拳參中沒食子酸和總鞣質(zhì)的含量測定

婁華勇， 劉亞洲,2， 張文芳,3， 潘衛(wèi)東*

( 1. 貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室， 貴陽 550002； 2. 貴州大學(xué)生命科學(xué)院， 貴陽 550025； 3. 貴陽中醫(yī)學(xué)院， 貴陽 550002 )

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拳參中沒食子酸和總鞣質(zhì)的含量測定

婁華勇1， 劉亞洲1,2， 張文芳1,3， 潘衛(wèi)東1*

( 1. 貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室， 貴陽 550002； 2. 貴州大學(xué)生命科學(xué)院， 貴陽 550025； 3. 貴陽中醫(yī)學(xué)院， 貴陽 550002 )

摘要：該研究采用高效液相色譜法和紫外分光光度法分別對拳參中的主要成份——沒食子酸以及總鞣質(zhì)進行含量測定。其中，用高效液相色譜法測定沒食子酸的含量，HPLC條件為Hypersil GOLD Phenyl 柱 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，甲醇-0.1%磷酸梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為276 nm。用紫外分光光度法測定總鞣質(zhì)的含量，采用2010版《中國藥典》一部附錄XB中鞣質(zhì)含量測定方法，用干酪素沉淀鞣質(zhì)，通過干酪素沉淀前后鞣質(zhì)的變化來確定樣品中總鞣質(zhì)的含量。結(jié)果表明：沒食子酸在0.051～1.02 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為99.1%、100.3%、101.9%，RSD分別為2.1%、0.8%、2.0%；總鞣質(zhì)在2.09～10.48 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為102.2%、100.2%、102.1%，RSD分別為1.3%、1.4%、1.0%。利用上述方法，還測定了貴州貴陽和四川成都各3批樣品中沒食子酸和總鞣質(zhì)的含量差異，發(fā)現(xiàn)成都樣品中的沒食子酸與總鞣質(zhì)均大于貴陽拳參中的含量，初步分析導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能與拳參的生長海拔有關(guān)，而成都的海拔范圍更適合拳參的生長。上述兩種方法快速、簡單、重現(xiàn)性好，可以作為拳參中沒食子酸和總鞣質(zhì)的含量測定方法，而該方法也是首次被用來同時測定拳參中沒食子酸和總鞣質(zhì)的含量，為今后的地方藥典標(biāo)準(zhǔn)甚至《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的補充和完善提供了重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：拳參， 沒食子酸， 鞣質(zhì)， 高效液相色譜

拳參為蓼科蓼屬(Polygonum) 植物拳參(Polygonumbistorta)的根莖，多年生草本，別名紫參、牡蒙、山是、草河車、倒根草，一般春、秋季挖取根莖，除去須根，洗凈，曬干。主產(chǎn)華北、西北及山東、江蘇、湖北等地。含有鞣質(zhì)、淀粉、糖及果膠等(劉曉秋等，2004)，其中主要含有的鞣質(zhì)是沒食子酸，并沒食子酸以及可水解鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)(Duwiegua et al, 1999)。氣味無臭，味干澀，性涼，具有清熱解毒、止瀉、止血、鎮(zhèn)驚息風(fēng)等功效(曾靖等，2003；黃玉珊等，2004)，常用治療腸炎、痢疾、肝炎、熱病腫痛、破傷風(fēng)、毒蛇咬傷、口腔炎、赤痢膿血、咽喉炎等病癥。現(xiàn)代抗菌實驗表明拳參對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、枯草桿菌等均有抗菌作用(劉春棋等，2006)。其里面含有的大量鞣質(zhì)也有收澀止瀉的作用，因此，對中藥拳參的研究具有重要的意義和價值。

