微生物發(fā)酵法產(chǎn)脫落酸的研究進(jìn)展

施天穹，彭輝，季榮鈺，石焜，曾斯雨，黃和，紀(jì)曉?。暇┕I(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816）

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進(jìn)展與述評

微生物發(fā)酵法產(chǎn)脫落酸的研究進(jìn)展

施天穹，彭輝，季榮鈺，石焜，曾斯雨，黃和，紀(jì)曉俊
（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816）

摘要：脫落酸是一種以異戊二烯為基本單位的酸性倍半萜類物質(zhì)，是一種重要的植物激素，在調(diào)節(jié)植物生長代謝、抵抗農(nóng)業(yè)自然災(zāi)害、增加農(nóng)作物產(chǎn)量等諸多方面發(fā)揮著重要的作用，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。本文介紹了天然脫落酸的生物合成途徑，并從發(fā)酵菌株、發(fā)酵底物、發(fā)酵工藝、分離提取等方面闡述了微生物發(fā)酵產(chǎn)脫落酸的研究進(jìn)展。同時討論了天然脫落酸發(fā)酵過程中存在的問題，如初始菌株產(chǎn)量低、發(fā)酵周期長、發(fā)酵工藝不穩(wěn)定、產(chǎn)物提取效率低等，因此本文在此基礎(chǔ)上指出，篩選優(yōu)良性狀的生產(chǎn)菌株、進(jìn)一步研究脫落酸生物合成途徑中關(guān)鍵酶的酶學(xué)性質(zhì)以及進(jìn)一步開發(fā)脫落酸的先進(jìn)發(fā)酵與分離提取工藝是今后研究的重點(diǎn)方向。

關(guān)鍵詞：脫落酸；倍半萜；發(fā)酵；灰葡萄孢霉

脫落酸（abscisic acid，ABA）是一種以異戊二烯為基本單位的酸性倍半萜類物質(zhì)，與生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、乙烯同為植物的五大類內(nèi)源激素，是一種重要的植物激素，除了能夠誘導(dǎo)植物抗逆基因表達(dá)，激活植物體內(nèi)的抗逆免疫系統(tǒng)，提高植物自身對干旱、寒冷、病蟲害、鹽堿的抗性以外，還具有促進(jìn)種子和果實(shí)貯存蛋白與糖分的積累，提高農(nóng)作物與水果的品質(zhì)以及控制花芽分化，調(diào)節(jié)花期等特性，因此具有較高的開發(fā)與應(yīng)用前景[1-5]。由于天然脫落酸 [(+)ABA] 在植物中的含量非常低，每200kg的棉桃僅能提取9mg(+)ABA晶體，因此提取法很難實(shí)現(xiàn)(+)ABA的規(guī)?；a(chǎn)。而化學(xué)法合成ABA，不僅步驟繁瑣，成本高，而且由于分子結(jié)構(gòu)中存在手性碳原子，合成的產(chǎn)物是天然型(+)ABA與非天然型(–)ABA的混合物（如圖 1所示），其活性較低[6]，也很難廣泛地應(yīng)用于大規(guī)模的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。所以，長期以來，雖然(+)ABA具有很強(qiáng)的功效，但卻是五大類植物激素中唯一未能在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用的植物激素。用微生物發(fā)酵法產(chǎn)ABA可以摒棄提取法和化學(xué)合成法的缺陷，得到的脫落酸是(+)ABA，具有活性、純度高等優(yōu)點(diǎn)，有利于實(shí)現(xiàn)(+)ABA的工業(yè)化生產(chǎn)，解決(+)ABA價格昂貴、合成困難以及存在異構(gòu)體的難題，能進(jìn)一步促進(jìn)其在各個領(lǐng)域的研究運(yùn)用。

圖1 天然脫落酸及其對映異構(gòu)體化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 脫落酸的生物合成途徑

