浙江省不同地理株白紋伊蚊mtDNA-COⅠ基因多態(tài)性研究

郭　頌，凌　鋒，王金娜，吳瑜燕，侯　娟，龔震宇

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浙江省不同地理株白紋伊蚊mtDNA-COⅠ基因多態(tài)性研究

郭頌，凌鋒，王金娜，吳瑜燕，侯娟，龔震宇

浙江省疾病預(yù)防控制中心，杭州310051

摘要：目的比較浙江省不同地理區(qū)域白紋伊蚊種群線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(mtDNA-COⅠ)序列的多態(tài)性，探討其遺傳特征。方法采集登革熱歷史流行區(qū)和非流行區(qū)的白紋伊蚊雌性成蚊，PCR擴增COⅠ基因，測序后結(jié)合Genbank中獲得的各地白紋伊蚊序列進行比對，分析基因特征和種群分化并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果用于分析的線粒體COⅠ基因長度為686 bp，堿基A+T平均含量為67.8%，G+C平均含量為32.2%，變異位點中包括15個堿基轉(zhuǎn)換位點和3個顛換位點。96個個體中存在20個單倍型，整體單倍型多樣性為0.497，核酸多樣性為0.717，核酸平均差異數(shù)為0.001 05。衢州、溫州蒼南和麗水的白紋伊蚊COⅠ序列多態(tài)性高于其它地區(qū)，且溫州蒼南和衢州白紋伊蚊種群與其它地區(qū)白紋伊蚊種群存在中等遺傳分化。結(jié)論浙江省不同地理株白紋伊蚊COⅠ序列表現(xiàn)出一定程度的遺傳多態(tài)性和的遺傳分化，可能由環(huán)境、氣候和人文因素綜合所致。

關(guān)鍵詞：白紋伊蚊；細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ；多態(tài)性

白紋伊蚊(Aedesalbopictus)在中國分布廣泛，是浙江省登革熱的唯一傳播媒介，并且嚴重騷擾人群的正常生活。近年來由于全球氣候的變化，城市及區(qū)域間的交通運輸和人員交流的頻繁，以及生態(tài)環(huán)境的變遷等，使得白紋伊蚊的種群密度和分布發(fā)生新的變化[1]，還由于登革熱輸入病例對浙江省的登革熱防控帶來的考驗。不同種間、不同地理株蚊蟲的生態(tài)習性與傳播疾病的類別和能力均有一定的差異[2]。線粒體的細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因擁有合適的長度和進化速率，能保證足夠變異的同時又容易被通用引物所擴增，且序列本身幾乎沒有插入和缺失突變等，其在蚊種鑒定和遺傳差異分析方面應(yīng)用廣泛[3-4]。特檢測浙江省登革熱歷史流行區(qū)和非流行區(qū)的白紋伊蚊COⅠ序列遺傳特征，探討不同蚊蟲群體的COⅠ基因分化及遺傳差異。

1材料與方法

1.1樣本的獲取和基因組DNA的提取考慮浙江省登革熱歷史及地理區(qū)域代表性和對照原則，選擇杭州市、寧波市、嵊泗縣、建德市、衢州市、義烏市、麗水市和溫州蒼南縣8個白紋伊蚊采樣點。其中義烏市和寧波市為登革熱歷史流行區(qū)。每個采樣點按照東南西北4個方位通過人誘法捕捉白紋伊蚊雌性成蚊，采集的標本浸入無水乙醇置于-80 ℃冰箱保存。采用DNA提取試劑盒(QIAGEN：69506)提取單個白紋伊蚊基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2白紋伊蚊COⅠ基因的擴增和測序參考Folmer等[5]擴增COI基因的通用引物，上下游引物分別為，LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以單個蚊蟲基因組DNA為模板擴增COⅠ基因片段，采用25 μL反應(yīng)體系：PCR預(yù)混液(Takara)12.5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，DNA模板1.5 μL，ddH2O 10 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃后延伸7 min。擴增完后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，產(chǎn)物4 ℃保存，陽性產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.3COⅠ基因序列分析利用Lasergene v7.0軟件查看基因的雙向測序峰圖，核對正確之后應(yīng)用Mega 6.0進行比對。應(yīng)用DnaSP v5軟件統(tǒng)計各個地理種群COⅠ基因片段的多態(tài)性位點(polymorphic sites)、單倍型數(shù)(number of haplotypes)、單倍型多樣性 (Hd，haplotype diversity)、核酸多樣性 (π，nucleotide diversity)和核酸平均差異數(shù)(K，mean number of pairwise differences)。應(yīng)用Arlequin v3.5軟件，計算群體間的分化指數(shù)(Fst，F(xiàn)-statistics)和基因流(Nm，Nm=(1-Fst)/4Fst)。

