水平研究移植免疫的新手段。小鼠的基因型相對容易控制，各種純系小鼠的成功繁殖等有利因素，使小鼠模型在移植免疫方面占據(jù)不可替代的地位。隨著移植免疫研究的進展，復(fù)合組織移植模型的運用逐步受到重視，但目前國內(nèi)尚未有較成熟的復(fù)合組織移植的小鼠模型報道。因各型小鼠具有相似的解剖結(jié)構(gòu)，在模型的建立上操作相同，為避免不同基因小鼠間組織移植的免疫排斥影響，我們選擇基因型基本相同的近交系小鼠探索復(fù)合組織移植的可能性。筆者在參考國外文獻的基礎(chǔ)上，通過不斷的摸索與練習(xí)，成功建立了小鼠異位肢體復(fù)合組織移植模型，簡便易行，成功率高。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級雌性C57BL/6（H2b）小鼠50只，6～8周齡，體重16～22 g，購自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物科學(xué)部［SCXK（滬）2013-0021］，并在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院動物實驗室［SYXK（滬）2013-0106］完成實驗。50只小鼠隨機分25對作異位肢體移植。實驗過程按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷，并通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的動物實驗倫理審查（編號：XHEC-F-2016-004）。

1.2 手術(shù)器械及試劑

手術(shù)顯微鏡（上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠）；血管夾（Accurate Surgical&Scientific Instruments公司）；顯微持針器（Eriem Surgical公司）；顯微剪刀和鑷子（Fine Science Tools公司）；11/0帶針縫線（Crownjun）和4/0醫(yī)用絲線 （上海金環(huán)醫(yī)用縫線廠）；戊巴比妥鈉和肝素鈉（上海醫(yī)藥集團公司）。手術(shù)操作均在10～25倍顯微鏡下完成。

1.3 手術(shù)方法

1.3.1 供體手術(shù)

麻醉采用腹腔注射0.65%戊巴比妥鈉（0.01 mL/g）。剃除腹部、左后肢、左背部毛，小鼠取仰臥位固定四肢遠端，術(shù)野消毒。沿左腹股溝韌帶方向橫行切開左后肢皮膚，垂直此切口斜向上切開腹腔，充分顯露股動靜脈、髂動靜脈，自腹股溝韌帶水平起逐步向腹腔游離、電凝切斷除股靜脈、股動脈外所有分枝血管，股動脈向上游離范圍至髂外動脈下二分之一，股靜脈向上游離至腹股溝韌帶以上即可。游離完成后，用顯微血管夾阻斷腹主動脈，在血管夾下方用30G針頭斜行向下穿刺腹主動脈，灌注4℃肝素生理鹽水（10 U/mL）1 mL。于髂外動脈下二分之一處斷動脈，于腹股溝韌帶水平上方斷靜脈，獲取血管蒂。于股骨中段橫斷股骨，切斷股部肌肉、背側(cè)皮膚，獲取后肢放入4℃肝素生理鹽水（10 U/mL）中備用。

1.3.2 受體手術(shù)

小鼠腹腔注射0.65% 戊巴比妥鈉（0.01 mL/ g）麻醉后剃右側(cè)頸、胸部毛，取仰臥位固定，頭端朝向術(shù)者。術(shù)野消毒。作頸部偏右側(cè)豎切口切開皮膚，游離右側(cè)頸外靜脈、頸總動脈。先使用顯微彎血管夾側(cè)方阻斷頸外靜脈（圖1），切開后與供體髂靜脈行端側(cè)吻合，吻合方法為：將供肢放于術(shù)野右側(cè)，于吻合口上下兩端各縫一針打結(jié)牽引固定血管，以上端縫線連續(xù)縫合右側(cè)血管壁至下端后，繞過下端再連續(xù)向上縫合至上端與上端打結(jié)線，尾部打結(jié)完成靜脈吻合。取另一顯微彎血管夾側(cè)方阻斷頸總動脈（圖1），切開頸總動脈側(cè)壁，與供體髂動脈行端側(cè)吻合，吻合方法為：先于吻合口上端間斷縫合一針，打結(jié)固定后，向下連續(xù)縫合右側(cè)壁至下端后向上連續(xù)縫合左側(cè)壁至上端與線尾打結(jié)。吻合完成后先開放靜脈血管夾，后開放動脈血管夾，可見供體動脈搏動。將供肢皮緣與受體切口皮緣連續(xù)縫合固定供肢。于供肢脛骨遠端關(guān)節(jié)處切斷，結(jié)扎殘端，使殘端皮膚完全包埋骨性斷端。

