慢性皮質(zhì)酮處理對小鼠學(xué)習(xí)記憶和突觸相關(guān)蛋白的影響

孫秀萍，楊久山2，張楠，宋銘晶，秦川*

（1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類動物模型三級實驗室，北京 100021；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250014）

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慢性皮質(zhì)酮處理對小鼠學(xué)習(xí)記憶和突觸相關(guān)蛋白的影響

孫秀萍1，楊久山2，張楠1，宋銘晶1，秦川1*

（1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類動物模型三級實驗室，北京 100021；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250014）

【摘要】目的 建立飲入方式，慢性給予皮質(zhì)酮，觀察皮質(zhì)酮對學(xué)習(xí)記憶和突觸相關(guān)蛋白的影響。方法c57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為正常組和皮質(zhì)酮組，每組10只。皮質(zhì)酮組飲用含皮質(zhì)酮的0.45%羥丙基-β-環(huán)糊精溶液，5 mg/（kg·d）。正常組動物給予0.45%羥丙基-β-環(huán)糊精溶液。造模35 d后，進(jìn)行社會識別實驗和水迷宮實驗。行為學(xué)實驗結(jié)束后，動物斷頭取海馬，應(yīng)用western blot進(jìn)行突觸相關(guān)蛋白測定。結(jié)果 社會識別實驗顯示，正常組和皮質(zhì)酮組對刺激鼠籠的嗅聞時間均比空鼠籠長（P＜0.05）。對照組對刺激鼠2的嗅聞時間比刺激鼠1長（P＜0.05）。皮質(zhì)酮組對刺激鼠2的嗅聞時間與對刺激鼠1的嗅聞時間差異無顯著性。水迷宮實驗定位航行結(jié)果顯示，皮質(zhì)酮組學(xué)習(xí)能力下降，尋臺潛伏期延長（P＜0.05）。空間探索結(jié)果顯示，皮質(zhì)酮組穿臺次數(shù)、進(jìn)入實臺象限的次數(shù)和實臺象限路程均明顯減少（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示，皮質(zhì)酮組突觸后致密物質(zhì)（postsynaptic density，PSD-95）、突觸素（synapsin-1，Syn-1）和磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）表達(dá)明顯下降（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)論 通過飲入方式，慢性給予皮質(zhì)酮，動物出現(xiàn)社會記憶和空間學(xué)習(xí)記憶障礙，可能與海馬突觸相關(guān)蛋白表達(dá)下降，突觸功能受損有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】皮質(zhì)酮；學(xué)習(xí)記憶；突觸蛋白；小鼠

研究表明，慢性應(yīng)激影響人的學(xué)習(xí)記憶功能［1］。長期應(yīng)激引起下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA）負(fù)反饋失調(diào)，促使體內(nèi)糖皮質(zhì)激素釋放。糖皮質(zhì)激素受體在海馬高密度表達(dá)［2］。長期、高水平的糖皮質(zhì)激素激活海馬糖皮質(zhì)激素受體，通過一系列神經(jīng)生化機(jī)制，導(dǎo)致海馬受損，出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶障礙。物理應(yīng)激方式如束縛、強(qiáng)迫游泳等被廣泛應(yīng)用于慢性應(yīng)激致學(xué)習(xí)記憶障礙的研究。但物理應(yīng)激容易引起動物的適應(yīng)性，表現(xiàn)為糖皮質(zhì)激素在應(yīng)激初期升高，而中后期趨于降低的趨勢，從而不能恰當(dāng)反應(yīng)應(yīng)激因素對學(xué)習(xí)記憶的影響［3］。嚙齒類動物的糖皮質(zhì)激素稱為皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）。通過皮下注射、飲入皮質(zhì)酮等人為方式，增加動物體內(nèi)的皮質(zhì)酮水平，可以模擬應(yīng)激引起海馬功能和結(jié)構(gòu)受損，用于應(yīng)激致學(xué)習(xí)記憶障礙的研究［4］。該模型操作簡單，并且避免了物理應(yīng)激的適應(yīng)性現(xiàn)象。近年來，神經(jīng)突觸功能失調(diào)和結(jié)構(gòu)受損成為學(xué)習(xí)記憶障礙病理基礎(chǔ)的研究熱點［5］。分子生物學(xué)的研究揭示學(xué)習(xí)記憶障礙與突觸相關(guān)蛋白表達(dá)紊亂有關(guān)。本研究通過飲入方式，給予小鼠皮質(zhì)酮，觀察皮質(zhì)酮對小鼠學(xué)習(xí)記憶行為及海馬突觸相關(guān)蛋白的影響。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF級C57BL/6J雄性小鼠，20只，2月齡，體重22～25 g。由北京華阜康生物科技股份有限公司提供【SCXK（京）2014-0004】。動物自由進(jìn)食進(jìn)水，室內(nèi)溫度：23～25℃，相對濕度：（55±10）%。維持12 h光照/12 h黑暗的晝夜節(jié)律。動物適應(yīng)環(huán)境一周進(jìn)行實驗。

