中華眼鏡蛇毒口服和靜脈注射單次給藥對小鼠毒性作用的比較

張　甜，薛　潔，王響英，朱路佳，孫志紅，秦正紅*

1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院， 蘇州　215000 2.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院電鏡室， 蘇州　215000 3.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院法醫(yī)系， 蘇州　215000

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·論著·

中華眼鏡蛇毒口服和靜脈注射單次給藥對小鼠毒性作用的比較

張?zhí)?，薛潔1，王響英2，朱路佳1，孫志紅3*，秦正紅1*

1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院， 蘇州215000 2.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院電鏡室， 蘇州215000 3.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院法醫(yī)系， 蘇州215000

[摘要]目的： 比較中華眼鏡蛇毒(NNAV)經(jīng)口灌服、靜脈注射兩種染毒途徑的半數(shù)致死量(LD50)，觀察兩種染毒途徑小鼠的急性中毒癥狀，尋找可能發(fā)生毒性作用的靶器官。方法： 小鼠經(jīng)口灌服、靜脈注射NNAV后，測定半數(shù)致死量(LD50)。觀察14 d內(nèi)小鼠的活動、體征及死亡情況，并對死亡小鼠和存活14 d小鼠的主要臟器進行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果： 小鼠經(jīng)口灌服、靜脈注射NNAV的LD50分別為102.3、0.624 mg/kg，95%CI 84.9～123、0.572～0.680 mg/kg。NNAV經(jīng)口灌服小鼠中毒癥狀出現(xiàn)快，喘息、強直性抽搐、呼吸抑制、心衰很快死亡；急性中毒受損器官主要為肺毛細血管充血，局部肺泡間隔增寬伴少量炎性細胞浸潤；肝血管充血。NNAV靜脈注射小鼠中毒癥狀為癱臥、呼吸功能麻痹，心肺功能衰竭而死亡。急性中毒受損器官主要為肺泡腔內(nèi)及細支氣管內(nèi)有紅細胞，血管壁周圍有水腫；肝細胞彌漫性腫大，致肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細胞腫脹，基質(zhì)稀疏，有的呈氣球樣變，肝血竇受壓變狹或消失。結(jié)論： NNAV口服染毒的毒性劑量明顯低于靜脈注射，二種染毒途徑動物急性中毒器官的受損程度也有所不同；NNAV兩種染毒途徑存活14 d的小鼠其組織病理改變均可恢復(fù)。

[關(guān)鍵詞]中華眼鏡蛇毒；急性毒性試驗；小鼠；呼吸衰竭

眼鏡蛇毒為眼鏡蛇科動物眼鏡蛇毒腺分泌的毒液，是以神經(jīng)毒為主的混合毒[1-3]，是世界上最毒的動物毒素之一。文獻報道眼鏡蛇毒毒性、化學(xué)成分、生物學(xué)活性存在地域性差別[4-5]，而且蛇毒口服給藥能否被吸收存在爭議。我們在NNAV的藥理、藥效研究中，對江西余江彩虹養(yǎng)蛇場提供的NNAV進行了兩種染毒途徑的單次給藥毒性測定[6]，以比較口服與靜脈注射NNAV產(chǎn)生的毒性作用，并鑒定主要器官損傷的程度。為研究NNAV的給藥途徑和給藥劑量的設(shè)計提供依據(jù)，并可為NNAV臨床應(yīng)用中毒反應(yīng)的監(jiān)測提供參考。

1材料與方法

1.1藥物配制名稱：中華眼鏡蛇毒；提供單位：江西余江彩虹養(yǎng)蛇場；批號：201106。

1.2實驗動物ICR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18 ～ 22 g，上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號碼SCXK(滬)2007-0005。動物置于SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.3動物分組與藥物配制

1.3.1預(yù)試驗用少量動物，按階梯法染毒，初步確定NNAV對小鼠經(jīng)口灌服(ig)、靜脈注射(iv)兩種染毒途徑的0%致死量(Dn)和100%致死量(Dm)[4]。根據(jù)接近死亡率0%和100%的劑量范圍，按公式[5]k=1/lg-1[(lgDm-lgDn)/(n-1)]計算正式試驗的劑量公比k，公式中n為預(yù)分組數(shù)。

