單克隆抗體藥物生產(chǎn)車間（拋棄型設(shè)備）工程設(shè)計探討

宋弘

（匯智工程科技有限公司武漢分公司，武漢 430000）

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單克隆抗體藥物生產(chǎn)車間（拋棄型設(shè)備）工程設(shè)計探討

宋弘

（匯智工程科技有限公司武漢分公司，武漢 430000）

摘 要現(xiàn)階段，國內(nèi)企業(yè)（含外企）單克隆抗體（以下簡稱“單抗”）藥物生產(chǎn)設(shè)備主要有傳統(tǒng)型生產(chǎn)設(shè)備和一次性拋棄型生產(chǎn)設(shè)備兩種。通過項目設(shè)計實例，結(jié)合中國GMP（2010修訂版）的要求，就一次性拋棄型生產(chǎn)設(shè)備的車間布局設(shè)計進(jìn)行探討與分析。

關(guān)鍵詞單抗；拋棄型動物細(xì)胞生物反應(yīng)器；生產(chǎn)車間；工程設(shè)計；GMP

1975年，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)將小白鼠骨髓瘤細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞免疫的小白鼠脾細(xì)胞相互融合，所形成的雜交瘤細(xì)胞組織中，產(chǎn)生抗體的同時，又可自行無性繁殖，從此開始了單抗技術(shù)的研究[3]。21世紀(jì)的今天，單抗已成功應(yīng)用于治療自身免疫性疾病和腫瘤等疾病中，成為繼疫苗和重組蛋白后最重要的一類生物制劑。

隨著中國改革開放后綜合實力的不斷增強，在國家《“十二五”生物技術(shù)發(fā)展規(guī)劃》的推動下，國內(nèi)外單抗藥物研究者的不懈努力下，國內(nèi)眾多研究成果步入工業(yè)化進(jìn)程，如何設(shè)計符合GMP的單抗藥物生產(chǎn)線已成為醫(yī)藥工程設(shè)計領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。

1 單抗的生產(chǎn)工藝流程及特點

單克隆抗體制備工藝流程可大致分為四個階段：第一階段為上游工作細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)擴增；第二階段為中游培養(yǎng)產(chǎn)物的粗純分離；第三階段為下游粗純產(chǎn)物的精純分裝；第四階段為單抗藥物制劑生產(chǎn)。

1.1 上游工作細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)擴增

該階段從工作細(xì)胞的復(fù)蘇開始，接種到搖瓶中恒溫條件下進(jìn)行細(xì)胞擴增，經(jīng)歷多級種子罐的的穩(wěn)定擴增后，進(jìn)入動物細(xì)胞生物反應(yīng)器進(jìn)行大量的細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞在擴增階段生長并形成產(chǎn)物，目標(biāo)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。待細(xì)胞培養(yǎng)和產(chǎn)物的形成完畢后，整個培養(yǎng)物（細(xì)胞和產(chǎn)物的混合物）將經(jīng)過深層過濾，細(xì)胞將截留在深層過濾器中。分離后的產(chǎn)物仍留在澄清后的上清液中，含目標(biāo)產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)上清液暫時貯存于溫度可控制的一次性儲存容器中。

該生產(chǎn)過程生產(chǎn)周期長（以1 000 L細(xì)胞培養(yǎng)為例，從工作細(xì)胞的復(fù)蘇開始，經(jīng)過擴增、培養(yǎng)，至目標(biāo)產(chǎn)物收獲，整個過程須45～50天）、生產(chǎn)過程溫濕度控制嚴(yán)格（單抗的本質(zhì)是糖基化蛋白質(zhì)，生產(chǎn)過程中對溫度有嚴(yán)格的控制要求）。該階段以哺乳動物細(xì)胞作為表達(dá)載體，工作細(xì)胞中帶入病毒會影響到成品的質(zhì)量、危害病人，也可能對生產(chǎn)操作人員產(chǎn)生危害。故在生產(chǎn)過程中還須有完整的病毒防范措施。

