融合免疫佐劑Lipo多肽與包膜蛋白EDIII區(qū)的登革病毒四價(jià)疫苗的構(gòu)建及免疫效應(yīng)研究

任守鳳，曹?chē)?guó)梅，譚　峰，梁韶暉，劉文權(quán)，潘長(zhǎng)旺

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融合免疫佐劑Lipo多肽與包膜蛋白EDIII區(qū)的登革病毒四價(jià)疫苗的構(gòu)建及免疫效應(yīng)研究

任守鳳，曹?chē)?guó)梅，譚峰，梁韶暉，劉文權(quán)，潘長(zhǎng)旺

溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲(chóng)學(xué)教研室,溫州325035

摘要：目的構(gòu)建編碼免疫佐劑Lipo多肽與登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII區(qū)的重組甲病毒載體，并在小鼠體內(nèi)研究其免疫效應(yīng)，為研制新型的登革病毒四價(jià)疫苗奠定基礎(chǔ)。方法先通過(guò)GS linker將編碼免疫佐劑Lipo多肽的基因序列與編碼登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII區(qū)的基因序列進(jìn)行串聯(lián)獲得LipoEDIII；然后將LipoEDIII基因插入甲病毒載體DREP的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建重組甲病毒載體DREP-LipoEDIII；將DREP-LipoEDIII轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，Western blot檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)；隨后將DREP-LipoEDIII免疫ICR小鼠，不加任何佐劑，再加強(qiáng)免疫2次后，通過(guò)ELISA檢測(cè)血清中的抗體效價(jià)和細(xì)胞因子的分泌情況來(lái)評(píng)價(jià)其免疫效應(yīng)。結(jié)果成功構(gòu)建了含有“融合免疫佐劑Lipo多肽與包膜蛋白EDIII區(qū)”的重組甲病毒質(zhì)粒DREP-LipoEDIII。DREP-LipoEDIII免疫小鼠后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，抗體效價(jià)為1∶160?？乖碳ば∈笃⒘馨图?xì)胞可以產(chǎn)生IFN-r 、IL-4、IL-10細(xì)胞因子，實(shí)驗(yàn)組的濃度明顯高于對(duì)照組。結(jié)論在不需要加入任何外源佐劑的情況下，本研究構(gòu)建的融合免疫佐劑Lipo多肽的登革四價(jià)疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，且以細(xì)胞免疫應(yīng)答為主，為今后新型登革病毒四價(jià)疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：登革病毒;包膜蛋白;甲病毒載體;四價(jià)疫苗

登革病毒(Dengue，DEN)屬于黃病毒科、黃病毒屬，包括4種血清型，均可以經(jīng)蚊媒傳播引起人類(lèi)登革熱[1]。初次感染登革病毒后所產(chǎn)生的抗體只能對(duì)相應(yīng)血清型的病毒產(chǎn)生保護(hù)作用，當(dāng)再次感染其它型別的病毒時(shí)，會(huì)由于抗體依賴(lài)性病毒感染增強(qiáng)作用(ADE)而加重病情，引起登革出血熱/登革休克綜合征[2]。所以一種理想的登革熱疫苗應(yīng)能夠同時(shí)誘導(dǎo)生成對(duì)四種血清型產(chǎn)生中和作用的持久抗體[3]。