1.2 儀器

動物行為學(xué)視頻跟蹤系統(tǒng)（Noldus Information Technology，EthoVision XT，The Netherlands））

1.3 藥物

皮質(zhì)酮（Sigma，27840），羥丙基-β-環(huán)糊精溶液（山東濱州智源生物科技有限公司）。

1.4 實驗方法

動物隨機(jī)分為正常組和皮質(zhì)酮組，每組10只，5 只/籠。皮質(zhì)酮組參照文獻(xiàn)［6］，將皮質(zhì)酮溶于0.45%羥丙基-β-環(huán)糊精溶液中，每日35 μg/mL（相當(dāng)于5 mg/kg），避光，動物在造模和行為學(xué)檢測期間連續(xù)飲用。正常組動物給予0.45%羥丙基-β-環(huán)糊精溶液。造模35 d后，進(jìn)行社會識別實驗和水迷宮實驗。行為學(xué)實驗結(jié)束后，每組取3只動物，斷頭取海馬，應(yīng)用western blot進(jìn)行突觸相關(guān)蛋白測定。

1.4.1 社會識別實驗

動物在測試房間適應(yīng)1 h后，進(jìn)行社會識別實驗。實驗在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物所進(jìn)行【SYXK（京）2014-0029】。分為適應(yīng)階段、社交實驗階段和社會新奇實驗階段。根據(jù)文獻(xiàn)［6］，首先將動物置于50 cm ×50 cm ×50 cm的方形敞箱中，自由適應(yīng)5 min。社交實驗階段，在敞箱的一個角落放置一空鼠籠，其對角角落放置一相同鼠籠，鼠籠內(nèi)放置一只刺激鼠1（stranger 1）。將實驗鼠放入敞箱，應(yīng)用EthoVision XT行為軌跡跟蹤系統(tǒng)，記錄10 min內(nèi)實驗鼠接觸空鼠籠和刺激鼠籠的時間。實驗結(jié)束，將實驗鼠取出。社會新奇實驗：在空鼠籠放入另外一只新的刺激鼠2（stranger 2），重新放入實驗鼠，記錄10 min內(nèi)實驗鼠接觸刺激鼠1和刺激鼠2的時間。鼠籠上有圓孔，實驗鼠和刺激鼠可以通過嗅覺接觸。接觸行為表現(xiàn)為主動嗅聞（sniffing），定義為實驗鼠的鼻尖距離鼠籠2 cm以內(nèi)范圍。實驗結(jié)束，將實驗鼠取出，歸籠。

1.4.2 水迷宮實驗

水迷宮實驗裝置為一個圓形不銹鋼水池，直徑為100 cm，高50 cm，將水池等分為4個象限，平臺象限的中央放置直徑為9 cm，高27 cm的圓形平臺，整個實驗期間其位置保持不變。水中加入奶粉，水溫25℃。動物在測試房間適應(yīng)1 h后，進(jìn)行水迷宮實驗。根據(jù)文獻(xiàn)［7］，水迷宮實驗過程分為可視平臺實驗、定位航行（隱藏平臺）實驗和空間探索實驗三個階段。第1天，進(jìn)行可視平臺實驗，平臺露出水面1 cm，每只動物從三個象限（平臺象限除外），面壁放入水中，游泳1 min。定位航行實驗：第2～5天進(jìn)行定位航行實驗。平臺位于水面以下約1 cm。動物從三個象限（平臺象限除外）入水，共游泳3次。每次1 min。動物找到平臺并停留5 s，或測試時間到，實驗自動停止。不論動物是否找到平臺，一次游泳結(jié)束，均將動物引導(dǎo)至平臺，停留10 s?？臻g探索實驗：定位航行實驗結(jié)束24 h后，撤除平臺。將動物從對角象限（與實臺象限相對應(yīng)的象限）放入水中，觀察1 min內(nèi)動物在實臺象限的停留時間、穿臺次數(shù)、游泳路程等。

