貴州遵義地區(qū)蝙蝠腦組織BDV-P24基因片段的檢測

楊利玲,雷以會,徐　平

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貴州遵義地區(qū)蝙蝠腦組織BDV-P24基因片段的檢測

楊利玲,雷以會,徐平

遵義醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遵義563500

摘要：目的了解貴州遵義地區(qū)蝙蝠博爾納病病毒(BDV)感染情況。方法采用巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(nRT-PCR)檢測82例蝙蝠腦組織BDV-P24基因片段，陽性產(chǎn)物進行基因序列測定、同源性及分子系統(tǒng)樹分析。結(jié)果在82例蝙蝠腦組織中檢測出7例BDV-RNA P24基因片段陽性，只有5例成功測出BDV-P24基因片段，與標準株馬源Strain V相比較同源性高達99%，出現(xiàn)2個位點的一致性沉寂突變(nt1650T～C，nt1740G-T,突變率為0.9%)，與H1766比較其同源性達97%，出現(xiàn)5個位點的一致性沉寂改變(nt1599A～G，nt1671T～C，nt1677T～C，nt1695G～A，nt1740G～T,突變率為2.2%)，與He/80比較起同源性為96%，出現(xiàn)7個位點的一致性沉寂改變(nt1566 G～A，nt1581C～T，nt1659 T～C，nt1668 A～G，nt1674 T～C，nt1695 G～A，nt1740 G～A，突變率為3.1%)。結(jié)論貴州遵義綏陽地區(qū)蝙蝠存在BDV感染，與馬源Strain V存在高度同源性，人感染BDV可能存在潛在的動物源性。

關(guān)鍵詞：博爾納病病毒；蝙蝠；nRT-PCR；P24

博爾納病病毒(Borna disease virus，BDV)是一種有包膜、未分節(jié)段單股負鏈、嗜神經(jīng)性的核糖核酸病毒，是博爾納病毒科、博爾納病毒屬家族中目前唯一的成員。最早發(fā)現(xiàn)于德國的Borna鎮(zhèn)，在當?shù)貞?zhàn)馬中暴發(fā)一類不明原因致死性腦炎，有學者在動物尸體的腦組織中檢測出病毒，就以該鎮(zhèn)而命名為“博爾納病病毒”。BDV有著廣泛的自然感染宿主，從鳥類到包括人類在內(nèi)的大多數(shù)恒溫哺乳動物，例如馬、羊、貓、牛、犬、羊駝、狐貍、猴等[1]，國內(nèi)外研究已證實馬和羊為其最主要的自然感染宿主。隨著科技水平的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)BDV有著更廣闊的感染動物種系，日本學者發(fā)現(xiàn)浣熊感染BDV的證據(jù)[2]，在我國重慶、寧夏、貴州以及新疆等地區(qū)已有動物腦組織和外周血中發(fā)現(xiàn)感染BDV的相關(guān)報道。近年來研究發(fā)現(xiàn)在蝙蝠體內(nèi)已經(jīng)分離出80余種來源于動物且可感染人類的病原體[3]，例如狂犬病毒、乙型腦炎病毒等人獸共患病病毒，其中也包括許多新型的人獸共患病病毒，比如馬來西亞暴發(fā)的尼帕病毒病、澳大利亞暴發(fā)的亨德拉病毒病以及近幾年爆發(fā)較為頻繁的西尼羅病毒病等均被證明蝙蝠為這些病毒的自然感染宿主。目前，國、內(nèi)外尚未有蝙蝠感染BDV的相關(guān)文獻。為此，我們采用傳統(tǒng)的nRT-PCR對82只蝙蝠的腦組織BDV-P24基因片段進行檢測，并對PCR陽性產(chǎn)物測序，以了解遵義地區(qū)蝙蝠B(yǎng)DV自然感染狀況，探討B(tài)DV種系來源，并與標準株Stain V、H1766、He/80比較分析其同源性。實驗結(jié)果報告如下。