使用Mega 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，采用基于Kimura雙參數(shù)校正模型的鄰接法(neighbor-joining，NJ)方法，并用Bootstraping法對系統(tǒng)發(fā)生樹進行評估，Bootstrap次數(shù)設(shè)置為1 000。分析中同時加入了從GenBank中獲得的白紋伊蚊單倍型序列，GenBank序列號如下：AB738203(日本)，HQ398902(越南)，KF406541(巴基斯坦)，KJ410335(印度)，GQ143719(澳大利亞)，KP843400(泰國)，KC920788(馬來西亞)，KR068634(中國南京)，JQ235749(中國云南)，JQ728301(中國海南)，NC006817(中國臺灣)。

2結(jié)果

2.1白紋伊蚊COⅠ基因測序及變異分析從浙江省8個采樣點共采集到96只雌性白紋伊蚊成蚊，提取基因組DNA并全部成功擴增出COⅠ基因，各個采樣點COⅠ基因信息見表1。8個白紋伊蚊種群一共獲得96個COⅠ序列，與GenBank收錄的白紋伊蚊線粒體全序列(NC006817)進行比較，與其中編碼COⅠ基因的序列相似性均達到99%以上，用于分析的序列長度為686 bp，無插入和缺失突變。所得COⅠ序列的平均A、T、G、C堿基含量分別為28.4%、39.4%、15.9%、16.3%，A+T的平均含量為67.8%，明顯高于G+C平均含量32.2%，與雙翅目昆蟲的線粒體DNA的堿基組成一致。所分析的序列包含667個保守位點和18個變異位點，由此區(qū)分為20個單倍型，變異位點包含8個A/G轉(zhuǎn)換，7個T/C轉(zhuǎn)換， 2個A/T顛換和 1個C/G顛換(表2)。

所有的白紋伊蚊種群中溫州蒼南白紋伊蚊種群的COⅠ基因序列表現(xiàn)出最高的多樣性(Hd=0.803，K=1.288，π=0.00 188)，其次是衢州(Hd=0.758，K=1.045，π=0.001 52)和麗水(Hd=0.576，K=0.833，π=0.001 21)的白紋伊蚊種群，舟山嵊泗和義烏白紋伊蚊種群的COⅠ基因序列的多樣性相對較低。

2.2種群分化和基因流種群分化指數(shù)(Fst)常用來表示兩個種群間的遺傳分化程度，在所選取的8個白紋伊蚊地理種群的配對Fst比較中，杭州、寧波、嵊泗、建德、麗水和義烏的白紋伊蚊種群之間的Fst值很低且統(tǒng)計學檢驗無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明這6個群體間無顯著的遺傳分化。而溫州蒼南種群分別與其他地區(qū)種群的Fst在0.077～0.127之間，表現(xiàn)出中等遺傳分化，衢州種群與其他地區(qū)種群的Fst在0.061～0.091之間，也表現(xiàn)出中等遺傳分化。白紋伊蚊種群間分化程度最大的是蒼南和舟山嵊泗種群。蒼南和衢州種群與其他地區(qū)種群之間的Nm均小于4，種群間基因交流較低。

表1　不同采樣點白紋伊蚊COⅠ基因多態(tài)性信息

表2　白紋伊蚊COⅠ基因序列變異位點

2.3系統(tǒng)發(fā)生樹分析從系統(tǒng)發(fā)生樹中可以看出，浙江不同采樣點白紋伊蚊線粒體COⅠ基因存在個體差異，對所獲得的白紋伊蚊COⅠ基因序列基于K2P計算個體間的距離，其種內(nèi)距離的范圍在0.000～0.006之間，符合大部分種內(nèi)距離<1%的遺傳差異。所有的20個單倍型與來自海南、南京、臺灣、日本、澳大利亞、巴基斯坦和越南的白紋伊蚊COⅠ序列共同形成一個大分支，其中來自衢州的單倍型H15、H17和H18形成一個獨立分支，來自蒼南的單倍型H1、H2、H5(衢州共有)和來自巴基斯坦的單倍型形成一個獨立分支，義烏、寧波和舟山嵊泗共有的單倍型H14與來自海南的單倍型形成一個分支。同時，這些序列與來自云南，馬來西亞，泰國和印度的白紋伊蚊COⅠ序列表現(xiàn)出一定的遺傳分化。