登革病毒是一種單股正鏈RNA 病毒[4]。基因組含單一開(kāi)放讀碼框架，可以編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中登革病毒E基因DⅢ區(qū)(EDIII)具有多種型及亞型特異性的中和表位和宿主細(xì)胞受體結(jié)合位點(diǎn)，而且E蛋白位于病毒顆粒的脂質(zhì)雙層膜中，含有多種B 細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，是登革病毒的主要保護(hù)性抗原，是制備登革病毒亞單位疫苗的首選[5-7]。但是重組的EDIII抗原存在免疫原性差異，不能有效的誘導(dǎo)免疫保護(hù)作用。而脂質(zhì)體蛋白Lipo(liposome)被認(rèn)為是一種能夠有效提升免疫原性的佐劑[8]。研究證實(shí)，將Lipo多肽分別與DENV2和DENV4的EDIII融合表達(dá)后的重組蛋白能有效誘導(dǎo)特異性中和抗體的產(chǎn)生，并能降低產(chǎn)生ADE效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。因此，本研究擬利用連接肽(GS Linker)，將Lipo多肽與DENV1-4型的EDIII基因片段連接在一起，構(gòu)建四價(jià)EDⅢ融合基因的重組甲病毒載體疫苗，然后將構(gòu)建成功的四價(jià)重組質(zhì)粒免疫小鼠，研究重組質(zhì)粒的免疫原性及作為亞單位疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力，為登革病毒質(zhì)粒疫苗的研究奠定基礎(chǔ)[9-10]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒和菌株甲病毒載體DREP為本實(shí)驗(yàn)室保存。目的基因LipoEDIII由南京金斯瑞公司合成。大腸桿菌DH5a為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2細(xì)胞293細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR鼠(6～8周齡，雌性，清潔級(jí))購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.1.4主要儀器和試劑BcuI、SmaI和T4DNA連接酶等均購(gòu)自Fermantas公司，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購(gòu)自Fermantas公司， DNA 凝膠回收試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。LipofectaminTM2000購(gòu)自Invitrogen 公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，ECM830電轉(zhuǎn)移購(gòu)自BTX公司。

1.1.5引物設(shè)計(jì)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)合成的DEN1-4病毒株基因組E基因DIII區(qū)基因序列設(shè)計(jì)引物引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BcuI和SmaI用于后續(xù)重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII的構(gòu)建。引物設(shè)計(jì):上游引物：5′-TCCCCCGGGCTCGAGATGAA

GAAA- 3′(劃線部分是BcuI的酶切位點(diǎn));下游引物：5′-CGGACTAGTCTATCTAGAATGATGATGA-3′(劃線部分是SmaI的酶切位點(diǎn))。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII用PCR擴(kuò)增獲得含有目的基因LipoEDIII的一段序列，并用限制性內(nèi)切酶BcuI和SmaI進(jìn)行消化獲得目的基因LipoEDIII，目的基因大小約為1 500 bp.將其與經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶BcuI和SmaI消化的質(zhì)粒DREP用T4連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，用含抗生素卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選得到陽(yáng)性單克隆菌株，將篩選得到的陽(yáng)性菌株送去測(cè)序，用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.2質(zhì)粒DNA的大量制備采用E.Z.N.A.公司的Endo-free質(zhì)粒提取試劑盒(omega)提取質(zhì)粒DNA,包括空質(zhì)粒DREP，含登革1-4型病毒EDIII基因的重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII。具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。質(zhì)粒用PBS磷酸鹽緩沖液溶解，并采用紫外分光光度儀測(cè)定A260和A280值，以確定質(zhì)粒的純度和濃度。

1.2.3重組質(zhì)粒的檢測(cè)將重組質(zhì)粒DREP-LipoEDII轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中并用Western Blot的方法檢測(cè)目的基因LipoEDIII在293細(xì)胞中的表達(dá):轉(zhuǎn)染前將293細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，并加1 mL不含抗生素的完全培養(yǎng)基，以保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合達(dá)90%～95%。按照LipofectaminTM2000操作說(shuō)明，將重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII和空質(zhì)粒DREP分別轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，空質(zhì)粒DREP做對(duì)照組，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用Western Blot的方法檢測(cè)目的基因LipoEDIII在293細(xì)胞中的表達(dá)。

1.2.4免疫方案將ICR小鼠隨機(jī)分成3組，每組8只，第1-3組分別注射PBS磷酸鹽緩沖液、空質(zhì)粒DREP、重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII。每種質(zhì)粒DNA每只鼠均注射50 μg/次，免疫途徑采用腿部肌肉注射。注射后立即對(duì)注射部位進(jìn)行電刺激(EP)，電刺激的參數(shù)為：75 V、25 ms、 6次，每次間隔200 ms。免疫分3次進(jìn)行，在初次免疫之后的第2周和第4周各加強(qiáng)免疫1次，免疫劑量與初次免疫一致。分別于初次免疫后第0、2、4和6周通過(guò)剪尾取血，在第10周時(shí)通過(guò)眼眶取血，取血后分離血清用于抗體效價(jià)的檢測(cè)。

1.2.5體液免疫檢測(cè)ELIAS法檢測(cè)抗體效價(jià)，用本實(shí)驗(yàn)室制備純化的登革病毒四價(jià)重組蛋白TetEDIII包被ELIAS板，用倍比稀釋的小鼠血清為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗，TMB顯色液進(jìn)行顯色，抗體效價(jià)通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定的450 nm波長(zhǎng)的OD值獲得，抗體效價(jià)通過(guò)一抗的稀釋比表示。