與植物主要通過甲基赤藻糖磷酸（MEP）途徑生成脫落酸前體不同，微生物在代謝途徑中大多利用甲羥戊酸（MVA）途徑來生成脫落酸的前體異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）與二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyldiphosphate，DMAPP）[7-9]，之后的合成途徑雖然在不同的微生物中略有差異，但主要的合成步驟已經(jīng)基本確定，見圖2。脫落酸生物合成過程中，首先糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)在各自的代謝作用下生成乙酰CoA，一部分乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)供能。與此同時，另一部分乙酰CoA流入MVA途徑形成IPP與DMAPP，兩者在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（isopentenyl transferases，IPT）和法尼基焦磷酸合酶（Farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PS）的作用下生成法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）。在大多數(shù)情況下，F(xiàn)PP可以直接合成ABA的初始骨架。但是，有一些研究表明[10]，在發(fā)酵培養(yǎng)底物中增加類胡蘿卜素的濃度，可以顯著提高微生物產(chǎn)ABA的能力，因此，并不能完全排除存在另一條與高等植物類似的類胡蘿卜素降解途徑生成 ABA骨架的可能性，其中的關(guān)鍵酶編碼基因還有待進(jìn)一步的研究挖掘。最后，ABA 骨架再經(jīng)一系列氧化反應(yīng)后生成終產(chǎn)物ABA。

2 發(fā)酵菌株

自然界中可以積累 ABA的菌株主要有尾孢霉屬（Cercospora）、葡萄孢霉屬（Botrytis）、長喙殼屬（Ceratocystis）、曲霉屬（Aspergillus）等，見表1。在這些微生物中，尾孢霉屬、葡萄孢霉屬和曲霉屬產(chǎn)量相對較高。1977年，ASSANTE等[11]首次發(fā)現(xiàn)薔薇色尾孢霉（Cercospora rosicola）可以用來生產(chǎn)ABA，但存在著發(fā)酵時間長（30～40天），產(chǎn)量低（0.06g/L）的情況，很難用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。1982年，MARUMO等[12]開始使用灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）來生產(chǎn)(+)ABA。與前者相比，該菌的發(fā)酵時間顯著縮短，產(chǎn)量有所提升，具有較好的工業(yè)化生產(chǎn)前景，因此是生產(chǎn)(+)ABA的熱門菌株之一，受到廣泛的關(guān)注。在此之后，很多(+)ABA的工業(yè)化研究工作都圍繞著灰葡萄孢霉菌種的誘變篩選進(jìn)行，并取得了一定的成果。如余永柱利用紫外激光復(fù)合誘變技術(shù)篩選出產(chǎn)量達(dá)到2.1mg/g的發(fā)酵菌種。鄭衍、吳江[14]從植物致病菌株中分離出的灰葡萄孢霉，經(jīng)紫外和硫酸二乙酯多次誘變后，ABA產(chǎn)量提升了14倍，達(dá)374mg/L。

圖2 脫落酸生物合成途徑

譚紅等[15]利用紫外誘變、原生質(zhì)體誘變等技術(shù)對菌株進(jìn)行了遺傳學(xué)改良，使(+)ABA產(chǎn)量高達(dá)1.4g/L。隨后再采用DNA堿基定向誘變、關(guān)鍵酶基因改良等分子遺傳學(xué)技術(shù)手段，逐步改良篩選(+)ABA高產(chǎn)菌株，使ABA產(chǎn)量最終高達(dá)7.0g/L，隨后，建立了世界上第一條生產(chǎn)(+)ABA的工業(yè)化生產(chǎn)線，首次實(shí)現(xiàn)了(+)ABA的規(guī)?；a(chǎn)及農(nóng)業(yè)應(yīng)用，帶動了(+)ABA生產(chǎn)與技術(shù)的發(fā)展。

表1 產(chǎn)（+）ABA的發(fā)酵菌株研究情況

3 發(fā)酵底物

微生物發(fā)酵產(chǎn)(+)ABA的過程中，很多糖類可以被微生物使用作為碳源，其中葡萄糖是最常使用的一種碳源。除此之外，淀粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖等也可以作為碳源被B.cinerea、C.rosicola等菌株使用并轉(zhuǎn)化為(+)ABA[15，22]。鄭珩等[10]以 B.cinerea為發(fā)酵菌株進(jìn)行研究，深入考察了不同碳源對(+)ABA發(fā)酵產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，采用混合碳源比采用單一葡萄糖為碳源效果更好，當(dāng)控制蔗糖與葡萄糖的比例為3∶2時，可使(+)ABA產(chǎn)量提高68.8%。添加其他碳源可以降低葡萄糖效應(yīng)，加快菌體生長。當(dāng)葡萄糖消耗完畢后，菌體再利用其它糖類作為碳源促進(jìn)代謝產(chǎn)物的累積，可明顯提高（+）ABA的產(chǎn)量。