近年來，國內(nèi)對拳參中沒食子酸的含量也有文獻報道(黃加寶等，2007；劉瑞等，2005)。但中國藥典對其含量的測定方法卻沒有具體標(biāo)準(zhǔn)，而對拳參中總鞣質(zhì)的含量測定目前尚未見有文獻報道。因此，本文將對拳參中沒食子酸及總鞣質(zhì)的含量測定進行條件優(yōu)化及探索，希望找到一條切實可行的測定方法，為今后藥典標(biāo)準(zhǔn)的提升提供一定依據(jù)。

1材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent-1100高效液相色譜系統(tǒng)(G1311A泵、G1315A DVD檢測器、Agilent色譜工作站)，紫外光譜(UV)為惠普HP-1200紫外分光光度測定儀，SG5200H超聲波清洗儀(河南兄弟儀器設(shè)備有限公司)，梅特勒-托利多AL204電子天平(上海速展計量儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(B-480，瑞士Buchi)，磷鉬鎢酸試液(按《中華人民共和國藥典》2010版一部附錄XVB配置)；干酪素(化學(xué)純)，色譜純乙腈和甲醇為天津登科化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，水為重蒸水并經(jīng)0.45SymbolmA@m水系濾膜過濾，其他試劑均為分析純。

沒食子酸對照品(購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司)，純度≥98%。拳參藥材為貴陽和成都不同批號產(chǎn)品。

1.2 沒食子酸的含量測定

1.2.1 色譜條件色譜柱為Hypersil GOLD Phenyl柱 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，流動相A為甲醇，B為0.1%磷酸溶液；梯度洗脫(0 min, 5% A; 10 min, 20% A; 20 min, 60% A)；柱溫30 ℃，檢測波長為276 nm，流速為1 mL·min-1，進樣量10 μL。

1.2.2 對照品溶液的配置精密稱取沒食子酸對照品10.3 mg到100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，再精密量取25 mL到50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度制成51.5 μg·mL-1的對照品溶液，備用。

1.2.3 供試品溶液的制備精密稱取拳參粉末(均過60目篩)約1 g，置于100 mL具塞三角瓶中，加85%甲醇25 mL，超聲提取兩次，每次30 min，過濾，用85%甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，甲醇定容，以0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液(范曉紅等，2011)，備用。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備按“1.2.1”的色譜條件，精密吸取對照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL進樣，測定峰面積，并以色譜峰峰面積對對照品的量回歸(包括原點)制作回歸方程。

1.2.5 方法學(xué)考察沒食子酸對照品溶液，重復(fù)進樣6次，以考察方法的精密度；分別取拳參樣品溶液6份，按供試品溶液的制備方法制備后進樣，以考察方法的重復(fù)性；將拳參樣品溶液分別于0、3、6、9、12、24 h后進樣，以考察樣品的穩(wěn)定性；精密稱取已知沒食子酸含量的拳參粉末1 g，加入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，混合后按照“1.2.3”項下方法處理，按照“1.2.1”色譜條件進樣。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算回收率。

1.2.6 樣品的含量測定分別取貴陽和成都不同批號的拳參粉末1 g，各2份，精密稱定，按照“1.2.3”項下方法處理，按照“1.2.1”色譜條件測定，計算各批號沒食子酸的含量。

1.3 總鞣質(zhì)的含量測定

1.3.1 對照品溶液的配置精密稱取沒食子酸對照品52.42 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL至50 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得沒食子酸對照品溶液52.42 μg·mL-1，備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于25 mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1 mL，再分別加水11、10、9、8、7 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，以相應(yīng)的容積作為空白，照紫外-可見分光光度法(中國藥典2010版，附錄ⅤA)，30 min后，在760 nm波長下測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)(y)，濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 供試品的制備分別取不同批號的拳參粉末1 g，至50 mL棕色量瓶中，加蒸餾水25 mL，放置過夜，超聲處理30 min，放冷，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置，過濾，殘渣再加25 mL蒸餾水超聲30 min，過濾，合并濾液至100 mL棕色量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.4 總鞣質(zhì)的計算(1)總酚測定：精密量取供試品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，照“1.3.2”項下的方法，至“加入磷鉬鎢酸試液1 mL”起，加水10 mL，依法測定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算供試品溶液中總酚的量。(2)不被吸附的多酚：取供試品溶液25 mL，加至已盛有干酪素0.6 g的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，至30 ℃水浴中保溫1 h，時時振搖，取出，放冷，搖勻，過濾，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1 mL”起，加水10 mL依法測定吸收值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算供試品溶液中不被吸附的多酚含量。按下式計算總鞣質(zhì)的含量：鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸附的多酚量(粟世婷等，2008；謝道剛等，2006；胡小剛等，2001)。

