裸小鼠肝癌原位移植模型的建立

田樹紅，王日超，邢桂蘭，肖敏，符健*

（海南醫(yī)學(xué)院海南省藥物安全性評價研究中心，?？?571199）

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裸小鼠肝癌原位移植模型的建立

田樹紅，王日超，邢桂蘭，肖敏，符健*

（海南醫(yī)學(xué)院海南省藥物安全性評價研究中心，?？?571199）

【摘要】目的 建立一種BALB/c裸小鼠肝癌原位移植模型。方法 采用異氟烷氣化對實驗動物進行全身麻醉，分別用“包埋法”和“夾心法”建立BALB/c裸小鼠肝癌原位移植瘤模型。手術(shù)后用小動物活體成像系統(tǒng)對腫瘤組織的生長情況進行檢測，4周后對肝及腫瘤組織進行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果 采用夾心法建立的肝癌原位移植BALB/c裸小鼠模型，具有操作時間短，難度低，成瘤率高的特點，腫瘤組織生長良好，在腹腔內(nèi)未出現(xiàn)腫瘤廣泛種植現(xiàn)象，組織病理學(xué)檢查無異常，動物死亡率低等特點。結(jié)論 與包埋法相比，夾心法更具優(yōu)勢，可快速制備大批量小鼠肝癌原位移植模型，為肝癌原位藥效學(xué)及其他研究提供更便利的平臺。

【關(guān)鍵詞】BALB/c裸鼠；肝癌；原位移植；小動物活體成像系統(tǒng)

2015年2月3日，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）發(fā)表了《全球癌癥報告2014》，研究稱2012年全球癌癥患者和死亡病例都在急劇增加，新增癌癥病例有近50%出現(xiàn)在亞洲，而中國占了其中的大部分?！皣H癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）”報告

肝癌具有惡性程度高、治療復(fù)雜和生存時間短等特點，是目前臨床上最常見的惡性腫瘤之一，目前，常見的肝癌移植模型按接種部位分主要有皮下移植和原位移植，按接種類型又可分為細(xì)胞混懸液法和腫瘤組織塊法［2］。常見的腫瘤組織塊原位移植模型的建立方法（包埋法）是用套管針在動物肝臟扎入約2～3 mm深，塞入腫瘤組織塊（約1～2 mm3），無菌干棉簽按壓止血或用醫(yī)用止血貼止血，逐層縫合皮膚［3-4］。但由于動物肝臟比較脆弱，操作過程中容易造成肝臟大量出血，操作時間較長，在大批量建立該模型時需要耗費大量的時間和精力。因此，本研究建立了一種新的BALB/c裸小鼠肝癌原位移植模型，即夾心法。該方法具有操作簡單、手術(shù)時間短、成瘤率高、腫瘤組織生長良好和動物死亡率低等特點。此外，在動物腹腔內(nèi)未出現(xiàn)腫瘤廣泛種植現(xiàn)象，組織病理學(xué)檢查無異常。能為大批量制備肝癌原位模型節(jié)約大量時間，為肝癌原位藥效學(xué)及其他研究提供更便利和有效的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與實驗分組

SPF級BALB/c裸小鼠，6～8周齡，雄性，體重18～22 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心【SCXK（粵）2013-0002】。實驗地點為海南省藥物安全性評價研究中心【SYXK（瓊）2012-0013】。皮下移植模型使用了4只裸小鼠，30只裸小鼠用于肝癌原位移植模型的建立，分為包埋法和夾心法模型組，每組15只。

1.2 腫瘤細(xì)胞株、實驗器材、試劑及主要儀器

生物發(fā)光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞Bel-7402購自上海樂晨生物科技有限公司。手術(shù)器械：手術(shù)剪，彎鑷，直鑷，持針鉗，縫合針（4×10），0#縫合線；試劑：異氟烷購自RWD，瑞沃德公司，D-熒光素鉀鹽購自Synchem公司，PBS緩沖液、RPMI 1640培養(yǎng)液和胰酶消化液購自Gibco公司，胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；主要儀器：IVIS Kinetic小動物活體成像系統(tǒng)購于美國Caliper精諾真公司；VIP 3000型氣體麻醉系統(tǒng)購于Matrx公司；BX41顯微鏡系統(tǒng)購于奧林巴斯公司。