4 發(fā)酵工藝

4.1 固體發(fā)酵

微生物發(fā)酵生產(chǎn)(+)ABA的方法有固體發(fā)酵法與液體深層發(fā)酵法。早期(+)ABA主要通過固體發(fā)酵法制備。ASSANTE等[11]使用 C.rosicola產(chǎn)(+)ABA，產(chǎn)量達(dá) 0.06g/L培養(yǎng)基。DORFFLING等[19]從植物病原菌中分離出絲核菌、長喙霉、鐮刀菌、灰葡萄孢霉等并進(jìn)行了30天的長時間培養(yǎng)，最大產(chǎn)量達(dá)4.6mg/L培養(yǎng)基。MARUMO[13]也利用固體發(fā)酵技術(shù)產(chǎn)(+)ABA，產(chǎn)量達(dá)到較高水平，約為0.74mg/g培養(yǎng)基。相比之下，我國對微生物發(fā)酵產(chǎn)(+)ABA的研究起步較晚，1993年，吳少伯[24]才開始使用固體發(fā)酵產(chǎn)(+)ABA，實(shí)驗(yàn)以草莓灰葡萄孢為菌株，用固體發(fā)酵方式進(jìn)行培養(yǎng)，得到的(+)ABA平均產(chǎn)量為3.94mg/L。隨后，吳江等[25]學(xué)者也進(jìn)行了固體發(fā)酵法產(chǎn)(+)ABA的研究工作，并取得了一定的成果。在(+)ABA的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，雖然固體發(fā)酵法工藝簡單，成本低廉，所需投資較少，但固態(tài)發(fā)酵始終存在著周期長、占地面積大、產(chǎn)量低、提純難等缺點(diǎn)，因此研究方向漸漸轉(zhuǎn)向能提高最終菌體生物量，縮小生物反應(yīng)器體積，縮短發(fā)酵周期的液態(tài)發(fā)酵。

4.2 液體深層發(fā)酵

4.2.1 搖瓶液體發(fā)酵工藝優(yōu)化

搖瓶培養(yǎng)是菌種篩選培育階段，目的是為了確定菌種培養(yǎng)的最佳操作條件，以便最終轉(zhuǎn)移到大發(fā)酵罐進(jìn)行生產(chǎn)。因此對于微生物產(chǎn)(+)ABA發(fā)酵條件的優(yōu)化，一直在持續(xù)地進(jìn)行中。MASAO[23]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加玉米提取物可以使(+)ABA的產(chǎn)量大幅提升。NORMAN等[26]研究不同光照條件以及單一和混合氨基酸對(+)ABA生物合成的影響，以提高其產(chǎn)量。TAKAYAMA等[27]研究在不同發(fā)酵階段的培養(yǎng)基中添加不同濃度的水仙植物提取物，最終使得(+)ABA產(chǎn)量提高了30多倍。國內(nèi)學(xué)者吳少伯[24]考察了維生素A、檸檬酸鈉、玉米粉和葡萄糖這4種因素對(+)ABA發(fā)酵產(chǎn)量的影響，選擇四因素三水平的正交設(shè)計(jì)，優(yōu)化各添加成分的濃度，使(+)ABA 液體發(fā)酵產(chǎn)量提高 122.3%，達(dá) 到622.3mg/L。張卉等[18]同樣使用了正交試驗(yàn)法對野生黑曲霉的液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳產(chǎn)酸條件。王惠等[28]使用了半天然 PD培養(yǎng)基生產(chǎn)(+)ABA，不僅提高了(+)ABA的活性，而且還降低了成本，更符合工業(yè)化的要求。鄭衍等[25，29]考察了不同營養(yǎng)添加物以及前體對(+)ABA產(chǎn)量的影響，并通過 Plackett-Burman設(shè)計(jì)與球面對稱設(shè)計(jì)對(+)ABA產(chǎn)生菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加一定量的玉米粉、檸檬酸三鈉并控制蔗糖∶葡萄糖=3∶2時，可以使(+)ABA的含量提高4倍，達(dá)到212mg/L。因此，在(+)ABA發(fā)酵過程中確定最佳發(fā)酵條件是很有必要的，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中得到的各項(xiàng)參數(shù)同樣也推動了液體深層發(fā)酵工藝的進(jìn)一步優(yōu)化。