1.3.5 方法學(xué)考察精密量取對照品溶液2 mL，置于25 mL棕色量瓶中，按“1.3.2”項下方法，至“加入磷鉬鎢酸試液1 mL，再加水10 mL”起，在760 nm下連續(xù)6次測定吸光度，以考察方法的精密度；分別取拳參粉末6份，精密稱定，按“1.3.3”項下方法平行制備供試品溶液，按“1.3.4”項下測定并計算樣品中總鞣質(zhì)的含量，以考察方法的重復(fù)性；分別在0、3、6、9、12、24 h時間點精密量取供試品溶液2 mL，置于25 mL棕色量瓶中，按“1.3.2”項下方法，至“加入磷鉬鎢酸試液1 mL，再加水10 mL”起，在760 nm下測定吸光度，以考察樣品的穩(wěn)定性；精密稱取已知含量的拳參粉末0.5 g，加入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按“1.3.3”項下方法處理，按“1.3.4”方法測定并計算樣品中總鞣質(zhì)的加樣回收率。

2結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜及方法學(xué)考察

由圖1可知，沒食子酸在該色譜條件下可實現(xiàn)較好的分離，根據(jù)沒食子酸峰面積(A)對對應(yīng)的進樣量(m)進行線性回歸，得回歸方程為A=2 376m+6.144(R2= 0.999)，由此可知，沒食子酸在0.051～1.02 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；沒食子酸對照品在重復(fù)進樣6次的情況下，RSD為0.57% (n=6)，表明儀器精密度良好；取同一產(chǎn)地樣品6份按“1.2.3”項下方法進行制備后進樣，測得沒食子酸峰面積的RSD為1.68%(n=6)，表明該方法的重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗表明，拳參樣品溶液的RSD為0.63%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；由表1可知，沒食子酸高、中、低濃度的平均回收率分別為99.1%、100.3%、101.9%，RSD分別為2.1%、0.8%和2.0%，表明方法的精密度好。

圖 1　沒食子酸對照品溶液(A)和供試品(B)的HPLC圖譜Fig. 1　HPLC chromatograms of gallic acid (A) and sample (B)

項目Item理論含量Academiccontent(mg)加入量Addedcontent(mg)測得量Contentofresult(mg)回收率Recoveryrate(%)平均回收率Averagerecoveryrate(%)RSD(%)高濃度Highconcentration1.2271.4762.68498.71.2251.4762.64996.51.2271.4762.736102.299.12.1中濃度Mediumconcentration1.2281.232.44799.11.2251.232.468101.11.2251.232.463100.7100.30.8低濃度Lightconcentration1.2230.9842.238103.21.2260.9842.246103.61.2250.9842.19798.8101.92.0

表 2　總鞣質(zhì)回收率試驗結(jié)果

2.2 總鞣質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法學(xué)考察

按“1.3.2”項下方法，以吸光度為縱坐標(biāo)(y)，濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算得回歸方程為y=0.107x+0.007(R2=0.9985)，表明該方法在2.09～10.48 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；精密度實驗結(jié)果RSD為1.5%，表明精密度良好；重復(fù)性實驗RSD值為2.7%，表明方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性實驗RSD為1.9%，表明穩(wěn)定性良好；表2顯示，總鞣質(zhì)高、中、低濃度的平均回收率分別為102.2%、100.2%、102.1%，RSD分別為1.3%、1.4%和1.0%，表明方法的精密度好。

