組蛋白甲基化抑制劑DZNep對(duì)小鼠缺血再灌注損傷腎臟的保護(hù)作用

李佳蔚， 李　龍， 張　潮， 王繼納， 戎瑞明

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科, 上海　200032

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·論著·

組蛋白甲基化抑制劑DZNep對(duì)小鼠缺血再灌注損傷腎臟的保護(hù)作用

李佳蔚， 李龍， 張潮， 王繼納， 戎瑞明*

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科, 上海200032

[摘要]目的： 探討組蛋白甲基化抑制劑DZNep在小鼠腎臟缺血再灌注損傷模型中對(duì)腎臟的早期保護(hù)作用。方法： 18只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(sham組)、缺血再灌注損傷組(IR組)和缺血再灌注+治療組(IR+DZNep組)。后兩組建立缺血再灌注損傷模型，IR+DZNep組雙側(cè)腹股溝皮下注射DZNep(1 mg/kg)100 μL。假手術(shù)組游離雙側(cè)腎蒂但不阻斷。術(shù)后36 h采集標(biāo)本，評(píng)價(jià)腎功能和腎組織病理學(xué)損傷；通過脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況；通過檢測(cè)髓過氧化物酶(MPO)評(píng)價(jià)炎癥細(xì)胞的浸潤程度；采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)腎臟組織相關(guān)炎癥細(xì)胞因子水平。結(jié)果： 腎臟缺血再灌注損傷后36 h，與IR組相連，IR+DZNep組小鼠血肌酐和尿素氮水平明顯下降(69.17±3.49 vs 103.83±14.62， 9.56±1.07 vs 0.75±15.83； P<0.05)；病理損傷減輕，腎小管細(xì)胞凋亡減少，炎癥細(xì)胞因子水平降低(P<0.05)。結(jié)論： DZNep可以通過抑制細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)等方式降低小鼠缺血再灌注損傷腎臟的損傷程度，發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]DZNep；表觀遺傳修飾；腎臟；缺血再灌注損傷

缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是導(dǎo)致腎移植術(shù)后腎臟功能損失的主要原因，可以引起一系列的病理現(xiàn)象，包括腎臟的炎癥反應(yīng)以及腎臟纖維化，最終導(dǎo)致移植腎功能缺失或產(chǎn)生急性和慢性排斥反應(yīng)，影響患者的生存質(zhì)量[1-5]。近年來，對(duì)于腎臟的缺血再灌注損傷進(jìn)行了多項(xiàng)研究，發(fā)現(xiàn)在損傷過程中，固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)均起很大作用，免疫系統(tǒng)的激活使炎癥因子在移植物中大量富集，介導(dǎo)移植物的損傷[6-8]。

DZNep(3-deazaneplanocin A)是一種組蛋白甲基化抑制劑，既往常用于血液疾病的治療，在腎移植過程中的作用尚不明確[9]。近年已有實(shí)驗(yàn)[10-11]表明，DZNep在小鼠的腎臟移植模型和骨髓移植模型中，均表現(xiàn)對(duì)移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)的抑制作用，而對(duì)于腎臟缺血再灌注損傷的作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬在小鼠腎移植缺血再灌注模型中，研究DZNep是否對(duì)損傷早期腎臟起保護(hù)作用，以期為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要材料及試劑SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠18只，體質(zhì)量20～25 g，8～10周齡，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院動(dòng)物房。DZNep粉劑由美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute，NCI)提供，用無菌PBS溶解，儲(chǔ)存在-20℃冰箱，備用。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及處理18只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注損傷組(IR組)、缺血再灌注+治療組(IR+DZNep組)，每組6只。小鼠腎臟IRI模型的建立：IR組、IR+DZNep組小鼠術(shù)前禁食8 h、禁水4 h，用腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，行腹正中切口，游離雙側(cè)腎蒂，用無創(chuàng)血管夾阻斷雙側(cè)腎蒂30 min后復(fù)通。假手術(shù)組游離雙側(cè)腎蒂但不阻斷。治療組小鼠于術(shù)前2 d、術(shù)前1 d、開放灌注后和術(shù)后1 d共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)給予100 μL DZNep(1 mg/kg)雙側(cè)腹股溝區(qū)皮下輪流注射。各組小鼠于術(shù)后36 h處死并采集血液、脾臟和腎臟標(biāo)本。

