根際促生菌D5A菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

陳翠++陳丹丹++馮清++陳祁怡+吳向華

摘要：考察不同碳源、氮源、碳氮比、生長(zhǎng)因子、溫度、pH值、裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量、時(shí)間等參數(shù)對(duì)根際促生菌D5A菌株發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，在裝液量為30 mL/250 mL的三角瓶中，按5%接種量將D5A菌株接種到以3%葡萄糖為碳源、1.5%牛肉膏為氮源、碳氮比為2 ∶ 1、生長(zhǎng)因子為酵母粉、pH值為6的培養(yǎng)基中，150 r/min、37 ℃培養(yǎng)48 h，可發(fā)酵產(chǎn)生最大生物量。

關(guān)鍵詞：根際促生菌；發(fā)酵；優(yōu)化

中圖分類號(hào)： S154.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0516-03

收稿日期：2015-04-29

基金項(xiàng)目：江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：201311460046X）；江蘇省“生態(tài)學(xué)”重點(diǎn)一級(jí)建設(shè)學(xué)科項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：陳翠（1992—），女，江蘇淮安人，碩士研究生，主要從事生物學(xué)研究。E-mail：1448405968@qq.com。

通信作者：吳向華，博士，副教授，主要從事微生物學(xué)教學(xué)與研究工作。E-mail：xhw610@163.com。植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR） 是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一類可促進(jìn)植物生長(zhǎng)及對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌類[1]。PGPR具有固氮、解磷、釋鉀、產(chǎn)生植物激素和分泌抗生素等能力，或具有其中之一的能力[2-3]。PGPR對(duì)植物生長(zhǎng)具有直接或間接促進(jìn)作用。PGPR的直接促進(jìn)作用是指某些植物根際促生菌可合成對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有直接作用的物質(zhì)（如生長(zhǎng)素等） 以及改變土壤中某些無(wú)效元素的形態(tài)，使之有效化而利于植物吸收（如固氮、解磷等）[4-5] 。對(duì)植物生長(zhǎng)的間接作用是指某些植物根際促生菌抑制或減輕某些植物病害對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的不良影響[6-7]。接種PGPR普遍被認(rèn)為是一種環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)有效的提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的方法，應(yīng)用前景廣闊。本研究選擇碳源、氮源、碳氮比、生長(zhǎng)因子、溫度、pH值、裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量、時(shí)間等參數(shù)，探索優(yōu)化根際促生菌D5A菌株的發(fā)酵條件，旨在為工業(yè)化生產(chǎn)根際促生菌D5A菌株提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株

根際促生菌D5A菌株克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）[8]由中國(guó)科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[9]。

1.3方法

1.3.1碳源對(duì)D5A菌株生長(zhǎng)的影響[10-11]以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以3%糖蜜、3%可溶性淀粉、3%葡萄糖、3%蔗糖、3%玉米糝為碳源，按2%接種量于37 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液生物量。

1.3.2氮源對(duì)D5A菌株生長(zhǎng)的影響以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以篩選出的最適碳源為碳源，分別以1.5%牛肉膏、1.5%硫酸銨、1.5%草酸銨、1.5%蛋白胨、1.5%氯化銨、1.5%硫酸鐵銨、1.5%酵母膏為氮源，按2%接種量于37 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液生物量。

1.3.3碳氮比對(duì)D5A菌株生長(zhǎng)的影響以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以篩選出的最佳碳源、氮源為碳氮源，分別用1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1、4 ∶ 1、5 ∶ 1碳氮比，按2%接種量于37 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液生物量。

1.3.4生長(zhǎng)因子對(duì)D5A菌株生長(zhǎng)的影響以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以篩選出的最佳碳氮比為碳氮比，分別用2 020 μg/L維生素B、2 020 μg/L酵母粉、2 020 μg/L葉酸為生長(zhǎng)因子，按2%接種量于37 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液生物量。

1.3.5pH值對(duì)D5A菌株生長(zhǎng)的影響以篩選出的最佳碳氮比、生長(zhǎng)因子配制培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)pH值至5、6、7、8、9，按2%接種量于37 ℃連續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液生物量。

1.3.6溫度對(duì)D5A菌株生長(zhǎng)的影響以篩選出的最佳培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，按2%接種量分別于28、37、42 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液生物量。

1.3.7裝液量對(duì)D5A菌株生長(zhǎng)的影響以篩選出的最佳培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，按2%接種量將D5A菌株分別接種到裝液量為30、50、80、100、150 mL的250 mL培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，于37 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液生物量。

1.3.8轉(zhuǎn)速對(duì)D5A菌株生長(zhǎng)的影響以篩選出的最適裝液量、最適培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，按2%接種量接入D5A菌株，分別在100、150、180 r/min下于37 ℃連續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液生物量。

1.3.9接種量對(duì)D5A菌株生長(zhǎng)的影響以篩選出的最佳培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分別按1%、2%、5%、10%、20%的接種量將D5A菌株分別接種到裝液量為30 mL/250 mL的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，于37 ℃連續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液生物量。

1.3.10培養(yǎng)時(shí)間對(duì)D5A菌株生長(zhǎng)的影響以篩選出的最佳培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，按5%接種量將D5A菌株接種到裝液量為30 mL/250 mL的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，分別于37 ℃ 培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h，測(cè)定發(fā)酵液生物量。