1.2 中游培養(yǎng)產(chǎn)物的粗純分離

上游收獲的培養(yǎng)液過濾后，首先進(jìn)行Protein A的高效捕獲親和層析，去除大部分的雜質(zhì)蛋白；經(jīng)低pH孵育，以滅活極小概率可能存在的病毒顆粒。過濾后經(jīng)陰陽離子交換后疏水層析、納濾，以去除極小概率可能存在的病毒顆粒。該生產(chǎn)過程須有嚴(yán)格的溫濕度控制和較為完整的病毒防范措施。

1.3 下游粗純產(chǎn)物的精純分裝

粗純產(chǎn)物溶液經(jīng)過切線流過濾超濃縮和緩沖液交換后，再按要求加入所需賦型劑和蛋白穩(wěn)定劑后，將原液進(jìn)行分散包裝（以匹配制劑生產(chǎn)用量）進(jìn)行貯存。該生產(chǎn)過程須有嚴(yán)格的溫濕度控制，病毒及其他活性物質(zhì)已在中游階段完全截留，此階段認(rèn)為是相對潔凈的階段。

1.4 單抗藥物制劑的分裝生產(chǎn)

單抗藥物制劑的形式一般為非最終滅菌的無菌制劑，主要為預(yù)充針、小水針和凍干粉針[1]。該階段生產(chǎn)結(jié)束后送至車間成品庫冷藏。該生產(chǎn)過程須有嚴(yán)格的無菌環(huán)境和溫濕度控制。制劑區(qū)域在設(shè)計中為單獨一塊生產(chǎn)區(qū)域，在制劑配液前，原液須冷庫冷藏，中間檢驗合格后方可運至制劑區(qū)進(jìn)行后續(xù)制劑工段的生產(chǎn)。

2 拋棄型設(shè)備在單抗生產(chǎn)中的特點

由于單抗生產(chǎn)由接種-培養(yǎng)-分離-制備等全過程必須是無菌操作過程，其無菌培養(yǎng)是產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵，因此要求包括動物細(xì)胞反應(yīng)器與所有連接介質(zhì)流體管道閥門、容器具、原件具有高度清潔嚴(yán)密完整性、易清洗、消毒、滅菌等特殊條件，這些設(shè)備常見有不銹鋼材料固定型和特殊塑料軟體一次性使用型（即拋棄型），下文僅討論使用拋棄型動物細(xì)胞反應(yīng)器的單抗生產(chǎn)線設(shè)計。

一次性拋棄型設(shè)備，是指所有與細(xì)胞培養(yǎng)過程物料有直接接觸的部分均為一次性產(chǎn)品，包括接種使用的容器、擴增使用的wave袋、培養(yǎng)使用的培養(yǎng)袋等均為一次性產(chǎn)品。下面對培養(yǎng)設(shè)備展開描述。

此類細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備是由美國引進(jìn)的軟袋形式的動物細(xì)胞生物反應(yīng)器，其中用于細(xì)胞擴增為波浪式的，用于細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)為500～2 000L攪拌式。圖1 是2 000 L培養(yǎng)器的主體，一次性培養(yǎng)袋袋體自帶與外界對接的接口（對接口詳見圖2）、袋內(nèi)自帶攪拌，置于可開啟門的不銹鋼容器中。不銹鋼容器下帶有滾輪，在不使用時，可推至功能間停放，不影響其他設(shè)備的運轉(zhuǎn)；容器上設(shè)有可觀察培養(yǎng)袋內(nèi)情況的視孔和培養(yǎng)袋與外界接觸的接口（詳見圖3），便于工作人員隨時觀察袋內(nèi)培養(yǎng)情況和進(jìn)料、出料時的無菌對接。一次性培養(yǎng)袋與其他一次性用品的對接由無菌焊接機進(jìn)行無菌對接完成。在用傳統(tǒng)設(shè)備生產(chǎn)單抗產(chǎn)品時，與物料有接觸的設(shè)備均需清洗和滅活，設(shè)備的清洗和滅活也是單抗生產(chǎn)過程中的瓶頸之一[2]。使用一次性拋棄型設(shè)備生產(chǎn)單抗，所有與物料有直接接觸的部分均為一次性產(chǎn)品，使用完成后集中通過高溫滅活等處理方式處理后，扎袋外運，很好地解決了傳統(tǒng)生產(chǎn)設(shè)備清洗和滅活的問題。