1.4.3 突觸相關(guān)蛋白測定

應(yīng)用western blot方法，每10 mg組織加100 μL預(yù)冷的裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min，4℃離心，20 min。取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜（300 mA，2 h）。5%小牛血清封閉1 h。一抗孵育過夜，加入 HRP標(biāo)記的二抗。GADPH稀釋濃度為1∶1000。ECL試劑盒顯色。應(yīng)用 Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。采用單樣本K-S檢驗進(jìn)行正態(tài)分布檢驗，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用獨立樣本T檢。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)酮模型對社會識別實驗的影響

如圖1A所示，社交實驗中，正常組和皮質(zhì)酮組對刺激鼠籠的嗅聞時間均比空鼠籠長，并具有顯著性差異（P＜0.05）。如圖1B所示，社會新奇實驗中，對照組對刺激鼠2的嗅聞時間長，與刺激鼠1相比，差異具有顯著性。皮質(zhì)酮組對刺激鼠2的嗅聞時間與對刺激鼠1的嗅聞時間差異無顯著性。

注：與正常組比較，*P＜0.05。a.正常組；b.模型組。圖1 皮質(zhì)酮模型對社會識別實驗的影響Note.Compared with the control group，*P＜0.05。a.Control group；b.CORT group.Fig.1 Effect of corticosterone on social discrimination in the mice

2.2 皮質(zhì)酮模型對水迷宮實驗的影響

定位航行實驗結(jié)果（圖2A）顯示，隨著訓(xùn)練時間的延長，正常組和皮質(zhì)酮組尋臺潛伏期均逐漸縮短，正常組縮短更明顯，至第4天時，皮質(zhì)酮組學(xué)習(xí)能力進(jìn)一步下降，尋臺潛伏期延長，與對照組相比，差異有顯著性（P＜0.05）。空間探索實驗結(jié)果（圖2B、C、D）所示，皮質(zhì)酮組穿臺次數(shù)明顯下降，與正常組比較，差異具有顯著性（P＜0.05）。同時，進(jìn)入實臺象限的次數(shù)和在實臺象限的路程均明顯減少，與正常組比較，差異具有顯著性（P＜0.05，P＜0.05）。

2.3 皮質(zhì)酮模型對突觸素及PSD95蛋白表達(dá)影響

如圖3所示，皮質(zhì)酮組PSD95、Syn-1蛋白和p-ERK表達(dá)明顯下降，與正常組比較，差異具有顯著性（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）。

3 討論

慢性給予動物皮質(zhì)酮，既模擬物理應(yīng)激引起的HPA軸負(fù)反饋失調(diào)等病理過程，又避免了物理應(yīng)激引起的適應(yīng)性現(xiàn)象，是近年來研究應(yīng)激所致神經(jīng)精神障礙的常用模型。本研究將皮質(zhì)酮溶于羥丙基-β-環(huán)糊精溶液，增加皮質(zhì)酮的溶解度。通過飲入方式造模，與皮下注射方式比較，操作簡單，同時避免了皮下注射導(dǎo)致局部皮膚潰爛等現(xiàn)象。與皮下注射可精確控制每只動物皮質(zhì)酮用量不同，本研究基于動物飲水狀況正常，皮質(zhì)酮應(yīng)用劑量為每日35 μg/ mL，折合動物的攝入量約為每日5 mg/kg。

注：與正常組比較，*P＜0.05。a.正常組；b.模型組。圖2 皮質(zhì)酮模型對水迷宮實驗的影響Note.Compared with the control group，*P＜0.05。a.Control group；b.CORT group.Fig.2 Effect of corticosterone on the Morris water maze test of the mice

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。a.正常組；b.模型組。圖3 皮質(zhì)酮模型對突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（mean±SEM，*P＜0.05，**P＜0.01，與正常組比較）Note.Compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01.a.Control group；b.CORT group.Fig.3 Effect of corticosterone on the expression of synapse-related proteins.（mean±SEM，*P＜0.05，**P＜0.01，compared with the control group）