1材料和方法

1.1實驗材料全部82只蝙蝠均采自遵義地區(qū)野生蝙蝠，采集時間為2014年5月至2014年9月。從蝙蝠中采取的腦組織標本放入去酶的1.5 mL EP管，并立即放于-80 ℃的超低溫冰箱保存。采集過程中嚴格按照無菌操作收集標本，避免樣品間交叉污染。

1.2引物根據(jù)GenBank BDV基因保守區(qū)第二開放閱讀區(qū)(ORFII)的核苷酸序列設計2對引物。

外引物序列長度為512 bp，

P1：AGACACTACGACGGGAACGA

P2：TGGGAGCTGGGGATAAATGC。

內(nèi)引物序列長度為270 bp，

P3：GCATGATCGAGGCTGAGGAG

P4：GCAACATGGGTGCAGAGGTC，

引物由上海生工有限公司合成。

1.3主要儀器凝膠成像系統(tǒng)Chemidoc XRS(美國應用生物系統(tǒng)公司)、RTC0200 DNA Engine PCR儀、紫外分光光度計 Nanodrop 1000(基因有限公司)。

1.4方法全部標本均采自蝙蝠的新鮮腦組織，重量約為110～150 mg，分裝于去酶的1.5 mL EP管中并編號，-80 ℃超低溫冰箱保存。所有儀器和試管均經(jīng)過高壓滅菌、去RNA酶處理。

1.4.1RNA的提取及質(zhì)量檢測取50 mg左右的蝙蝠腦組織于已高溫滅菌的玻璃勻漿管中，加入1 mL的Trizol試劑，采用滅菌后的玻璃研磨棒研磨，直至研磨為勻漿液。用Trizol一步法提取RNA。提取的RNA樣本用紫外分光光度計測定RNA的濃度以及OD260/OD280值，以檢測RNA的質(zhì)量，OD260/OD280值介于1.8～2.1認為提取RNA質(zhì)量較好。將提取的RNA樣本于-80 ℃低溫冰箱保存。

1.4.2BDV P24基因片段的檢測采用nRT-PCR方法。在進行BDV檢測的全部環(huán)節(jié)中均設置陰性對照和陽性對照，以去酶的DRPC水為陰性對照以排除假陽性，同時使用BDV感染的OL細胞為陽性對照以排除假陰性(陽性對照標本為重慶醫(yī)科大學所提供)。(1)RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA：將所提取的RNA樣本放于室溫中。反應體系為10 μL：VRNA=500 ng/RNA樣本濃度，5×Prime Script RT Master Mix 2 μL，去酶的DEPC補足10 μL。反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 保持。(2)第1輪PCR反應體系25 μL：2×GoTaq Master Mix 12.5 μL，外上、下游引物各1 μL，cDNA樣本2 μL，去酶的ddH2O 8.5 μL。反應條件：預變性95 ℃ 2 min，變性 95 ℃ 30 s，退火 55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，共22個循環(huán)，延伸 72 ℃ 5 min，保持 4 ℃ 5 min。(3)第2輪PCR反應體系：2×GoTaq Master Mix 12.5 μL，內(nèi)上、下游引物各1 μL，第一輪PCR產(chǎn)物2 μL，去酶的ddH2O 8.5 μL。反應條件：預變性95 ℃ 2 min，變性 95 ℃ 30 s，退火 58 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，共22個循環(huán)，延伸 72 ℃ 5 min，保持 4 ℃ 5 min。

1.4.3測序?qū)⒌?輪PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。最后將陽性的PCR產(chǎn)物進行純化和克隆，由英捷有限公司進行測序。

1.4.4序列分析登陸NCBI，應用BLAST軟件，將測序結(jié)果和GenBank上提供的標準株He/80、Strain V、H1766等進行比對分析，使用DNAman8繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。