1.3 術(shù)前麻醉

在建立肝癌原位移植模型時需要使用氣體麻醉系統(tǒng)［5］將裸小鼠進行術(shù)前麻醉，麻醉劑為異氟烷。該麻醉系統(tǒng)是用具有一定氣壓的純氧氣帶動異氟烷，形成氣化的異氟烷和氧氣的混合氣體。將裸小鼠放入一個相對密閉的透明有機材料制作的盒子內(nèi)，然后持續(xù)通入該混合氣體。

1.4 肝癌皮下移植模型的建立

將體外培養(yǎng)好的肝癌細(xì)胞Bel-7402用無菌PBS緩沖液沖洗2次，再用無菌PBS緩沖液制備成濃度為107個細(xì)胞/mL的細(xì)胞混懸液。取0.2 mL該細(xì)胞混懸液，接種于4只裸小鼠右側(cè)腋窩皮下，待成瘤后備用。

1.5 肝癌原位移植模型的建立

建立肝癌原位模型時，將動物分為包埋法組和夾心法組，每組各15只。其主要操作步驟如下：取生長良好的皮下移植瘤，用眼科剪剪成大小約為2 mm ×2 mm ×1 mm的腫瘤組織塊備用。實驗采用Matrx VIP 3000型氣體麻醉系統(tǒng)對實驗動物進行氣體麻醉，麻醉劑為異氟烷。該麻醉系統(tǒng)有1根通向小動物活體成像系統(tǒng)的管路，以確保動物在活體成像儀內(nèi)進行發(fā)光檢測時能持續(xù)麻醉。將此管路改造成一個獨立的麻醉裝置，用于動物手術(shù)時的持續(xù)麻醉。動物麻醉后，取仰臥位，用組織剪逐層剪開皮膚，開口長度約為1 cm，暴露出肝臟。包埋方法是在肝左葉中間部位輕輕戳一個約3 mm深度的隧道，用無菌棉簽局部輕壓止血，將準(zhǔn)備好的人癌組織小心塞入，再用棉簽輕壓止血，亦可用生物膠（OB膠）粘合傷口［6-9］；夾心法是用0#手術(shù)線將腫瘤組織塊直接縫在肝右葉內(nèi)側(cè)：先用帶縫合線的縫合針（4 ×10）穿過腫瘤組織，再從肝右葉內(nèi)側(cè)穿至外側(cè)，然后打一個手術(shù)結(jié)，輕輕拉緊，剪斷手術(shù)線即可。這樣腫瘤組織剛好可以夾在肝右葉和肝左葉之間，不會與其他組織黏連，最后逐層縫合好腹腔，創(chuàng)口消毒，小心飼養(yǎng)。

1.6 BALB/c裸小鼠肝癌原位移植腫瘤生長情況的檢測

目前，小動物原位移植癌在體檢測方法是先將腫瘤細(xì)胞進行熒光標(biāo)記或生物發(fā)光標(biāo)記，再把標(biāo)記好的腫瘤細(xì)胞移植到動物體內(nèi)，然后通過小動物活體成像系統(tǒng)進行在體檢測［10-12］。本研究是將生物發(fā)光標(biāo)記好的肝癌細(xì)胞Bel-7402制備成細(xì)胞混懸液，接種到BALB/c裸小鼠皮下，待成瘤后挑選生長良好的實體瘤，制備成腫瘤組織塊原位接種于動物肝臟部位，檢測時腹腔注射30 mg/mL的底物D-熒光素鉀鹽，注射體積為0.1 mL/10 g體重，5～10 min后用小動物活體成像系統(tǒng)進行生物發(fā)光檢測。