社會識別實驗分為適應(yīng)、社交實驗（sociability test）和社會新奇實驗（social novelty test）三個階段，主要用于動物社會記憶（social memory）的檢測［8］。該實驗基于動物的社交能力，因此，動物適應(yīng)實驗環(huán)境后，進(jìn)行社交實驗。正常動物可以區(qū)分空籠和刺激鼠籠（社會刺激，stranger 1），對刺激鼠籠探索更多。本研究結(jié)果表明，正常組和皮質(zhì)酮組均可以區(qū)分空籠和刺激鼠籠，表現(xiàn)為對刺激鼠籠嗅聞時間更長，提示皮質(zhì)酮并未損傷小鼠的社交能力。社會新奇實驗階段，將另外一只動物（stranger 2）放入空鼠籠。正常動物可以區(qū)分stranger 1和stranger 2，而對新的刺激鼠（stranger 2）探索更多，提示動物具有完善的社會記憶功能。皮質(zhì)酮是否損害動物的社會記憶功能，目前尚未見報道。本研究表明，正常組動物對stranger 2嗅聞時間更長，表現(xiàn)出完善的社會記憶功能，而皮質(zhì)酮組對stranger 1和stranger 2的嗅聞時間沒有明顯差異，提示皮質(zhì)酮可能損傷了動物的社會記憶功能。水迷宮實驗主要用于考察動物海馬依賴的空間學(xué)習(xí)記憶能力［9］。本研究可視平臺實驗顯示，正常組和皮質(zhì)酮組尋臺潛伏期和到達(dá)平臺的路程無顯著性差異（數(shù)據(jù)未公示），提示兩組動物尋找平臺動機(jī)相同。定位航行階段，皮質(zhì)酮組尋臺潛伏期比正常組長，并在第四天時出現(xiàn)顯著性差異，提示皮質(zhì)酮損傷了動物的學(xué)習(xí)能力?？臻g探索實驗結(jié)果顯示，皮質(zhì)酮組穿臺次數(shù)明顯降低，在實臺象限的路程和進(jìn)入實臺象限的次數(shù)少于正常組，提示皮質(zhì)酮損傷了動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致［4］。

突觸是腦內(nèi)神經(jīng)信息傳遞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，與學(xué)習(xí)記憶等過程緊密相關(guān)［10］。在應(yīng)激條件下，皮質(zhì)酮水平升高，可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，突觸密度減少，樹突棘和樹突分支減少，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙［11］。突觸前和突觸后的特異性蛋白如突觸素、突觸后致密物質(zhì)（postsynaptic density，PSD-95）等的表達(dá)水平可反應(yīng)突觸的狀態(tài)，已成為研究海馬突觸可塑性的標(biāo)志性蛋白［12］。本研究表明，皮質(zhì)酮組突觸素和PSD-95表達(dá)顯著降低，提示在皮質(zhì)酮的作用下，海馬突觸功能下降，可能是其學(xué)習(xí)記憶功能障礙的病理基礎(chǔ)之一。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是絲裂素活化蛋白激酶家族的重要成員，調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性，與學(xué)習(xí)記憶過程密切相關(guān)。本研究表明，皮質(zhì)酮組磷酸化ERK水平顯著降低，提示皮質(zhì)酮所致學(xué)習(xí)記憶障礙可能與ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化受到抑制，海馬突觸受損有關(guān)。

通過飲入方式，慢性給予皮質(zhì)酮，動物表現(xiàn)為社會記憶和空間學(xué)習(xí)記憶障礙，其病理基礎(chǔ)可能與ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化受到抑制，突觸素和PSD-95表達(dá)水平降低，海馬突觸結(jié)構(gòu)和功能受損有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

［1］ 李亞，孔宏，宋倩，等.慢性應(yīng)激對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶及海馬和前腦皮層突觸體膜流動性的影響 ［J］.心理學(xué)報. 2010，35（2）：235-240.

［2］ 馬強(qiáng)，王福莊，趙彤，等.皮質(zhì)酮對大鼠海馬腦片ca1區(qū)長時程增強(qiáng)效應(yīng)的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志.2003，19 （1）：97-98.

［3］ Naert G，Ixart G，Maurice T，et al.Brain-derived neurotrophic factor and hypothalamic-pituitary-adrenal axis adaptation processes in a depressive-like state induced by chronic restraint stress ［J］.Mol Cell Neurosci.2011，46（1）：55-66.