1.3檢測(cè)方法將取得的小鼠血液在室溫下靜置30 min后，于4 400 r/min離心20 min，取上層血清，應(yīng)用日立全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)。

用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin ,H-E)染色后檢測(cè)腎臟病理學(xué)的變化。將腎臟標(biāo)本固定、包埋、切片后行常規(guī)H-E染色，隨機(jī)選擇10個(gè)視野(100×)進(jìn)行評(píng)分，以評(píng)估組織病理學(xué)變化。

通過檢測(cè)脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxy nucleotidyl transferase mediated-dUTP nick end labeling，TUNEL)腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況。通過檢測(cè)髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)，評(píng)價(jià)中性粒細(xì)胞的浸潤程度。采用DAB染色法，以細(xì)胞核染褐黃色為陽性細(xì)胞，隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(400×)，計(jì)平均數(shù)為陽性細(xì)胞數(shù)。

TRIzol法提取小鼠腎臟總mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用TaqMan探針方法行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測(cè)腎臟組織中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)、白介素6和10(IL-6、IL-10)水平。

2結(jié)果

2.1DZNep對(duì)小鼠缺血再灌注損傷腎臟功能的影響結(jié)果(圖1)表明：在小鼠腎臟缺血再灌注損傷后36 h，IR組Scr水平高于sham組[(103.83±14.62) μmol/Lvs(77.5±14.27) μmol/L，P=0.010 198]，BUN水平明顯高于sham組[(30.75±15.83) mmol/Lvs(6.63±0.84) mmol/L,P=0.003 931]；IR+DZNep組Scr水平明顯低于IR組[(69.17±3.49) μmol/Lvs(103.83±14.62) μmol/L，P=0.000 213]，BUN水平明顯低于IR組[(9.56±1.07) mmol/Lvs(30.75±15.83) mmol/L，P=0.008 417]。

圖1　腎臟缺血再灌注損傷后36 h小鼠血肌酐和尿素氮水平

2.2DZNep對(duì)小鼠缺血再灌注損傷腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響結(jié)果(圖2)表明：sham組腎單位和腎間質(zhì)的結(jié)構(gòu)基本正常。IR組小鼠腎臟組織充血水腫，腎小管結(jié)構(gòu)破壞消失，上皮細(xì)胞腫脹、脫落；腎小管擴(kuò)張、管腔堵塞，見大量蛋白管型、顆粒樣管型及紅細(xì)胞管型，伴有腎實(shí)質(zhì)和間質(zhì)出血以及大量炎癥細(xì)胞浸潤。IR+DZNep組腎單位和腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)和形態(tài)較為完整，腎臟組織損傷程度及范圍較IR組明顯減輕，H-E評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3DZNep對(duì)小鼠腎臟缺血再灌注損傷后腎小管細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果(圖3)表明：IR組TUNEL陽性細(xì)胞明顯多于sham組，說明IR可引起腎小管細(xì)胞的凋亡；IR+DZNep組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于IR組，說明DZNep能抑制凋亡。3組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2　H-E病理染色及評(píng)分

圖3　TUNEL檢測(cè)結(jié)果及陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)

2.4DZNep對(duì)小鼠腎臟缺血再灌注損傷后中性粒細(xì)胞浸潤的影響結(jié)果(圖4)表明：IR組MPO陽性細(xì)胞明顯多于sham組，說明IR可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤；IR+DZNep組陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于IR組，說明DZNep明顯抑制中性粒細(xì)胞浸潤。3組陽性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5DZNep對(duì)腎臟組織炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響再灌注后36 h，與sham組相比，IR組和IR+DZNep組炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)均升高；與IR組相比，IR+DZNep組相關(guān)炎癥因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10)的表達(dá)均明顯降低(P<0.05，圖5)。

圖4　MPO檢測(cè)結(jié)果及陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)

圖5　各組小鼠腎組織IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α mRNA的表達(dá)水平

3討論

缺血再灌注損傷常影響移植后的器官功能恢復(fù)，導(dǎo)致急性或慢性排斥反應(yīng)，進(jìn)而影響移植物的狀態(tài)及患者的長期存活[1]。表觀遺傳學(xué)修飾是指在不改變DNA序列的情況下對(duì)基因表達(dá)及調(diào)控進(jìn)行的一種可遺傳修飾。常見的表觀遺傳學(xué)修飾方式有DNA甲基化、組蛋白修飾以及染色體重塑等方式[12-13]。近年來，表觀遺傳學(xué)修飾在腎臟移植過程中的重要性已逐漸凸顯出來，目前已證實(shí)表觀遺傳學(xué)改變與移植腎損傷以及移植后相關(guān)疾病的發(fā)生有一定的聯(lián)系[14-15]。