1.7 BALB/c裸小鼠肝癌原位移植腫瘤組織病理檢查

小鼠肝癌原位移植4周時，頸椎脫臼處死，取腫瘤組織，4%（mL/mL）甲醛溶液固定，修塊、脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色，鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的生長情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，計算結(jié)果用（±s）形式表示，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BALB/c裸小鼠肝癌原位移植模型的建立

在采用包埋法和夾心法制備肝癌原位移植模型時，對兩者所需的手術(shù)時間、死亡動物數(shù)和腫瘤脫落數(shù)進行了比較，包埋法完成1只動物的手術(shù)時間為8～10 min，夾心法則只需要4～5 min，在時間上比前者縮短了近1倍。這主要是因為包埋法需要在肝臟上開一個小洞，在整個操作過程中容易造成動物肝臟大量失血，止血時間過長，而且操作不便。夾心法只需將腫瘤組織塊小心縫掛在肝右葉內(nèi)側(cè)即可，基本上不用止血。在實驗過程中，包埋法由于動物失血過多而死亡2只，腫瘤脫落到腹腔2只，手術(shù)時間為（9.3±1.4）min，而夾心法接種動物均存活且未出現(xiàn)腫瘤組織塊脫落。此外，夾心法手術(shù)時間為（4.6±0.7）min，與包埋法比較差異有顯著性（P＜0.01）。

2.2 小動物活體成像系統(tǒng)檢測小鼠肝癌原位移植腫瘤生長情況

建立小鼠肝癌原位移植模型后，用小動物活體成像系統(tǒng)對動物體內(nèi)腫瘤生長情況進行實時監(jiān)控。圖1中A和C為模型建立4周時的腫瘤在體生物發(fā)光檢測，只有活的腫瘤細(xì)胞才能被檢測到。圖1 中B和D為動物肝臟及實體瘤。結(jié)果表明，用新方法建立的BALB/c裸小鼠肝癌原位移植模型與常用的方法比較，腫瘤生長良好，無明顯差異，成瘤率均為100%，且均未形成腫瘤在腹腔內(nèi)廣泛種植的現(xiàn)象。

2.3 常用方法和新方法建立小鼠肝癌原位移植瘤病理檢查

BX41顯微鏡系統(tǒng)100倍光鏡下觀察腫瘤組織標(biāo)本，結(jié)果表明，包埋法和夾心法建立的小鼠肝癌原位移植瘤腫瘤細(xì)胞及組織生長良好，未出現(xiàn)壞死，細(xì)胞形態(tài)一致，癌細(xì)胞成癌巢狀分布，癌巢周圍為纖維結(jié)締組織（圖2）。

注：A和C分別為包埋法和夾心法建立BALB/c裸小鼠肝癌原位移植模型的小動物活體成像檢測圖，右邊的顏色棒說明不同顏色代表不同數(shù)量的腫瘤細(xì)胞，從下到上表示腫瘤細(xì)胞的數(shù)量越來越多；B和D分別為包埋法和夾心法建立的BALB/c裸小鼠肝癌原位移植實體瘤。圖1 荷瘤裸小鼠的生物發(fā)光檢測和實體瘤Note.A and C：The orthotopic transplantation tumor models were established by embedding and sandwich，respectively.The color bar at right shows numbers of tumor cells by different colors representing the increasing numbers of tumor cells from bottom to top.B and D：The solid tumor models established by embedding and Sandwich，respectively.Fig.1 Bioluminescence detection of the solid tumors of tumor-bearing nude mice

注：A和B分別為包埋法和夾心法建立BALB/c裸小鼠肝癌原位移植瘤的病理照片。兩種方法建立的肝癌原位癌實體瘤生長良好，癌細(xì)胞形態(tài)一致，成巢狀分布，未出現(xiàn)壞死。圖2 實體瘤組織病理切片觀察（HE染色，×100）Note.A and B are the pathological picture of orthotopic transplantation hepatocellular carcinoma in the mice generated by embedding and sandwich，respectively.Both the two types of tumors grow well，show uniform cancer cells，form nest distribution，and without necrosis.Fig.2 Histological appearance of the solid tumor tissues.HE staining，×100