1.4 術(shù)后處理

術(shù)后，將小鼠置于37℃暖箱內(nèi)復(fù)溫，自由活動后放回籠內(nèi)，正常進食水。每天觀察小鼠活動情況、移植肢體存活情況。

2 結(jié)果

供體手術(shù)時間為（23.8±4.9）min，動、靜脈吻合時間（55.3±9.6）min，總手術(shù)時間為（87.1± 10.1）min。術(shù)后所有受體小鼠存活良好，活動無影響。四個移植肢體術(shù)后第2天出現(xiàn)干結(jié)、脫水表現(xiàn)，至第5天供肢干結(jié)、壞死明顯，解剖提示動脈吻合口血栓形成。兩個小鼠供肢出現(xiàn)明顯腫脹，一周后出現(xiàn)壞死，解剖提示靜脈吻合口血栓形成，血液回流不暢。其余小鼠供肢成活良好，供肢皮膚有毛生長（見圖2）。術(shù)后3周移植肢體存活率76%。3周后取成活供肢作病理檢查（見圖3）證實肌肉存活良好。

圖1 阻斷血管方法示意圖Fig.1 Schematic diagram of the block method of the blood vessels

圖2 小鼠頸部肢體移植后3周Fig.2 Gross appearance of limb allograft transplantation in the neck at 3 weeks after the.operation.

3 討論

圖3 小鼠異位肢體移植后3周肌肉組織HE染色圖片（×100）Fig.3 Histological appeareance of the muscle tissue at 3 weeks after the limb allograft transplantation.（×100）

隨著機械化、工業(yè)化社會的形成，各種復(fù)合組織損傷時有發(fā)生，對復(fù)合組織的修復(fù)要求日趨受到重視，但復(fù)合組織移植的免疫排斥問題還需要更多的研究［1］。皮膚、肌肉甚至骨骼復(fù)合組織的移植免疫研究尚未廣泛開展，而缺乏穩(wěn)定的復(fù)合組織移植模型可能是限制其研究的原因之一。因此，穩(wěn)定的復(fù)合組織移植的動物模型的建立，對開展移植免疫研究至關(guān)重要。相對于大鼠及其他大動物而言，小鼠有其不可替代的優(yōu)點：人們對小鼠基因組特征的認識比大鼠及其他任何大動物都清楚，轉(zhuǎn)基因小鼠種系較純，已有大量的純種小鼠及單抗可用，而有些蛋白成分如酶或趨化因子只能通過特定細菌或細胞分泌產(chǎn)生，產(chǎn)量非常少，無法批量用于大動物甚至大鼠。但由于小鼠體積和重量小，手術(shù)操作難度大，常見的小鼠移植模型多限于相對較大血管吻合的模型，如心臟移植、腎移植、肝移植等［2-4］。1999年Zhang等［5］報道了原位小鼠肢體移植模型，但因為其較低的成功率，及受體小鼠創(chuàng)傷大、耐受性差限制了其發(fā)展。2001年Thomas等［6］報道了異位小鼠肢體移植模型，成功率有了明顯的提高，小鼠的耐受也有改善，但其移植供體組織為較小的肢體皮片、肌肉或部分骨性組織，難以完整體現(xiàn)復(fù)合組織移植免疫過程。同時由于肢體血管細小，手術(shù)難度大，成功率低等，限制了小鼠肢體移植模型的發(fā)展，此后國外相繼有少數(shù)幾個較大的研究中心報道了涉及小鼠肢體復(fù)合組織移植模型的研究［7-11］，而國內(nèi)尚未見相關(guān)報道。但國外已有的報道多使用較少的供體肢體組織，或行原位移植、腹部移植等，受體小鼠耐受較差，或受體小鼠易自行咬到供體組織影響實驗。我們在參考國外相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，通過摸索與練習(xí)，成功建立了異位小鼠肢體復(fù)合組織移植模型。本模型設(shè)計的優(yōu)點有：移植血管使用端側(cè)吻合方法，不阻斷受體小鼠原有的血供，避免對受體小鼠血流的影響。移植肢體位于受體小鼠頸部，不影響受體小鼠的正?；顒?，且無明顯疼痛刺激，受體小鼠耐受性好。同時受體小鼠無法咬到位于頸部的供體組織，可較好的保護移植物。