2結(jié)果

2.1PCR擴增產(chǎn)物電泳應用nRT-PCR方法對蝙蝠腦組織 BDV-P24基因片段進行檢測。1%瓊脂糖電泳有7份PCR產(chǎn)物大約在250 bp處可見明顯條帶，陰性對照未出現(xiàn)條帶。見圖1。

2.2測序及序列分析對7份PCR陽性產(chǎn)物進行純化、測序，僅有5份測序成功，陽性率為6.1%，另外兩份因濃度太低而未測出。登陸NCBI和序列比對，陽性PCR產(chǎn)物擴增片段證實為BDV-P24基因片段(nt1 528～nt1 750)，蝙蝠B(yǎng)DV-P24測序結(jié)果與GenBank所提供的標準株的相似性達96%～99%。與標準株馬源Strain V(GenBank編號：AJ311521.1)相比較同源性高達99%，出現(xiàn)2個位點的一致性沉寂突變(nt1650T～C，nt1740G-T,突變率為0.9%)，與H1766(GenBank編號：AJ311523.1)比較其同源性達97%，出現(xiàn)5個位點的一致性沉寂改變(nt1599A～G，nt1671T～C，nt1677T～C，nt1695G～A，nt1740G～T,突變率為2.2%)，與He/80(GenBank編號：AJ311522)比較起同源性為96%，出現(xiàn)7個位點的一致性沉寂改變(nt1566 G～A，nt1581C～T，nt1659 T～C，nt1668 A～G，nt1674 T～C，nt1695 G～A，nt1740 G～A，突變率為3.1%)。

+ was positive control, - was negative control, 1-7 were test specimens.

圖17例陽性PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。其中+為陽性對照，-為陰性對照，1-7為實驗標本

Fig.1Electrophoresis results of 7 positive nRT-PCR products

2.3系統(tǒng)發(fā)生樹分析重構(gòu)系統(tǒng)發(fā)生樹發(fā)現(xiàn)，在核苷酸水平上可見4例蝙蝠腦組織BDV-P24基因片段匯聚形成貴州獨立支系，1例蝙蝠腦組織BDV-P24的基因序列與精神疾病患者PBMC中BDV-P24基因序列(GenBank No.L76236)形成獨立支系。見圖2。

圖2　BDV分子系統(tǒng)樹分析

3討論

博爾納病病毒(borna disease virus,BDV)為博爾納病的病原體，博爾納病為免疫介導的中樞的腦脊髓炎，感染動物以精神行為異常為主要臨床癥狀，人類則表現(xiàn)為神經(jīng)精神疾病癥狀。BDV是一種嗜神經(jīng)的RNA病毒，感染途徑可能以口、鼻、眼等處的分泌物以及血液進行傳播，在自然環(huán)境中人和動物直接或間接接觸被污染的食物、水而發(fā)生感染。

BDV有著廣泛的自然感染宿主，國內(nèi)已有許多關(guān)于BDV分子流行病學調(diào)查的相關(guān)報道。國內(nèi)學者采用熒光定量結(jié)合巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(FQ-nRT-PCR)方法對多種物種進行BDV檢測。何豐[4]檢測新疆伊犁地區(qū)100只牧羊犬PBMC和腦組織中P24陽性率分別為5%、9%,劉建[5]對寧夏地區(qū)163只綿羊腦組織檢測P24陽性率為3.68%。本課題組前期成員王長明[6]、劉海軍[7]采用FQ-nRT-PC分別對貴州省以及周邊地區(qū)的300只山羊和120只牛的PBMC進行檢測，陽性率分別為0.67%、4.17%。 Wensman[8]發(fā)現(xiàn)健康貓BDV陽性率為16%(4/25)。