3 討論

在動物麻醉時，由于常用的麻醉劑如戊巴比妥鈉、水合氯醛、烏拉坦和氯醛糖等麻醉時間過長（2 ～4 h），因此，我們采用氣體麻醉系統(tǒng)對實驗動物進行麻醉，麻醉劑為異氟烷。與常用的這些麻醉劑相比，異氟烷麻醉具有麻醉條件簡單，麻醉深淺度可以隨時進行控制，麻醉動物蘇醒快，使用成本不高，動物不易發(fā)生死亡等特點。在剛開始麻醉時可將麻醉范圍調(diào)至最大使動物迅速麻醉，待動物被麻醉時，再將麻醉范圍調(diào)至適中，一般調(diào)至中間范圍。

在建立細(xì)胞混懸液皮下移植瘤模型時，細(xì)胞濃度不宜過小，一般為106～107個細(xì)胞/mL［8，10］。如果是貼壁細(xì)胞，1瓶規(guī)格為25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶長滿約90%時，細(xì)胞消化離心后用0.9%（g/mL）氯化鈉注射液稀釋到0.2 mL，接種1只動物腋窩皮下；如果是懸浮腫瘤細(xì)胞，可根據(jù)離心收集后沉淀于離心管底部的細(xì)胞體積進行初步判斷。

建立肝癌原位癌模型是將腫瘤組織塊直接接種于動物的肝臟部位。因此，首先應(yīng)選擇生長良好的皮下移植瘤。皮下移植瘤的生長時間不宜過長，一般選用接種后4周的實體瘤，如果生長時間過長（如6～8周）則腫瘤內(nèi)部組織會出現(xiàn)壞死，這樣的腫瘤組織接種到原位時會出現(xiàn)生長緩慢或生長不良。其次，應(yīng)盡量使腫瘤組織塊大小保持一致，這樣可以使原位接種后腫瘤組織生長大小控制在一定的范圍內(nèi)。另外，在將腫瘤組織縫掛于左、右肝葉直接時，縫線不能拉得太緊，否則容易撕裂肝臟，造成肝臟大量失血。在建立肝癌原位移植模型時，我們也采用過細(xì)胞混懸液注射法，細(xì)胞濃度約為106個細(xì)胞/mL，但成瘤率較低，僅為60%，而且成瘤所需時間也較組織塊法長，建議可將細(xì)胞濃度增加至107～108個細(xì)胞/mL。

在使用皮下移植瘤動物模型進行藥效學(xué)評價時，在給藥過程中可根據(jù)測量腫瘤體積來計算相對腫瘤增殖率 T/C（%）=TRTV/CRTV×100%。（TRTV：治療組RTV，CRTV：溶媒對照RTV。RTV= Vt/V0）。其中V0為分組給藥時（即d0）測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積。療效評價標(biāo)準(zhǔn)：T/C%＞40%為無效；T/C%≤40%，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理P＜0.05為有效。然而這種方法由于實體瘤的不規(guī)則性和測量時的人為誤差，得出的結(jié)果不夠精確，誤差較大，可靠性也大為降低。在使用原位癌動物模型進行評價時，通常需要先對腫瘤細(xì)胞進行熒光標(biāo)記或生物發(fā)光標(biāo)記，接入原位后再用小動物活體成像系統(tǒng)進行檢測和分析，可對存活腫瘤細(xì)胞的多少進行量化分析，結(jié)果更為精確和可靠。在原位移植瘤試驗中，通常對腫瘤細(xì)胞進行生物發(fā)光標(biāo)記，因為熒光在體內(nèi)更容易受到動物組織自發(fā)熒光的干擾，而且熒光在體內(nèi)的穿透力會受到一定程度的影響。