本模型建立的幾點體會：取供體時，關(guān)鍵需要保護供體血管無損傷，且要注意處理分支時可靠電凝，防止移植后分支血管出血。供體血管切斷的位置在腹股溝韌帶以上，其血管徑明顯較腹股溝韌帶下方股動脈、股靜脈粗，便于后期血管吻合。在吻合血管時，受體血管切口略大于供體血管開口徑。因靜脈壁很薄，有張力牽拉時很難分辯前后血管壁，在開始縫合時先在上下兩端各縫一針作牽引，縫合過程中血管端間斷沖生理鹽水使血管腔鼓起后便于分辯血管壁，連續(xù)縫合完打結(jié)前，輕拉吻合口，使吻合口充分展開，縫線自然舒展，打結(jié)時線結(jié)靠上即可，防止用力拉線導(dǎo)致吻合口狹窄。動脈吻合時，注意修剪干凈吻合口附近血管外膜，縫合時防止外膜組織入吻合口，導(dǎo)致術(shù)后血栓形成，縫合完打結(jié)時勿過于用力致吻合口狹窄。

縫合完供體皮膚后，于供肢脛骨遠端關(guān)節(jié)處切斷，如果血管吻合良好，可見殘端出血。結(jié)扎殘端時，注意使皮膚完整包埋骨性斷端，否則后期脛骨由殘端穿出，致局部組織環(huán)死。切除供體遠端肢體可較好的減少對受體小鼠活動的影響，同時不影響供肢復(fù)合組織的免疫學(xué)研究。

總之，小鼠異位肢體復(fù)合組織移植模型有一定的技術(shù)難度，對實驗室條件、實驗者顯微外科技術(shù)要求較高，但通過適當?shù)木毩?xí)，可以建立穩(wěn)定的復(fù)合組織移植模型，有助于對移植免疫機制進行更深的研究。

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【中圖分類號】Q95-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）03-0258-04

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.008

Corresponding author：DING Fang-bao，Email：40821247@qq.com

［基金項目］上海市科委科技項目（15411952600）。

［作者簡介］黃健兵（1979-），男，博士研究生，主治醫(yī)師，專業(yè)：心胸外科。Email：jb4480@163.com

［通訊作者］丁芳寶（1969-），男，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，專業(yè)：心胸外科。Email：40821247@qq.com

［收稿日期］2015-10-27

Establishment of a mouse model of limb heterotopic composite tissue allograft transplantation

HUANG Jian-bing，XU Gao-jun，LIU Hao，MEI Ju，DING Fang-bao*
（Department of Cardiothoracic Surgery，Xinhua Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200092，China）

【Abstract】Objective To establish a stable mouse model of limb heterotopic composite tissue allograft transplantation.Methods 25 pairs of C57BL/6 mice were used for this limb heterotopic allograft transplantation experiment.The hind legs were taken from the donor mice.A transverse incision was made at the level of inguinal ligament to expose and mobilize the femoral vessels up to the external iliac vessels.All branches to the external iliac artery and vein were cut off by electrocoagulation.To cut off the external iliac artery and external iliac vein，and to transect the femur，thigh muscles and skin.The donor external iliac artery-external iliac vein anastomosis was performed in end-to-side fashion with recipient mice’s right common carotid artery and jugular vein，respectively.Continuously suture the donor skin to the recipient skin incisal margin to fix the limb.Cut off the donor limb’s distal tibial joint，and ligate the stump.Results The success rate of the heterotopic limb transplantation operation was 76%.The total operation time was 87.1±10.1 minutes，and the vessel anastomosis time was 55.3±9.6 minutes.Conclusions This mouse model of limb heterotopic limbcomposite tissue allograft transplantation shows a high success rate of the surgical operation，and is stable and reliable.It is a new ideal model for studies on transplantation immunology.

【Key words】Mice；Limb；Composite tissue；Transplantation；Animal model