1.3.2正式試驗根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，NNAV經(jīng)口灌服，在Dn和Dm間選設(shè)6個劑量組，并按公式計算出劑量公比k=0.757，6個劑量組分別為：200.0、151.4、114.6、86.76、65.68、49.72 mg/kg。NNAV用蒸餾水按等比稀釋法配制6個劑量的藥物溶液[4]；靜脈注射在Dn和Dm間選設(shè)5個劑量組，并按公式計算出劑量公比k=0.85，5個劑量組分別為：0.824、0.700、0.595、0.506、0.430 mg/kg。NNAV用生理鹽水按等比稀釋法配制5個劑量的藥物溶液，兩種染毒途徑同時設(shè)溶劑組作為空白對照。每組10只小鼠，雌雄各半，灌胃染毒前需禁食12 h，自由飲水，靜脈注射染毒的動物自由進食、飲水。每只小鼠按10 mL/kg容積染毒，染毒后立即觀察和記錄中毒癥狀和死亡情況，觀察期為14 d，染毒前與染毒后3、7、14 d測量體質(zhì)量。用Bliss法計算半數(shù)致死量(LD50)及其95%可信限。

1.3.3組織病理學(xué)檢查對試驗期內(nèi)死亡小鼠和觀察期結(jié)束后的小鼠進行剖檢，肉眼觀察各臟器的改變。迅速切取1 mm3大小的肺組織放入電鏡組織固定液4%的戊二醛(預(yù)冷)中固定，同時另取腦、心、肺、肝、脾、腎等主要器官用光鏡組織固定液4%甲醛固定。電鏡按常規(guī)組織處理、包埋、聚合、超薄切片，用醋酸雙氧鈾和硝酸鉛染色，然后用美國TecniG220透射電鏡觀察其分子結(jié)構(gòu)的變化；光鏡按常規(guī)組織處理、包埋、切片、H-E染色后用LEICA顯微鏡觀察各臟器的病理變化。

2結(jié)果

2.1試驗結(jié)果NNAV經(jīng)口灌服試驗結(jié)果見表1，根據(jù)數(shù)據(jù)所示，計算測得小鼠經(jīng)口灌服NNAV的LD50為102.3 mg/kg，95%可信限為84.9～123.3 mg/kg；NNAV靜脈注射試驗結(jié)果見表2，根據(jù)所示數(shù)據(jù)，計算測得小鼠靜脈注射NNAV的LD50為0.624 mg/kg，95%可信限為0.572 ～ 0.680 mg/kg。

表1　NNAV經(jīng)口灌服試驗結(jié)果

表2　NNAV靜脈注射試驗結(jié)果

2. 2臨床觀察與毒性體征

2.2.1經(jīng)口灌服NNAV死亡小鼠出現(xiàn)俯臥、喘息、部分鼠嘶鳴流涎、發(fā)紺、眼球突出、呼吸困難、強直-陣攣性抽搐、尿失禁、心率減慢、呼吸先停，約1 min后心跳停止死亡。小鼠死亡發(fā)生于染毒后2 ～80 min；存活小鼠可見活動減少、腹式呼吸、喘息，中毒癥狀隨灌胃劑量的減小而減輕，5 h后基本恢復(fù)正常，第2天小鼠外觀體征、行為活動、呼吸、心率、食欲、大小便等未見有異常反應(yīng)。觀察期間3 d、7 d、14 d體質(zhì)量與正常對照組比較未見有顯著差異。

2.2.2靜脈注射NNAV小鼠出現(xiàn)先活動增加，3～30 min后活動減少，癱臥、腹式呼吸，肌松弛、翻正消失、耳朵血斑、眼球突出、四肢輕微抽動、呼吸困難、發(fā)紺、心率減慢，呼吸先停，再心跳消失。小鼠死亡發(fā)生于染毒后8 ～ 150 min。存活小鼠中毒癥狀主要出現(xiàn)活動減少、癱臥、腹式呼吸，肌松弛、翻正消失，并隨靜脈注射劑量的減小而減輕，6 h后基本恢復(fù)正常。第2天小鼠外觀體征、行為活動、呼吸、心率、食欲、大小便等未見有異常反應(yīng)。觀察期間3 d體質(zhì)量與正常對照組比較有顯著性差異，7、14 d體質(zhì)量與正常對照組比較未見有顯著差異。2. 3組織病理學(xué)檢查結(jié)果