1.3.11生物量的測(cè)定按照稀釋平板計(jì)數(shù)法[12]測(cè)定活菌總數(shù)。

1.3.12數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 16.0軟件分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1最適碳源選擇

由圖1可知，葡萄糖作為碳源能獲得最大生物量，其次是糖蜜、蔗糖、玉米糝，D5A菌株在可溶性淀粉中生長(zhǎng)狀況最差。究其原因，可能是由于葡萄糖、蔗糖都屬于速效性碳源，適合菌體大量生成，玉米糝、淀粉都屬于緩釋型碳源，需要分解為單糖后菌體才能大量生長(zhǎng)。因此，選擇葡萄糖作為最適碳源。

2.2最適氮源選擇

由圖2可知，D5A菌株在牛肉膏中生長(zhǎng)最好，但與硫酸鐵銨差異不顯著，但顯著高于硫酸銨、蛋白胨、氯化銨。牛肉膏不僅可以作為氮源，而且在碳源不足時(shí)可補(bǔ)充碳源，也可提供微量元素，故選擇牛肉膏為最適氮源。

2.3最適碳氮比選擇

以葡萄糖、牛肉膏作為碳氮源，分別按1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1、4 ∶ 1、5 ∶ 1比例配制培養(yǎng)基，按2%接種量于 37 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，測(cè)定生物量。由圖3可以看出，碳氮比為 2 ∶ 1 時(shí)D5A菌株生長(zhǎng)狀況最好，其次為1 ∶ 1，1 ∶ 3、5 ∶ 1比較差，且2 ∶ 1、1 ∶ 1組處理下菌株生物量與其他幾組之間存在顯著差異，故選用2 ∶ 1為最佳碳氮比。

2.4最適生長(zhǎng)因子選擇

以維生素B、酵母粉、葉酸為生長(zhǎng)因子，按2%接種量于

37 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，由圖4可以看出，不同生長(zhǎng)因子下根際促生菌的發(fā)酵情況由好到差依次為：酵母粉>葉酸>維生素B，且酵母粉與其2兩組之間無(wú)顯著差異，選用酵母粉為最佳生長(zhǎng)因子。

2.5最適pH值選擇

由圖5可知，D5A菌株在pH 值為6時(shí)生長(zhǎng)最好，其次是pH值為9、5，在pH值為7、8時(shí)D5A菌株生長(zhǎng)較差。pH值為6處理下菌落數(shù)與pH值為7、8存在顯著差異，因此選擇pH值為6為最佳pH值。

2.6最適溫度的選擇

由圖6可知，37 ℃時(shí)菌株生長(zhǎng)情況最好，其次是42、28 ℃，但各溫度處理之間無(wú)明顯差異。菌株一般在37 ℃時(shí)生長(zhǎng)較好，本試驗(yàn)也說(shuō)明了這點(diǎn)，溫度過(guò)高或過(guò)低對(duì)酶都有一定影響，有可能導(dǎo)致酶失活，故選用37 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.7最適裝液量的選擇

由圖7可知，D5A菌株在30 mL/250 mL裝液量處理下生長(zhǎng)最好，其次是50 mL/250 mL、100 mL/250 mL，較差的是80 mL/250 mL、150 mL/250 mL，因此裝液量選擇 30 mL/250 mL 最佳。

2.8轉(zhuǎn)速對(duì)D5A菌株生長(zhǎng)的影響

由圖8可知，150 r/min 轉(zhuǎn)速處理下D5A菌株生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，150、180 r/min處理下菌落數(shù)差異性較小，但150 r/min與100 r/min之間存在顯著差異，故轉(zhuǎn)速選擇150 r/min對(duì)D5A菌株進(jìn)行培養(yǎng)。

2.9接種量對(duì)D5A菌株生長(zhǎng)的影響

由圖9可知，隨著接種量的增加，菌株的生長(zhǎng)情況變好，但是當(dāng)接種量增長(zhǎng)到20%時(shí)菌落數(shù)明顯減少。5%、10%接種量處理下菌株生長(zhǎng)較佳，且兩者之間無(wú)顯著差異，10%接種量與20%接種量之間差異顯著?？紤]到經(jīng)濟(jì)因素，選擇5%接種量更為合適。

2.10培養(yǎng)時(shí)間對(duì)D5A菌株的影響

由圖10可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)逐漸變好，但當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間增加為72 h時(shí)，菌落數(shù)有所下降。培養(yǎng)時(shí)間為48、60 h時(shí)菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)最好，且兩者之間無(wú)顯著差異。培養(yǎng)時(shí)間為12 h時(shí)菌株生長(zhǎng)情況最差。綜合考慮，選擇48 h培養(yǎng)時(shí)間最為合適。

3結(jié)論

本試驗(yàn)設(shè)置碳源、氮源、碳氮比、生長(zhǎng)因子、溫度、pH值、裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量、發(fā)酵時(shí)間等單因子試驗(yàn)，獲得根際促生菌的最適發(fā)酵條件是在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，以3%葡萄糖為碳源、1.5%牛肉膏為氮源，碳氮比為2 ∶ 1，生長(zhǎng)因子為酵母粉，在37 ℃、pH值為6、裝液量30 mL/250 mL、5%接種量、150 r/min 條件下培養(yǎng)48 h，根際促生菌產(chǎn)量最高。

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