4.2.2 分批發(fā)酵工藝

從搖瓶液體發(fā)酵中確定了最佳發(fā)酵條件后，為了擴(kuò)大(+)ABA的生產(chǎn)規(guī)模，需要進(jìn)一步放大發(fā)酵工藝，傳統(tǒng)的工藝采用分批發(fā)酵的方法。分批發(fā)酵是指在一個密閉系統(tǒng)內(nèi)投入有限數(shù)量的營養(yǎng)物質(zhì)后，接入少量的微生物菌種進(jìn)行培養(yǎng)繁殖，在特定的條件下只完成一個生長周期的微生物培養(yǎng)方法。與搖瓶培養(yǎng)相比，該工藝比較容易解決雜菌污染和菌種退化等問題，對營養(yǎng)物的利用效率較高，產(chǎn)物濃度也比較高，通過在罐內(nèi)輸入氧氣滿足了菌種對氧氣的需求，并通過調(diào)控pH，攪拌等各項(xiàng)參數(shù)，使整個發(fā)酵過程處在更有利的條件下進(jìn)行。但缺點(diǎn)是人力、物力、動力消耗較大，生產(chǎn)效率低。由于在分批發(fā)酵工藝中，營養(yǎng)物質(zhì)是一次性加入的，與外界并沒有其他物質(zhì)交換，因此只能完成一個微生物生長周期，特別是當(dāng)產(chǎn)物濃度達(dá)到一定時，出現(xiàn)的產(chǎn)物抑制效應(yīng)極大地阻礙了(+)ABA產(chǎn)量的提高，造成了資源的浪費(fèi)[23]。

4.2.3 固定化菌體半連續(xù)發(fā)酵工藝

為了充分提升微生物菌種產(chǎn)酸能力，提高(+)ABA的產(chǎn)量，譚紅等[30]在液體分批發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上研發(fā)了固定化菌體半連續(xù)發(fā)酵工藝。該工藝在發(fā)酵過程中，采用了固定化細(xì)胞技術(shù)將菌絲體固定，調(diào)節(jié)溶氧、pH、溫度等參數(shù)降低菌體生長速率，并通過連續(xù)流加優(yōu)化的液體培養(yǎng)基及前體，調(diào)控菌體的代謝途徑，提高了(+)ABA的產(chǎn)量。該工藝能使微生物產(chǎn)(+)ABA的產(chǎn)酸高峰期保持較長的時間，消除產(chǎn)物的阻遏作用，提高了單位時間產(chǎn)酸量，從而降低資源消耗，節(jié)約成本。利用固定化菌體半連續(xù)發(fā)酵工藝使得（+）ABA的產(chǎn)量最高達(dá)到了1.2g/L，遠(yuǎn)超分批發(fā)酵工藝。但該技術(shù)工藝同樣存在著缺點(diǎn)，如工藝復(fù)雜，難以精確調(diào)控，且易染雜菌等。

4.2.4 (+)ABA批次流加補(bǔ)料發(fā)酵工藝

批次流加補(bǔ)料發(fā)酵工藝是在分批發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上流加培養(yǎng)基或營養(yǎng)物質(zhì)來培養(yǎng)微生物的發(fā)酵方法。與上述發(fā)酵方法相比，該工藝不僅可以解除底物抑制，產(chǎn)物抑制，還可以控制雜菌，實(shí)現(xiàn)自動化控制，因此被廣泛使用于(+)ABA的發(fā)酵生產(chǎn)研究中。雖然用該工藝生產(chǎn)(+)ABA產(chǎn)量有所提高，但葡萄糖阻遏效應(yīng)依然存在，當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時，會產(chǎn)生細(xì)胞代謝抑制作用，使菌體對其它糖的利用率下降，影響(+)ABA產(chǎn)量。因此，譚紅等[15]提出流加肌醇、人為控制碳氮比例的策略，解除了葡萄糖阻遏，提高了(+)ABA產(chǎn)量。與此同時，在分批流加發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，添加了乙酰CoA作為前體，并使用生物表面活性劑吐溫-20改善了發(fā)酵罐內(nèi)的溶氧情況。通過這些手段，菌株對氧氣的利用率顯著提高，菌株的底物轉(zhuǎn)化率與合成速率明顯加快，使(+)ABA的產(chǎn)量達(dá)到 6.0 g/L，進(jìn)一步推動了(+)ABA的工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程。