2.3.1一般情況NNAV經(jīng)口灌服與靜脈注射后，死亡小鼠和觀察結(jié)束處死的小鼠剖檢，均可見快速死亡小鼠肺淤血，眼觀其他主要臟器未見明顯的病理改變。

2.3.2H-E染色NNAV經(jīng)口灌服中毒死亡小鼠主要組織器官病理鏡檢可見心肌間質(zhì)少量炎性細胞浸潤(圖1A)；肺毛細血管充血，局部肺泡間隔增寬伴少量炎性細胞浸潤(圖1B)；肝血管充血(圖1C)；腎、脾、腦組織無明顯病理改變。靜脈注射中毒死亡小鼠主要組織病理學(xué)變化為肺泡腔內(nèi)及細支氣管內(nèi)有紅細胞，血管壁周圍有水腫(圖1H)；肝細胞彌漫性腫大，致肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細胞腫脹，基質(zhì)稀疏，有的呈氣球樣變，肝血竇受壓變狹或消失(圖1I)；心(圖1G)、腎、脾、腦無明顯病變。正常對照小鼠主要臟器：心(圖1M)、肺(圖1N)、肝(圖1O)、脾、腎、腦無明顯病理變化。

圖1　小鼠各器官組織組織病理學(xué)H-E染色

A, heart, B, lung, C, liver: the mice died ofi.g. of NNAV; D, heart, E, lung, F, liver: the mice survived for 14 d afteri.g. of NNAV; G, heart, H, lung, I, liver: the mice died ofi.v. of NNAV; J, heart, K, lung, L, liver: the mice survived for 14 d afteri.v. of NNAV; M, heart, N, lung, O, live: normal control mice. Original magnification: ×200 (A, B, D, E, F, G, H, I, J, K, M, N, O), ×100 (C, L)

2.3.3電鏡觀察NNAV 經(jīng)口灌服中毒死亡小鼠，肺臟電鏡觀察可見肺泡 Ⅱ 型上皮細胞凋亡，核染色質(zhì)邊集于核膜上，胞質(zhì)內(nèi)可見空泡(圖2A)。靜脈注射中毒死亡小鼠電鏡觀察可見肺泡 Ⅰ 型上皮細胞呈早期凋亡，Ⅰ 型上皮細胞線粒體腫脹明顯(圖2C)。正常對照小鼠肺臟電鏡觀察結(jié)構(gòu)清晰，Ⅰ 型上皮細胞少數(shù)線粒體腫脹，肺泡 Ⅰ 型、 Ⅱ 型上皮細胞結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)內(nèi)線粒體粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富(圖2E)。

圖2　小鼠各器官電鏡觀察結(jié)果

A: the mice died ofi.g. of NNAV; B: the mice survived for 14 d afteri.g. of NNAV; C: the mice died ofi.v. of NNAV; D: the mice survived for 14 d afteri.v. of NNAV; E: normal control mice

2.3.4存活14 d處死小鼠NNAV經(jīng)口灌服存活14 d后，處死的小鼠主要臟器組織病理學(xué)檢查：心(圖1D)、肺(圖1E)、肝(圖1F)、脾、腎、腦組織均未見明顯異常，肺臟電鏡觀察可見肺泡Ⅰ型、Ⅱ型上皮細胞結(jié)構(gòu)清晰，Ⅰ型上皮細胞少數(shù)線粒體腫脹(圖2B)。靜脈注射存活14 d后處死的小鼠，鏡檢可見肺毛細血管充血(圖1K)；肝細胞灶性空泡變性(圖1L)；心(圖1J)、脾、腎、腦未見明顯病理改變，電鏡觀察可見肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮細胞結(jié)構(gòu)清晰， Ⅱ型上皮細胞內(nèi)可見板層小體排空(圖2D)。

3討論

本研究結(jié)果可知NNAV經(jīng)口灌服、靜脈注射兩種染毒途徑的半數(shù)致死量分別為：102.3、0.624 mg/kg，95%為84.9～123.3、0.572～0.680 mg/kg。結(jié)果顯示，NNAV靜脈注射染毒的毒性比口服染毒的毒性大164倍，經(jīng)口從消化道吸收可降解毒性。從LD50劑量推測，口服后吸收效率約為靜脈注射的1%。NNAV致動物死亡存在多種因素，主要是抑制呼吸中樞使呼吸功能麻痹與對循環(huán)系統(tǒng)的毒害引起心力衰竭而死亡。