圖1 培養(yǎng)器主體設(shè)備Fig.1 Main equipment figure of the incubator

圖2 一次性培養(yǎng)袋上的無菌接口Fig.2 Sterile interface of the one-time cultivating bag

圖3 正常生產(chǎn)時無菌對接處Fig.3 Detail of sterile interface during normal production

GMP（2010修訂版）在“廠房與設(shè)施”一章中第一條（原文第三十八條）即規(guī)定：“廠房的選址、設(shè)計、布局、建造、改造和維護(hù)必須符合藥品生產(chǎn)要求，應(yīng)當(dāng)能夠最大限度地避免污染、交叉污染、混淆和差錯，便于清潔、操作和維護(hù)”[4]。采用一次性拋棄型設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)時，從工作細(xì)胞的復(fù)蘇一直到制劑階段的配料、除菌過濾，在整個生產(chǎn)過程中，與物料有直接接觸的部分均采用一次性用品，整個工藝生產(chǎn)過程，均在封閉的系統(tǒng)中進(jìn)行，管道的連接也是采用無菌焊接機進(jìn)行無菌對接。在整個生產(chǎn)過程中，很好地避免了污染、交叉污染、混淆和差錯；所有一次性用品在使用結(jié)束后通過高溫滅活等處理方式處理后，扎袋外運，交由有資質(zhì)單位處理，與傳統(tǒng)方式相比，省去了大量的設(shè)備清洗時間和空間，操作、維護(hù)也相對簡便。這也使得在車間布局中，更容易做到人、物流分開、不交叉，工藝路線順暢、物流路線短捷、不返流、不迂回。同時，根據(jù)GMP（2010修訂版）在生物制品（附錄3）的“廠房與設(shè)備”一章中第二十條規(guī)定：“使用密閉系統(tǒng)進(jìn)行生物發(fā)酵的可以在同一區(qū)域同時生產(chǎn)，如單克隆抗體和重組DNA制品”[4]。采用一次性拋棄型設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)時，兩條以上的生物發(fā)酵線可在同一培養(yǎng)發(fā)酵區(qū)域內(nèi)同時生產(chǎn)，也減小了因房間過多隔斷導(dǎo)致功能間利用率低的問題。

3 單抗的生產(chǎn)車間布局

單抗的生產(chǎn)，上游和中游需在D級潔凈環(huán)境中進(jìn)行，下游需在C級潔凈環(huán)境在進(jìn)行，所有物料有裸露的環(huán)節(jié)需在A級層流保護(hù)下操作，如上游的工作細(xì)胞接種、培養(yǎng)液的深層過濾收獲、中游的收獲液層析、下游的原液分裝工段，均需在A級層流保護(hù)下操作。下面列舉兩個設(shè)計中的例子，來介紹兩種完全不同的符合GMP（2010修訂版）及其他設(shè)計規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)車間布局設(shè)計案例。

3.1 上、中、下游三個階段氣鎖隔斷，單向人、物流設(shè)計

在單向人、物流設(shè)計中，人員進(jìn)出車間的通道、潔凈物料與不潔凈物料轉(zhuǎn)運通道、潔凈器具與使用過的不潔凈器具流通通道、潔凈清潔工具與使用過的不潔凈清潔工具流通通道均嚴(yán)格分開，以避免人員、物料、器具、清潔工具等退出時對供應(yīng)端區(qū)域造成污染。人員、物料、器具、清潔工具等流動方向均利用門禁系統(tǒng)控制，當(dāng)人員、物料、器具、清潔工具等進(jìn)入退出區(qū)域時，門禁系統(tǒng)將不允許這些區(qū)域的人或物返回到供應(yīng)端區(qū)域。工作人員只能由退出通道，通過專設(shè)的人流退出通道消毒后退出；物只能由退出通道，通過消毒、滅活失活后進(jìn)入待清理區(qū)域。圖4為某公司單抗車間的布局。