1.2.6細(xì)胞因子檢測(cè)1)脾淋巴細(xì)胞懸液的制備：將小鼠眼眶取血后頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下剖開(kāi)小鼠腹腔取脾，將脾臟放入1 mlL 1640細(xì)胞培養(yǎng)液中清洗，將清洗過(guò)的脾臟置于400目濾網(wǎng)上，用5 mL注射器內(nèi)芯輕輕研磨，不斷向組織上滴加RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，直至組織內(nèi)絕大部分細(xì)胞被分離，將細(xì)胞懸液小心加于含有淋巴細(xì)胞分離液的15 mL離心管中，細(xì)胞懸液要加于淋巴細(xì)胞分離液的液面之上。18 ℃-22 ℃，400 g離心20 min。離心后，用吸管小心洗出分離液上層(包含淋巴細(xì)胞的細(xì)胞層)0.5 cm以上的上清部分，棄去。用吸管小心吸取分離液層及淋巴細(xì)胞層至于另一新離心管內(nèi)。然后加10 mL PBS緩沖液混勻，250 g離心10 min，棄上清，用吸管以5 mL PBS緩沖液重懸所得細(xì)胞，250 g離心10分鐘棄上清，加1 mL含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將脾細(xì)胞濃度用含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整到107/mL。2)細(xì)胞因子的檢測(cè)：將脾淋巴細(xì)胞懸液稀釋到1×106/mL加到96孔板(100 μL/孔)，然后加入登革病毒四價(jià)重組蛋白(5 μg/mL)抗原刺激脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，用刀豆素(ConA 5 μg/mL)做陽(yáng)性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)上清，-80 ℃保存?zhèn)溆?，測(cè)定細(xì)胞因子的濃度。

2結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII構(gòu)建將空質(zhì)粒DREP的結(jié)構(gòu)基因CE1E2用目的基因LipoEDIII替換構(gòu)建重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII。

2.2LipoEDIII基因的PCR擴(kuò)增及克隆酶切鑒定

PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果顯示1條大約1 500 bp的DNA片段，與擬擴(kuò)增基因片段的大小相符，見(jiàn)圖2A。重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII經(jīng)過(guò)酶BcuI和酶SmaI雙酶切后，也可得到一條大小約為1 500 bp的DNA片段,見(jiàn)圖2B。結(jié)果表明重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII構(gòu)建成功。

2.3重組質(zhì)粒DREP-LipoEDII的轉(zhuǎn)染和蛋白表達(dá)

圖1　重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII構(gòu)建示意圖

Fig.1Schematic diagram of the recombinant plasmid DREP-LipoEDIII

A： PCR擴(kuò)增LipoEDIII基因；M: DL2502 DNA標(biāo)志物;1：陰性對(duì)照;2，3：目的基因LipoEDIII

B：重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII雙酶切鑒定；M: DL2503 DNA 標(biāo)志物 1：DREP-LipoEDIII/BcuI-SmaI

A： PCR amplification of LipoEDIII gene; M: DL2502 DNA marker; 1: Negative control; 2, 3： LipoEDIII gene;

B: Identification of recombinant plasmid DREP-LipoEDIII by restriction enzyme;

M: DL2503 DNA marker; 1: DREP-LipoEDIIIdigested by BcuI and SmaI.

圖2LipoEDIII基因的擴(kuò)增和鑒定

Fig.2Amplification and identification of LipoEDIII gene

檢測(cè)按照LipofectaminTM2000操作說(shuō)明，將重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII和空質(zhì)粒DREP分別轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞，通過(guò)Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒在293細(xì)胞中的表達(dá)。LipoEDIII重組蛋白大小約為48 Kd，Western Blot結(jié)果顯示構(gòu)建的重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII能夠在293細(xì)胞中成功表達(dá)，且表達(dá)的蛋白能被質(zhì)粒免疫的小鼠血清所識(shí)別，如圖3A所示。同時(shí)，利用通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備的登革病毒四價(jià)EDIII重組蛋白TetEDIII也能被質(zhì)粒免疫的小鼠血清所識(shí)別，如圖3B所示。