表3　浙江省白紋伊蚊種群配對Fst(左下)和Nm值(右上)

圖1　基于COⅠ序列的白紋伊蚊單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹

Fig.1Phylogenetic analysis of haplotypes from Aedes albopitus based onCOⅠ gene

3討論

蚊蟲群體多樣性跟蚊蟲所分布地區(qū)的人文地理特征、氣候、生態(tài)習性和蚊蟲的遷移等密切相關(guān)[6-7]。本次采集到的白紋伊蚊COⅠ基因序列同一性在99%以上，遺傳距離極小，在種內(nèi)變異的范圍內(nèi)，與中國其他地區(qū)的結(jié)果類似[8-9]，其多樣性明顯高于白紋伊蚊新入侵的區(qū)域[10]，但是仍呈現(xiàn)出區(qū)域差異：西部衢州，南部麗水以及與福建省相鄰的溫州蒼南地區(qū)的白紋伊蚊種群多樣性較高，中東部地區(qū)及海島的白紋伊蚊多樣性相對較低。造成部分地區(qū)白紋伊蚊多樣性較低的原因除了采樣造成的選擇偏倚以外，還可能與各地開展的愛國衛(wèi)生運動中的滅蚊行為有關(guān)。故結(jié)果可作為白紋伊蚊種群動態(tài)的監(jiān)測指標，結(jié)合抗藥性水平等方面的監(jiān)測，可以指導當?shù)匕准y伊蚊的科學控制和登革熱的防控。

浙江省地處亞熱帶季風氣候，氣溫適中，四季分明，光照充足，雨量充沛。省內(nèi)地形復雜，山地和丘陵占70.4%，平原和盆地占23.2%，河流和湖泊占6.4%，多樣的地形環(huán)境和氣候會對于白紋伊蚊的遺傳分化產(chǎn)生影響。一般認為Fst<0.05顯示種群出現(xiàn)輕度分化，0.05

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.007

通訊作者：龔震宇，Email: zhygong@cdc.zj.cn

Corresponding author:Gong Zhen-yu, Email: zhygong@cdc.zj.cn

中圖分類號：R384

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)02-0133-04

收稿日期：2015-08-08；修回日期:2015-11-21

Genetic polymorphism analysis of cytochrome C oxidase subunit I gene in Aedes albopictus from Zhejiang Province, China

GUO Song,LING Feng,WANG Jin-na,WU Yu-yan,HOU Juan,GONG Zhen-yu

(Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310051, China)

Abstract:In order to study the characteristics of mitochondrial DNA Cytochrome C oxidase subunit I (mtDNA-COI) gene of Aedes albopictus from Zhejiang and to explore genetic polymorphism of this vector, adult female mosquitoes were collected from dengue epidemical and non-endemic areas from Zhejiang, and their COI genes were amplified by PCR and sequenced for genetic analysis including genetic feature, population differentiation and phylogenetic tree construction. The COI fragment contained 686 nucleotides with 18 polymorphic sites including 15 transition sites and 3 transversion sites. The percentage of A+T content in COI gene was 67.8%, while the percentage of G+C was 32.2%. There were 20 haplotypes obtained from 96 specimens among 8 geographic populations from Zhejiang Province. The overall haplotype diversity, nucleotide diversity and mean number of pairwise differences were 0.497, 0.717 and 0.001 05, respectively. Aedes albopictus population from Cangnan, Quzhou and Lishui showed higher genetic polymorphism than other sampling sites, and Aedes albopictus population from Cangnan, Quzhou showed moderate differentiation with other populations. A certain degree of genetic polymorphism and genetic differentiation were found in Aedes albopictus populations from Zhejiang, which may be caused by some factors such as environment, climate and humanity.

Keywords:Aedes albopictus; cytochrome C oxidase subunit I; polymorphism

國家十二五科技重大專項(No. 2012ZX10004-219)和2015年浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺計劃(骨干人才A類)(No. 2015RCA005)聯(lián)合資助

Supported by the Project of the State Scientific & Technological Development of the 12th Five Year Plan (No. 2012ZX10004-219) and the medical research program of Zhejiang Province (No. 2015RCA005)