車間為單向人、物流設(shè)計，上游階段在接種間和細(xì)胞培養(yǎng)間完成，中游在純化處理（粗純）間完成，下游在純化處理（精純分裝）間完成，各功能間進(jìn)入前均設(shè)置緩沖間，與供應(yīng)走廊及其他功能間之間進(jìn)行良好的氣鎖隔斷，以最大限度地避免上、中、下游之間交叉污染。培養(yǎng)基的配制是為工作細(xì)胞的擴增、培養(yǎng)提供培養(yǎng)基，故兩個培養(yǎng)基配制功能間分別靠近兩條生產(chǎn)線的上游區(qū)域；緩沖液的配制是為中游和下游的純化提供緩沖液（大量緩沖液在粗純階段使用），故緩沖液配制功能間靠近純化處理而設(shè)置。上游、中游各功能間均設(shè)置有退出緩沖通道，與返回走廊相連，通過門禁系統(tǒng)的控制，進(jìn)入各退出緩沖的人、物，將不再允許返回功能間或供應(yīng)走廊內(nèi)。工作人員通過返回走廊，由右下角的人員退出通道消毒后退出；使用過的一次性拋棄型儲物袋等廢棄物通過返回走廊，由右上角的滅活功能間滅活后進(jìn)入廢棄物的暫存間；工衣通過返回走廊，由右上角的滅活功能間滅活后送至工衣清洗間清洗；使用非一次性器具為不銹鋼轉(zhuǎn)運小車，轉(zhuǎn)運后的小車通過返回走廊，由右上角的消毒間進(jìn)行表面消毒后，送至車暫存間待用；使用后潔具通過返回走廊，由右上角的消毒間進(jìn)行消毒后進(jìn)入潔具間清洗。這樣以來，潔凈人、物與不潔凈人、物之間沒有任何的交叉，也就最大限度地避免了潔凈人、物與不潔凈人、物之間相互影響。

3.2 上、中、下游三個階段嚴(yán)格物理隔斷設(shè)計

按嚴(yán)格的物理隔斷設(shè)計，上、中、下游三個階段各成一個區(qū)域，三套不同的空調(diào)系統(tǒng)，各自獨立的人、物流，三個區(qū)域之間的聯(lián)系也僅通過密閉管道連接，三個區(qū)域完全獨立，互不干擾。圖5為某公司單抗車間的布局。