2.3 沒食子酸及總鞣質(zhì)的含量測定

精密稱取貴陽和成都不同批號的拳參粉末，分別按照供試品的制備方法制備，再按照沒食子酸和總鞣質(zhì)的含量測定方法分別測定，結(jié)果見表3。

表 3　拳參中沒食子酸和總鞣質(zhì)的含量測定結(jié)果

由表3結(jié)果可知，貴陽各批號拳參中沒食子酸和總鞣質(zhì)的含量分別為1.53、1.37、1.12和5.01、4.87、5.23 mg·g-1；成都各批號拳參中沒食子酸和總鞣質(zhì)的含量分別為2.72、3.35、2.46和10.21、11.46、11.22 mg·g-1。初步分析，導(dǎo)致兩地中沒食子酸和總鞣質(zhì)含量差異的原因估計與海拔有一定的關(guān)系。拳參生長海拔一般為800～3 000 m，貴陽海拔范圍為800～1 600 m，而成都海拔大多為1 000～3 000 m。相比之下，成都地理地貌更適合拳參的生長，這極有可能導(dǎo)致沒食子酸和總鞣質(zhì)的含量相對于貴陽拳參較高。

3討論與結(jié)論

3.1 最佳波長的選擇

對沒食子酸對照品甲醇溶液的紫外可見光(190～600 nm)掃描發(fā)現(xiàn)，沒食子酸在276 nm處有最大吸收波長，故選擇276 nm為其檢測波長。

總鞣質(zhì)的測定采用磷鉬鎢酸一碳酸鈉比色法。分別精密吸取沒食子酸對照品溶液和供試品溶液2.0 mL置于25 mL棕色量瓶中，加1.0 mL磷鉬鎢酸試液，再分別加水10 mL，用29%碳酸鈉溶液定容，搖勻，放置30 min，以試劑空白為參比，在400～900 nm間進行波長掃描，結(jié)果顯示沒食子酸對照品溶液和供試品溶液在760 nm處均有最大吸光度，故選擇760 nm為測定波長。

3.2 色譜柱的選擇

分別選擇SinoChrom C8、BDS HYPERSIL Cyano和BDS HYPERSIL C18，均發(fā)現(xiàn)峰形拖尾嚴(yán)重，且分離度不好。因考慮到苯基柱的填料對酚羥基有較好的保護作用，適合用來分離多酚類化合物，后改用Hypersil GOLD Phenyl后，峰形和分離度均較好。

3.3 流動相的選擇

流動相分別考察了甲醇-0.1%醋酸、甲醇-0.4%醋酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.4%磷酸、乙腈-0.1%醋酸、乙腈-0.4%醋酸、乙腈-0.1%磷酸，發(fā)現(xiàn)流動相為甲醇-0.1%磷酸時，峰形較好，其他條件下，色譜峰較拖尾，故選用甲醇-0.1%磷酸為流動相。

3.4 提取溶劑的選擇

分別用100%、85%、50%甲醇以及純水對拳參進行小試提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)80%的甲醇提取時，沒食子酸的含量最大，故選用85%的甲醇作為提取溶劑；用丙酮、50%丙酮以及純水對拳參進行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純水提取物中總鞣質(zhì)的含量最大，故選用純水作為提取溶劑。

鞣質(zhì)在20世紀(jì)的研究中常作為雜質(zhì)除去，隨著研究的深入，因其具有廣泛的藥理活性而越來越受到研究者的關(guān)注。沒食子酸以及鞣質(zhì)是拳參中的有效成分之一，本研究分別用HPLC和UV等方法對兩者進行含量測定，有效地避免了其他成分對測定的干擾，其精密度高、方法穩(wěn)定可靠，可作為藥材質(zhì)量控制的方法。

本研究分別測定了貴陽和成都各批號拳參，從結(jié)果可知，成都拳參中的沒食子酸和總鞣質(zhì)的含量均大于貴陽拳參，這為今后對拳參藥材的選定提供了一定的理論依據(jù)。