2.4抗體的產(chǎn)生水平及動(dòng)態(tài)觀察不同時(shí)間對(duì)注射了重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII，空質(zhì)粒DREP及注射PBS磷酸鹽緩沖液的各8只小鼠取血，分離血清，用間接ELIAS法檢測(cè)抗體產(chǎn)生水平。結(jié)果顯示注射了重組質(zhì)粒的小鼠抗體效價(jià)隨時(shí)間延長(zhǎng)而不斷升高，第3次免疫后達(dá)高峰并能維持一段時(shí)間，抗體效價(jià)為1∶160，如圖4。

A．Western Blot檢測(cè)重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII在293細(xì)胞中的表達(dá)，一抗為DREP-LipoEDIII質(zhì)粒免疫小鼠的血清；1：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)； 2：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII的293細(xì)胞的樣品； 3：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒DREP的293細(xì)胞的樣品

B．DREP-LipoEDIII質(zhì)粒免疫小鼠的血清對(duì)登革病毒四價(jià)EDIII重組蛋白TetEDIII的識(shí)別；1：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)； 2：通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備并純化的TetEDIII蛋白；3：Western Blot檢測(cè)重組質(zhì)粒免疫小鼠血清對(duì)純化的TetEDIII蛋白的識(shí)別，一抗為DREP-LipoEDIII質(zhì)粒免疫小鼠的血清

A: The expression identification of recombinant plasmids DREP-LipoEDIII in 293 cells; 1: Protein molecular weight marker; 2: Cell samples transfected with plasmid DREP-LipoEDIII; 3. Cell samples transfected with plasmid DREP.

B: The recognition of recombinant TetEDIII derived fromE.coliexpression system by using the serum of DREP-LipoEDIII immunized mouse; 1: Protein molecular weight marker; 2: Purified TetEDIII protein by SDS-PAGE; 3: Western Blot identification of TetEDIII protein by the serum of DREP-LipoEDIII immunized mouse.

圖3LipoEDIII蛋白的表達(dá)和鑒定

Fig.3Expression and identification of Lipo EDIII protein

重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體于第2次加強(qiáng)免疫是抗體效價(jià)明顯升高達(dá)1∶80，第3次加強(qiáng)免疫之后達(dá)高峰，抗體效價(jià)為1∶160并維持一段時(shí)間。

圖4重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII免疫小鼠抗體效價(jià)檢測(cè)

Fig.4Changes of antibody titers in mice immunized with recombinant plasmid DREP-LipoEDIII

2.5細(xì)胞因子檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集上清測(cè)定細(xì)胞因子IFN-r，IL-4和IL-10。 其中，與空質(zhì)粒DREP免疫組和PBS免疫組相比，重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII免疫組均能誘導(dǎo)較高水平的IFN-r，IL-4和IL-10，分別為57 pg/mL, 22 pg/mL和120 pg/mL，如圖5A，5B，5C所示， 說(shuō)明重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，包括Th1和Th2反應(yīng)。

重組質(zhì)粒DREP-LipoEDIII免疫組，空質(zhì)粒DREP免疫組和PBS免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞分別用重組蛋白LipoEDIII，刀豆素(ConA)和細(xì)胞培養(yǎng)液刺激后，檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-r(A)，IL-4(B),IL-10(C)的分泌情況

The mice spleen lymphocytes of recombinant plasmid DREP-LipoEDIII group, plasmid DREP group and PBS group were stimulated respectively by dengue LipoEDIII recombinant protein, ConA and media to detect IFN-r, IL-4, and IL-10.

圖5免疫小鼠細(xì)胞因子檢測(cè)

Fig.5Cytokine detection of immunized mouse

3討論

到目前為止，尚未研制出安全有效的登革疫苗來(lái)預(yù)防此疾病的發(fā)生[11-12]。DNA疫苗是近年出現(xiàn)的一種新型疫苗，現(xiàn)已成為病毒疫苗研究的熱點(diǎn)[13]。由于DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答往往不夠理想，所以通過(guò)優(yōu)化免疫方案來(lái)提高質(zhì)粒DNA的免疫原性就成為目前DNA疫苗的研究熱點(diǎn)。本研究首先通過(guò)融合免疫佐劑脂質(zhì)體蛋白提高質(zhì)粒DNA的免疫原性，其次，通過(guò)電刺激的方法提高質(zhì)粒DNA的吸收效率從而提升質(zhì)粒DNA的免疫原性[14]。