車間嚴(yán)格物理隔斷設(shè)計，上游、中游、下游三個階段各占一個區(qū)域，各區(qū)域均配套有各自的人、物流進(jìn)出通道，并配套有區(qū)域內(nèi)使用的器具、清潔工具的清潔備用功能，三個區(qū)域相互獨立，互不影響。上游階段在接種間和培養(yǎng)間完成，培養(yǎng)基主要供培養(yǎng)功能間細(xì)胞培養(yǎng)使用，少量培養(yǎng)基供接種間工作細(xì)胞擴增使用，故培養(yǎng)基配置間貼臨培養(yǎng)功能間設(shè)置，在一次性拋棄型配制袋內(nèi)配制好的培養(yǎng)基可由轉(zhuǎn)運小車直接送至培養(yǎng)功能間，由一次性管道在無菌焊接機的作用下與一次性拋棄型培養(yǎng)袋無菌對接，完成培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移。工作人員通過D級走廊，經(jīng)退出緩沖區(qū)域退出生產(chǎn)區(qū)域；使用過的一次性拋棄型儲物袋等廢棄物通過該區(qū)域右下角的滅活間滅活后至廢物間暫存；使用的器具（轉(zhuǎn)運小車）、清潔工具被認(rèn)為不離開本區(qū)域而無需其他特殊處理，直接去至相應(yīng)的功能間清洗即可，不會對其他任何區(qū)域造成影響。收獲的培養(yǎng)液經(jīng)除菌過濾器過濾截留后由密閉管道送至中游階段。中游在粗純功能間完成，此區(qū)域內(nèi)緩沖液配制間配制的緩沖液僅供粗純使用，緩沖液配制間鄰近粗純功能間而設(shè)。該區(qū)域工作人員通過相應(yīng)的人流通道進(jìn)出，一次性拋棄型袋等廢棄物由專設(shè)的廢棄物通道轉(zhuǎn)運，使用的器具（轉(zhuǎn)運小車）、清潔工具直接去至相應(yīng)的功能間清洗，該區(qū)域完全獨立，不會對其他區(qū)域造成影響。粗純后的料液經(jīng)納濾過濾后經(jīng)密閉管道送至下游階段。下游在精純功能間完成，此區(qū)域內(nèi)緩沖液配制間配制的緩沖液僅供精純使用，所以緩沖液配制間鄰近粗純功能間而設(shè)。該區(qū)域工作人員通過相應(yīng)的人流通道進(jìn)出，一次性拋棄型袋等廢棄物由專設(shè)的廢棄物通道轉(zhuǎn)運，使用的器具（轉(zhuǎn)運小車）、清潔工具直接去至相應(yīng)的功能間清洗，該區(qū)域完全獨立，不會對其他區(qū)域造成影響。車間布局三階段之間完全獨立，從而最大限度地避免了三個區(qū)域之間的相互影響。

圖4 某公司單抗車間的布局（單向人、物流）Fig.4 The workshop plan of some monoclonal antibody drug company（the unidirectional path of the people and materials）

圖5 某公司單抗車間的布局（嚴(yán)格物理隔斷）Fig.5 The workshop plan of some monoclonal antibody drug company（Strict partition by the physical way）

4 結(jié)語

小批量（不大于2 000 L）的單抗藥物生產(chǎn)是現(xiàn)階段國內(nèi)單抗藥物GMP生產(chǎn)車間生產(chǎn)的主流。一次性拋棄型設(shè)備在單抗藥物生產(chǎn)車間內(nèi)能良好的避免了污染、交叉污染、混淆和差錯；同時，一次性拋棄型設(shè)備可滿足兩條以上的生物發(fā)酵線可在同一培養(yǎng)區(qū)域內(nèi)同時生產(chǎn)，使得生產(chǎn)周期較長上游階段能進(jìn)行錯班的生產(chǎn)，大大提高了設(shè)備利用率和生產(chǎn)車間的生產(chǎn)效率。無論是上、中、下游三個階段氣鎖隔斷，單向人、物流設(shè)計理念；還是上、中、下游三個階段嚴(yán)格物理隔斷設(shè)計理念；均能良好地與一次性拋棄型設(shè)備完美結(jié)合。最終設(shè)計出符合GMP （2010修訂版）及其他設(shè)計規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)車間布局。

參考文獻(xiàn)

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中圖分類號：TQ 460.8

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：2095-817X（2016）02-009-000

收稿日期：2016-01-06

作者簡介：宋弘（1989—）男，工程師，研究方向：醫(yī)藥工程設(shè)計。

Discussion of Engineering Design for Monoclonal Antibody Drug Workshop with Disposable Equipment

Song Hong
（Wuhan Branch, Huizhi Engineering Science & Technology Co., Ltd, Wuhan 430000）

Abstract:Currently there are two equipment for producing monoclonal antibody-traditional equipment and one time usage disposable one. Combined with the requirements in china GMP (2010 Revised Edition) and with one practical example, the layout design of workshop equipped with one time usage equipment was analyzed and discussed in this article.

Keywords:monoclonal antibody; disposable animal cells bioreactor; workshop; engineering design; GMP