本研究采用巢式RT-PCR對82份蝙蝠腦組織進行BDV-P24檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性率為6.1%，說明遵義綏陽地區(qū)存在有一定程度的BDV感染。但均高于前期成員報道遵義地區(qū)牛和山羊的BDV陽性感染率，與重慶、新疆、寧夏等地區(qū)的恒溫動物的BDV陽性感染也有一定的差別，可能原因有以下幾個方面：1)本實驗以蝙蝠腦組織為檢測對象，腦組織中BDV RNA的含量較PBMC中豐富，故本實驗BDV陽性感染率較高。2)不同地區(qū)、不同物種BDV感染率不同。3)急性感染BDV后，大部分病毒顆粒被免疫系統(tǒng)清除，血清中僅存在少量的病毒顆粒，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中依然存在持續(xù)感染[9]。本實驗引物設計是選取BDV-P24高度保守序列區(qū)，且測序結(jié)果與標準株的同源性達96%～99%，仍存在個位點的突變，說明感染蝙蝠的BDV存在基因多樣性。王長明曾報道遵義部分地區(qū)山羊存在BDV的自然感染，并且2頭BDV陽性的山羊均來自綏陽地區(qū)，說明遵義綏陽地區(qū)為疫源的高風險地區(qū)，若BD爆發(fā)或流行，遵義綏陽地區(qū)可能為先發(fā)的流行區(qū)之一。從重構(gòu)的分子系統(tǒng)發(fā)生樹中可發(fā)現(xiàn)5例陽性標本隸屬于2個支系。4例蝙蝠腦組織BDV-P24基因片段形成貴州獨立支系的可能原因：1)不同地區(qū)形成不同的BDV株系。2)由于自然選擇對變異的作用大小不同，由該地區(qū)的BDV株系基因突變而成[10]。1例與國外精神病人單獨匯聚為一株系，有較高的同源性，說明BDV可以在動物與動物、動物與人類之間循環(huán)傳播。

綜上所述，貴州省遵義地區(qū)蝙蝠存在BDV自然感染，人感染BDV存在潛在動物源性。由于標本均來自本地，并且標本數(shù)量較少，無法做出全面的解釋，后續(xù)研究還需擴大標本數(shù)量并進行其它地區(qū)的分子流行病學研究，并開展本省BDV病毒株分離工作，為預防和控制貴州省BDV的流行奠下基礎。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.011

通訊作者：徐平;Email:xuping527@vip.sina.com

中圖分類號：R373

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)02-0156-04

收稿日期：2015-06-08；修回日期:2015-09-22

Borna disease virus p24 in brain tissue of bat infect in Zunyi, Guizhou Province, China

YANG Li-ling,LEI Yi-hui, XU Ping

(The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563500, China)

Abstract:The p24 gene fragment of BDV-RNA in brain tissue of bat was detected by nested reverse transcriptase polymerase chain reaction (nRT-PCR) in Zunyi, Guizhou Province. The positive PCR products were analyzed by genetic sequence homology and molecular phylogenetic tree. Result showed that the P24 gene fragment of BDV-RNA in brain tissue from 82 bats was 7 positived. There was only 5 positive products could be successfully detected. The homology of p24gene fragment of BDV was 99%, with 2 situs consistency silent mutation when compared with standard strain V in horse (nt1650T-C, nt1740G-T, mutation rate of 0.9%). The homology of p24 gene fragment of BDV was 97%, with 5 situs consistency silent mutation when compared with H1766 (nt1599A-G, nt1671 T-C, nt1677 T-C, nt1695 G-A, nt1740 G-T, mutation rate of 2.2%). The homology of p24 gene fragment of BDV was 96%, with 7 situs consistency silent mutation when compared with He80 (nt1566 G-A, nt1581 C-T, nt1659 T-C, nt1668 A-G, nt1674 T-C, nt1695 G-A, nt1740 G-A, mutation rate of 3.1%). There is BDV natural infection probably originated from bat, highly homology with strain V in horse in Zunyi, Guizhou Province.

Keywords:Borna disease virus; bat; nRT-PCR; P24

國家自然科學基金項目(No.31160210)資助

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31160210)

Corresponding anther: Xu Ping, Email: xuping527@vip.sina.com