［4］ Darcet F，Mendez-David I，Tritschler L，et al.Learning and memory impairments in a neuroendocrine mouse model of anxiety/ depression［J］.Front Behav Neurosci.2014，8（136）：1-13.

［5］ 陳偉恒，陶長路，時美玉，等.突觸可塑性與腦疾病的神經(jīng)發(fā)育基礎(chǔ)［J］.生命科學(xué).2014，26（6）：583-592.

［6］ Ter Horst J P，van der Mark M，Kentrop J，et al.Deletion of the forebrain mineralocorticoid receptor impairs social discrimination and decision-making in male，but not in female mice［J］.Front Behav Neurosci.2014，8（26）：1-11.

［7］ Cuadrado-Tejedor Mar，Ricobaraza A，Del Río J，et al.Chronic mild stress in mice promotes cognitive impairment and Cdk5-dependent tau hyperphosphorylation［J］.Behav Brain Res.2011，220（2）：338-343.

［8］ Faizi M，Bader PL，Saw N，et al.Thy1-Happ（Lond/Swe+）mouse model of Alzheimer’s disease displays broad behavioral deficits in sensorimotor，cognitive and social function［J］.Brain Behav.2012，2（2）：142-154.

［9］ Bromley-Brits K，Deng Y，Song WH，et al.Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer disease model mice［J］.J Vis Exp，2011，（53）：e2920.

［10］ 李瑩超.應(yīng)激影響海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶的分子機(jī)制研究［D］.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2014.

［11］ 陳琳，杜力軍，趙玉男.糖皮質(zhì)激素與海馬結(jié)構(gòu)可塑性［J］.神經(jīng)藥理學(xué)報.2011，1（2）：58-64.

［12］ 洪樂鵬，龍大宏，冷小龍.癡呆模型鼠海馬突觸素改變及其與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系［J］.廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報.2003，31（4）：43 -46.

【中圖分類號】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）03-0253-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.007

［基金項目］北京市自然科學(xué)基金資助項目（資助編號：7142105）；國家自然科學(xué)基金（資助編號：31301890）。

［作者簡介］孫秀萍（1974-），女，助理研究員，博士，研究方向：神經(jīng)精神疾病藥理及方法學(xué)

［通訊作者］秦川，博士生導(dǎo)師，E-mail：qinchuan@pumc.edu.cngroup increased the time spent with an unfamiliar mouse（stranger 2 cage）.The mice of CORT group were not able to discriminate between an unfamiliar（stranger 2）and the familiar mouse（stranger 1）.In the Morris water maze test，in contrast to the first 3 days，an increase in latency to reach the hidden platform（P＜0.05）was observed on day 4 in the CORT group compared with the mice of control group.CORT-treated mice showed a statistically significant decrease in the frequency in the platform，frequency in the target quadrant and distance in the target quadrant（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05）compared with the control group.The western blot analysis showed a notably decreased expression of PSD95，Syn-1 and p-erk in hippocampus in the mice of CORT group compared with the control group.Conclusions Chronic administration of corticosterone induces learning and memory impairment and decreases the expression of synapse-related proteins.

Corresponding author：QIN Chuan，Email：qinchuan@pumc.edu.cn

［收稿日期］2015-10-15

Effect of chronic corticosterone administration on the learning and memory and expression of synapse-related proteins in mice

SUN Xiu-ping1，YANG Jiu-shan2，ZHANG Nan1，SONG Ming-jing1，QIN Chuan1*
（1.Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College，and Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences；Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health；Key Laboratory of Human Disease Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine. Beijing 100021，China；2.Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014）

【Abstract】Objective To investigate the effect of chronic corticosterone administration on learning and memory and expression of synapse-related proteins in mice.Methods C57BL/6J mice were randomly divided into control and corticosterone（CORT）groups（10 mice per group）.CORT was dissolved in the vehicle（0.45%hydroxypropy-β-cyclodextrin，β-CD）.Corticosterone（5 mg/kg/day）was orally administered in drinking water for 35 days.The control mice received vehicle（β-CD）in drinking water during the entire experiment.Social discrimination test and Morris water test were applied to evaluate the learning and memory impairment of the model mice.Results Both the mice of control and CORT groups were more interested in social（stranger cage）than the non-social（empty cage）experience.The control

【Key words】Corticosterone；Learning；Memory；Synapse-related protein；Mice