目前，國內(nèi)外所采用的裸小鼠肝癌原位移植模型主要是包埋法和細(xì)胞混懸液接種法［2］。但是這些方法都有各自的缺點：包埋法溶液造成動物肝臟大量出血并引起動物死亡，手術(shù)時間較長，具有較大的操作難度，在人員有限的情況下不適用于制備大批量的肝癌原位移植動物模型；細(xì)胞混懸液接種法成瘤率較低，且形成實體瘤時間較長，腫瘤生長較慢，并且注入肝臟的細(xì)胞混懸液溶液溢出，造成腫瘤腹腔內(nèi)廣泛種植。通過比較分析，我們所建立的夾心法是一種比包埋法操作更加簡便、高效，重現(xiàn)性更好的BALB/c裸小鼠肝癌原位移植模型。該方法除了具有操作簡單、手術(shù)時間短、成瘤率高、腫瘤組織生長良好和動物死亡率低等特點以外，在手術(shù)時不會造成動物肝臟大量出血，如果操作熟練，幾乎不會造成肝臟出血現(xiàn)象。動物出血少，術(shù)后恢復(fù)就很快，死亡率也會大大降低。此外，在接種過程中要注意將待接種的腫瘤組織塊用0.9%（g/mL）氯化鈉注射液或PBS緩沖液漂洗2～3次，在接種時腫瘤組織塊要避免與接種部位以外的組織和器官接觸，以確保腫瘤接種部位的一致性，避免腫瘤在動物腹腔內(nèi)出現(xiàn)廣泛種植。夾心法能為大批量制備肝癌原位模型節(jié)約大量時間，為肝癌原位藥效學(xué)及其他生物學(xué)研究提供更便利和有效的動物模型。

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【中圖分類號】Q95-33

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）03-0239-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.004

Corresponding author：FU Jian，Email：Fujian.hnmc@163.com

［基金項目］國家自然科學(xué)基金資助項目（NO 81160408）。

［作者簡介］田樹紅（1980-），男，助理研究員，碩士，主要從事藥理學(xué)與毒理學(xué)、抗腫瘤藥效學(xué)研究。

［通訊作者］符健，（1960-），男，博士，教授，研究方向：藥理毒理學(xué)，E-mail：Fujian.hnmc@163.com，Tel：0898-66982118預(yù)測全球癌癥病例將呈現(xiàn)急劇增長態(tài)勢，將由2012年的1400萬人（死亡820萬人）逐年遞增至2025年的1900萬人，預(yù)計到2035年將達到2400萬人。2014年中國衛(wèi)生統(tǒng)計提要數(shù)據(jù)表明，肝癌高居各種惡性腫瘤相關(guān)死亡原因的總體第2位。在全球范圍內(nèi)，每年約有75萬新增肝癌病例，同時又有約70萬例肝癌死亡病例，其中我國所占比例超過50%［1］。

［收稿日期］2015-11-23

Establishment of an orthotopic implantation model of hepatocellular carcinoma in nude mice

TIAN Shu-hong，WANG Ri-chao，XING Gui-lan，XIAO Min，F(xiàn)U Jian*
（Hainan Research Center for Drug Safety Evaluation，Hainan Medical College，Haikou 571199，China）

【Abstract】Objective To establish a new orthotopic implantation model of hepatocellular carcinoma in BALB/c nude mice.Methods The nude mice were under general anesthesia with isoflurane inhalation.Hepatocellular carcinoma was induced by subcutaneous inoculation of human hepatocellular carcinoma Bel-7402 cells in nude mice.The orthotopic implantation model of hepatocellular carcinoma in nude mice was established by orthotopic implantation of small pieces of the liver cancer tissues into the mouse liver by either a sandwich method or embedding method.The post-operative tumor growth was determined by a small animal in vivo imaging system.Histopathological examination of the liver and tumor tissues was performed at four weeks after modelling.Results The orthotopic hepatocellular carcinoma model of nude mice established by the sandwich method had several distinct advantages：shorter operative time，less operational difficulties，with a high rate of tumor formation，no wide-spread peritoneal tumor dissemination，well-preserved tumor histological structure，and low animal mortality.Conclusions Compared with the embedding method，the sandwich method can save much time for preparation of this orthotopic implantation model of hepatocellular carcinoma in nude mice，and provide a more convenient platform for research of liver cancer pharmacodynamics and other biological studies.

【Key words】BALB/c nude mice；Liver cancer；Orthotopic implantation；Small animals living imaging system