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Determination of gallic acid and total tannins inPolygonumbistorta

LOU Hua-Yong1, LIU Ya-Zhou1,2, ZHANG Wen-Fang1, 3, PAN Wei-Dong1*

( 1.KeyLaboratoryofChemistryforNaturalProductsofGuizhouProvinceandChineseAcademyofSciences, Guiyang 550002, China; 2.CollegeofPharmacyGuizhouUniversity, Guiyang 550025, China; 3.GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine, Guiyang 550002, China )

Abstract:To further complement and perfect about content of Chinese Pharmacopoeia, the major component-gallic acid and total tannins in Polygonum bistorta were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) and ultraviolet (UV) spectrophotometric methods for the essay, respectively. The HPLC condition for determination of gallic acid with Hypersil GOLD phenyl column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) and a mobile phase consisted of methanol and 0.1% phosphoric acid by gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was 276 nm by wavelength scanning from 190-400 nm. On the other side, the total tannins were determined by Casein Method according to appendices XB in Pharmacopoeia of the People’s Republec of China (2010 ed), and the results were obtained by calculating the contend chang of total tannins before and after combination with the casein. The results showed that the linear range was 0.051-1.02 μg for gallic acid, the average recovery rates were 99.1%, 100.3%, 101.9%, and RSDs were 2.1%, 0.8%, 2.0%, respectively. The linear range was 2.09-10.48 μg for the total tannins, the average recovery rates were 102.2%, 100.2%, 102.1%, and RSDs were 1.3%, 1.4%, 1.0%, respectively. The investigation indicated that both methods had a preferable result for methodology validation. On the other hand, the essay also researched the P. bistorta from Guizhou and Sichuan, respectively, and the results showed that the conten of gallic acid and total tannins in P. bistorta had a great difference both Guizhou and Sichuan, the gallic acid and total tannins in P. bistorta from Guiyang were 1.53, 1.37, 1.12 mg·g-1and 5.01, 4.87, 5.23 mg·g-1, respectively. And gallic acid and total tannins in P. bistorta were 2.72, 3.35, 2.46 mg·g-1and 5.01, 4.87, 5.23 mg·g-1from Chengdu, respectively. A preliminary analysis on this issue was made with many factors, as far as we know, the deciding factor should be the altitude. The references showed that the best condition for P. bistorta was an elevation from 800 to 3 000 m, while, the altitude of Guiyang at range of 800 to 1 600 m and altitude at range of 1 000 to 3 000 m for Chengdu. So, we belived that altitude of Chengdu was more amenable to the efficient growth of the P. bistorta, which futher caused the contents of gallic acid and total tannins relatively higher than Guiyang. The results provide a theory basis for pharmaceutical company to select P. bistorta for producing drugs. The research revealed that those methods were rapid, simple and reproducible and could be used to determine gallic acid and total tannins in P. bistorta. However, methods were the first to be used for determine gallic acid and total tannins in P. bistorta simultaneously, these data provide a basis for the further complement and perfect about content of Chinese Pharmacopoeia.

Key words:Polygonum bistorta, gallic acid, tannin, HPLC

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201405050

收稿日期:2014-05-26修回日期：2015-01-27

基金項目：中國科學(xué)院“西部之光”人才培養(yǎng)計劃項目[Supported by the West Light Foundation of Chinese Academy of Sciences]。

作者簡介：婁華勇(1987-)，男，貴州遵義人，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物的研究，(E-mail)lhy87823@163.com。 *通訊作者：潘衛(wèi)東，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向為天然產(chǎn)物的研究，(E-mail)wdpan@163.com。

中圖分類號：Q946.84

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)06-0752-06

婁華勇，劉亞洲，張文芳，等. 拳參中沒食子酸和總鞣質(zhì)的含量測定[J]. 廣西植物， 2016， 36(6)：752-757

LOU HY,LIU YZ,ZHANG WF，et al. Determination of gallic acid and total tannins inPolygonumbistorta[J]. Guihaia， 2016， 36(6)：752-757