在DNA免疫中，研究者大多采用肌肉注射的方法進(jìn)行免疫，由于肌細(xì)胞吸收DNA的效率較低，所以免疫應(yīng)答往往不夠理想。目前，電擊技術(shù)在體外已被廣泛應(yīng)用，主要用于將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞和細(xì)菌中，它主要是將短的電脈沖作用于靶細(xì)胞，穿透細(xì)胞膜，以便有利于細(xì)胞吸收DNA。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)組織如果加上電場(chǎng)也可以顯著提高DNA的吸收效率[15-16]。因此，我們每次注射質(zhì)粒DNA后，立刻對(duì)注射部位進(jìn)行電刺激，以提高肌細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒DNA的攝入效率，從而增強(qiáng)質(zhì)粒DNA的免疫原性。

本研究使用的是甲病毒載體DREP，甲病毒是一類(lèi)RNA病毒，能夠在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)大量復(fù)制[17]。甲病毒載體是用外源基因替換結(jié)構(gòu)蛋白基因的載體，仍具有甲病毒的宿主感染譜廣泛、能夠自我復(fù)制、誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)生凋亡等眾多生物學(xué)特性，同時(shí)能夠大量表達(dá)外源基因，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高效的免疫反應(yīng)，并不易與宿主基因組整合。因此，質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞后能夠自我復(fù)制，提高DNA的表達(dá)效率[18]。

與混合的重組疫苗相比，單一的多價(jià)疫苗具有成本低等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究采用將登革病毒1-4型的EDIII基因連接在一起，構(gòu)建四價(jià)登革病毒疫苗，從而更好的發(fā)揮免疫保護(hù)作用[19]。

本研究所構(gòu)建的融合免疫佐劑Lipo多肽與包膜蛋白EDIII區(qū)的登革病毒四價(jià)疫苗在小鼠體內(nèi)具有較好的免疫原性，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，不僅誘導(dǎo)Th1反應(yīng)而且還誘導(dǎo)Th2反應(yīng)，為新型登革病毒疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.004

通訊作者：劉文權(quán),Email：liuwq101@wzmc.edu.cn

Corresponding author:Liu Wen-quan, Email: liuwq101@wzmc.edu.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：R373

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)02-0119-05

收稿日期：2015-05-18；修回日期:2015-11-23

Construction of fusion immunoadjuvants Lipo peptides and envelope protein EDIII dengue virus tetravalent vaccine and its immune effect

REN Shou-feng,CAO Guo-mei,TAN Feng,LIANG Shao-hui,LIU Wen-quan,PAN Chang-wang

(Department of Human Parasitology, School of Basic Medical Science, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035, China)

Abstract:We constructed a recombinant tetravalent DENV alphavirus vaccine coding of immunoadjuvants Lipo peptides and dengue virus type 1-4 envelope protein EDIII zone and studied its immune response in mice. Firstly, the gene sequence encoding immunoadjuvants Lipo and the gene sequence encoding dengue virus type 1-4 envelope protein EDIII zone was connected by GS linker to obtain LipoEDIII. Then, the gene LipoEDIII was inserted into the multiple cloning site of the alphavirus vector DREP to construct the recombinant alphavirus vector DREP-LipoEDIII. Furthermore, the 293 cells were transfected with the recombinant alphavirus vector DREP-LipoEDIII, the fusion protein expression was detected by Western blot. At last, the ICR mice were immunized with DREP-LipoEDIII without any adjuvant. The antibody titers in serum and the secretion of cytokines were detected by ELISA after the twice booster to evaluate the immune response. The mice immunized with DREP-LipoEDIII could induce specific antibodies and the antibody titer was 1∶160. The mouse spleen lymphocytes stimulated by antigen could produce cytokine including IFN-r, IL-4, IL-10, which were significantly higher in the experimental group. Our studies indicates that the tetravalent DENV alphavirus vaccine containing the fusion Lipo peptides can induce specific humoral and cellular immune responses in mice without adding any exogenous adjuvant, which laid the foundation for the research of novel tetravalent dengue virus vaccine in the future.

Keywords:dengue virus; envelope protein; alphavirus vector; tetravalent vaccine

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.LY13C080001)資助

Supported by the Natural Science Project of Zhejiang Province (No. LY13C080001)