DZNep是一種組蛋白甲基化抑制劑，既往常用于血液學(xué)疾病的治療。在小鼠中，DZNep可用于治療白血病、膠質(zhì)瘤等，并且由于其改變基因具有可逆性，目前已成為一種理想的改變表觀遺傳學(xué)的藥物[9]。已有研究[10-11]表明，DZNep在腎臟移植模型和骨髓移植模型中，均表現(xiàn)對(duì)GVHD的抑制作用，且可以預(yù)防供體源性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的GVHD的發(fā)生，對(duì)移植后的腎臟起明顯的保護(hù)作用。本研究中，在小鼠腎臟缺血再灌注術(shù)后36 h，DZNep可以顯著降低Scr和BUN；腎臟病理結(jié)果證實(shí)，DZNep在腎臟缺血再灌注損傷中起保護(hù)作用；TUNEL和MPO染色表明，DZNep在缺血再灌注損傷中能抗腎小管細(xì)胞凋亡，進(jìn)而維持腎小管結(jié)構(gòu)與功能完整。在缺血再灌注損傷的過程中，受損的上皮細(xì)胞會(huì)分泌炎癥細(xì)胞因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10等。這些炎性因子導(dǎo)致?lián)p傷部位形成局部炎性環(huán)境，介導(dǎo)相關(guān)炎性反應(yīng)、活化淋巴細(xì)胞，進(jìn)而加重?fù)p傷[1-2]。本研究中，DZNep使缺血再灌注損傷小鼠各炎性因子的表達(dá)降低，進(jìn)一步說明DZNep對(duì)腎臟有明顯的保護(hù)作用。

綜上所述，DZNep能通過抑制細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)降低小鼠缺血再灌注損傷腎臟的損傷程度，保護(hù)腎臟功能。本研究為腎臟移植后藥物的應(yīng)用提供了新思路，也為DZNep在移植術(shù)中的應(yīng)用提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但是關(guān)于DZNep對(duì)腎臟保護(hù)作用的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究探討。

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[本文編輯]姬靜芳

[收稿日期]2016-03-01[接受日期]2016-06-06

[作者簡(jiǎn)介]李佳蔚, 碩士生. E-mail: jwli15@fudan.edu.cn *通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990, E-mail: rong.ruiming@zs-hospital.sh.cn

[中圖分類號(hào)]R 692

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

Protective effect of histone methylation inhibitor DZNep on kindey in ischemia reperfusion injury of kidney transplantation in mice

LI Jia-wei, LI Long, ZHANG Chao, WANG Ji-na, RONG Rui-ming*

Department of Urology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai200032, China

[Abstract]Objective： To study the protective effect of histone methylation inhibitor DZNep on kidney at early stage in the model of renal ischemia reperfusion injury in mice. Methods： 18 C57BL/6 mice were randomly divided into sham operation group (sham group), ischemia reperfusion injury group (IR group) and ischemia reperfusion plus therapy group (IR+DZNep group). The model of ischemia reperfusion injury was established in the latter two groups. The IR+DZNep group was given bilateral inguinal subcutaneous injection of DZNep (100 μL per mg/kg). Bilateral renal pedicles were isolated but not clamped. Renal function and histopathological changes were evaluated 36 h after operation. The apoptosis of renal tubular epithelial cells was detected by TDT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) assay. Infiltration of inflammatory cells was evaluated through the detection of myeloperoxidase (MPO). Inflammatory cytokine levels in renal tissue were detected by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Results： After DZNep treatment, the serum creatinine and urea nitrogen level decreased when compared with IR group (69.17±3.49 vs 103.83±14.62, 9.56±1.07 vs 30.75±15.83; P<0.05). Apoptotic renal cells in DZNep group also declined than IR group(P<0.05). Conclusions： DZNep can reduce the degree of renal ischemia reperfusion injury in mice by inhibiting cell apoptosis and reducing inflammatory reaction, and play a role in protecting the kidney.

[Key Words]DZNep; epigenetic modification; kidney; ischemia reperfusion injury