5 分離提取工藝

經(jīng)微生物發(fā)酵后的發(fā)酵液中除了含有（+）ABA外，還存在著很多其他的代謝產(chǎn)物，如何從這些混合物中分離出高純度、高收率的(+)ABA，成為了又一個難題。鄭衍等[31]對發(fā)酵生產(chǎn)(+)ABA的分離純化工藝進(jìn)行了初步探索。發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、去雜、乙酸乙酯萃取、NaHCO3反萃取、硅膠柱層析、結(jié)晶等步驟進(jìn)行分離純化得到ABA，產(chǎn)品經(jīng)光譜鑒定、旋光測定證實(shí)為(+)ABA，純度在98 %以上。該提取工藝路線步驟較短，操作簡單，重現(xiàn)性好，但是(+)ABA的收率較低，僅為39.7%。王天山等[32]用離子交換樹脂將發(fā)酵液中的有機(jī)物富集后，用乙醇解吸得到膏狀物，再經(jīng)硅膠吸附后用石油醚洗脫得到脂溶性的油狀化合物，并進(jìn)行了GC/MS分析，初步確定了這些脂溶性成分的主要來源，為改善整個發(fā)酵工藝及(+)ABA的分離提取工藝提供重要的數(shù)據(jù)依據(jù)。周金燕等[33]對(+)ABA的提取工藝做了進(jìn)一步的優(yōu)化，通過發(fā)酵液酸化后過濾，大孔吸附樹脂洗脫，洗脫液經(jīng)過濃縮后萃取，萃取液濃縮后得到初提物。初提物溶解后用硅膠吸附雜質(zhì)，加入乙烷等結(jié)晶助劑，減壓濃縮，冷卻結(jié)晶，洗滌，真空干燥，可得99%以上的(+)ABA，產(chǎn)品收率也達(dá)到了90%以上。

6 展 望

ABA作為一種重要的植物激素，在調(diào)節(jié)植物生長代謝，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，抵抗不良生長環(huán)境等方面發(fā)揮著重要的作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。植物提取法和化學(xué)法合成的ABA由于成本昂貴且活性低，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。所以用微生物發(fā)酵法產(chǎn)(+)ABA日益?zhèn)涫荜P(guān)注。從目前的報(bào)道來看，ABA大規(guī)模產(chǎn)量約為2～4g/L，雖然與野生菌每升幾十毫克的產(chǎn)量相比進(jìn)步明顯，但與其它一些微生物發(fā)酵產(chǎn)物相比，脫落酸的產(chǎn)量還較低。因此，今后的研究工作可以從以下幾個方面展開。

（1）菌株是工業(yè)生產(chǎn)的靈魂，是決定發(fā)酵生產(chǎn)效率以及產(chǎn)業(yè)化或者商業(yè)化的關(guān)鍵因素。只有篩選獲得優(yōu)良性狀的菌株，才有可能得到理想的發(fā)酵產(chǎn)品。因此應(yīng)重視菌株的選育，利用物理、化學(xué)等聯(lián)合誘變方法及高通量篩選方法對(+)ABA生產(chǎn)菌株進(jìn)行選育，以得到高產(chǎn)量菌株。

（2）進(jìn)一步研究(+)ABA生物合成分子機(jī)制，解析脫落酸生物合成中的關(guān)鍵途徑并鑒定其關(guān)鍵酶，研究其酶學(xué)性質(zhì)，為遺傳改造(+)ABA生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。

（3）進(jìn)一步開發(fā)高效低耗的(+)ABA提取工藝，為實(shí)現(xiàn)(+)ABA的規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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第一作者：施天穹（1993—），男，碩士研究生。聯(lián)系人：紀(jì)曉俊，副教授，研究方向?yàn)槲⑸锎x工程。E-mail xiaojunji@njtech.edu.cn。

中圖分類號：Q 939.97

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-6613（2016）07-2140-05

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.07.029

收稿日期：2015-11-30；修改稿日期：2016-01-07。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（21376002，21476111）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20131405）及江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目。

Production of abscisic acid by fermentation：a review

SHI Tianqiong，PENG Hui，JI Rongyu，SHI Kun，ZENG Siyu，HUANG He，JI Xiaojun
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816，Jiangsu，China）

Abstract：Abscisic acid (ABA) is an important plant hormone，which plays a significant role in regulating plant growth，resisting agricultural natural disaster and increasing crop yields activity，etc.Therefore，it has broad application prospects.This paper makes a brief introduction about its biosynthetic pathway as well as the research progress in the production of abscisic acid by fermentation including the strains，substrates and the fermentation processes.The problems occurred during the fermentation of abscisic acid are also discussed，such as the low yield of original strains，long fermented time，deficient fermentation technology and low efficiency in product extraction.It is pointed out that more attentions should be paid to the breeding the ABA high-producing strains，the main enzyme activity in the biosynthetic pathway and the extraction and purified technology.

Key words：abscisic acid；sesquiterpenes；fermentation；Botrytis cinerea