小鼠喘息，呼吸困難明顯，強直性抽搐，心功能衰竭死亡，血液循環(huán)毒癥狀表現(xiàn)明顯；靜脈注射中毒癥狀為箭毒樣表現(xiàn)，癱臥、肌松弛、翻正消失、四肢抽動，呼吸功能麻痹，心功能衰竭而死亡，神經(jīng)毒癥狀表現(xiàn)明顯。結(jié)果提示NNAV不同的吸收途徑可出現(xiàn)不同的中毒癥狀。

通過對試驗期內(nèi)死亡小鼠與存活小鼠的病理組織學(xué)觀察可知：NNAV兩種染毒途徑小鼠的腎、脾、腦組織均未見明顯異常。NNAV兩種染毒途徑小鼠的肺組織電鏡與光鏡結(jié)果均可見肺損傷，損傷程度：靜脈注射>經(jīng)口灌服，14 d存活小鼠肺組織損傷與急性死亡小鼠比較明顯減輕。NNAV經(jīng)口灌服小鼠可見心肌與肝臟損傷，14 d存活小鼠心肌與肝臟未見明顯病變；靜脈注射小鼠出現(xiàn)明顯的肝損傷，14 d存活小鼠的肝損傷較輕。結(jié)果說明NNAV對機體組織的損傷基本是可恢復(fù)的。

本研究測定NNAV的毒性參數(shù)，證明NNAV口服可以吸收產(chǎn)生毒性作用，小鼠口服NNAV的半數(shù)致死量屬于中等毒性，靜脈注射NNAV的半數(shù)致死量屬于極毒，口服給藥毒性明顯低于靜脈注射。NNAV對機體發(fā)生毒性作用的靶器官可能為肺、肝、心。 NNAV對不同給藥途徑引起的不同中毒反應(yīng)癥狀與不同組織損傷，以及對機體的吸收、代謝、作用，有待于進一步觀察研究。

參考文獻

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[本文編輯]李子卓，賈澤軍

[收稿日期]2016-01-26[接受日期]2016-04-10

[作者簡介]張?zhí)穑T士生. E-mail:1219285831@qq.com *通信作者(Corresponding authors). Tel: 0512-65884028, E-mail:sunzhihong@suda.edu.cn; Tel: 0512-65884028, E-mail: zhqin5@hotmail.com

[中圖分類號]R 996.3

[文獻標(biāo)志碼]A

The acute toxicity of Najanajaatra venom (NNAV) by oral and intravenous administration

ZHANG Tian1, XUE Jie1, WANG Xiang-ying2, ZHU Lu-jia1, SUN Zhi-hong3*, QIN Zheng-hong1*

1. Soochow University School of Pharmaceutical Science, Suzhou21500, Jiangsu, China 2. Electron Microscope Room, Soochow University School of Biology and Basic Medicine Sciences, Suzhou21500, Jiangsu, China 3. Forensic Department, Soochow University School of Biology and Basic Medicine Sciences, Suzhou21500, Jiangsu, China

[Abstract]Objective： To compare the lethal dose 50 (LD50) of Najanajaatra venom (NNAV) with two routes of drug administration and to explore the target organs of acute toxicity of NNAV, and to observe the acute poisoning symptoms of the mice and organ lesions with oral and intravenous administration of NNAV. Methods： Two different modes of drug administration (oral administration and intravenous injection) were used to determine the LD50. Within 14 of survival time period, the activities, signs and death of the mice were observed. Then, pathology analysis was applied to the main organs of the dead and survival mice. Results： The LD50of NNAV by oral administration and intravenous injection was 102.3 and 0.624 mg/kg, and the 95% confidence limit range was 84.9-123.3 mg/kg and 572.3-680 μg/kg, respectively. The poisoning does by oral administration was 100 times larger than that by intravenous injection, indicating NNAV could be absorbed through gut. Conclusions： The toxicity of NNAV by intravenous administration is larger than that by oral administration. The death caused by acute intoxication is mainly due to respiratory failure. The organ damage caused by acute intoxication mainly occurred in lung and liver and it was more sever by intravenous injection.

[Key Words]NNAV; acute toxicity; mice; respiratory failure