葡萄愈傷組織中白藜蘆醇含量的影響因素

鐘英英++黃禧擎++凌秋萍++羅鈺沁+羅思成++梁瓊鋒

摘要：以葡萄的葉片、葉柄及莖段誘導(dǎo)的愈傷組織為試驗(yàn)材料，考察紫外線照射、硝酸銀處理和雜菌污染對(duì)其愈傷組織中白藜蘆醇含量的影響。結(jié)果表明：經(jīng)硝酸銀處理的愈傷組織中白藜蘆醇含量隨處理濃度的提高呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì)，在濃度為10 mg/L時(shí)，白藜蘆醇含量達(dá)到最大；經(jīng)紫外線照射的愈傷組織中白藜蘆醇含量隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后減少，莖段與葉片經(jīng)紫外線照射3 min后白藜蘆醇的含量最高，而葉柄經(jīng)紫外處理5 min后白藜蘆醇的含量最高。染菌的愈傷組織中白藜蘆醇含量也明顯高于對(duì)照。因此，在所試驗(yàn)的范圍內(nèi)提高葡萄愈傷組織中白藜蘆醇含量，硝酸銀的適宜濃度為10 mg/L，紫外線照射時(shí)間為3～5 min，另外雜菌感染也有助于葡萄愈傷組織中白藜蘆醇含量的提高。

關(guān)鍵詞：葡萄；愈傷組織；白藜蘆醇；硝酸銀；紫外線輻照

中圖分類號(hào)： S663.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0406-02

收稿日期：2015-04-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃；廣西壯族自治區(qū)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃。

作者簡(jiǎn)介：鐘英英（1979—），女，廣西柳州人，碩士，講師，主要從事天然產(chǎn)物提取及利用方面的研究。Tel：（0772）2687033；E-mail：mininetzhkitty@126.com。白藜蘆醇是最先在葡萄屬植物中發(fā)現(xiàn)的一種抗逆性物質(zhì)，是植物體在惡劣環(huán)境下或遇到病原微生物侵害時(shí)自身分泌的一種抗毒素。目前，可提取白藜蘆醇的原料主要來(lái)自葡萄、虎杖、桑樹、花生等植物，在葡萄屬植物中含量最高，由于其具有抗氧化、抗癌、保護(hù)心血管等作用而備受關(guān)注[1-2]。目前白藜蘆醇的提取主要依靠葡萄皮、虎杖等[2-3]，要滿足白藜蘆醇日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需要，需要消耗大量的原料，對(duì)環(huán)境及野生資源的破壞很大。而利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物具有成本低、周期短、不破壞自然資源、不受季節(jié)限制等優(yōu)勢(shì)，為白藜蘆醇生產(chǎn)提供了新途徑。本試驗(yàn)研究AgNO3和紫外光照對(duì)葡萄愈傷組織白藜蘆醇積累的影響，以期找到從葡萄愈傷組織中提取白藜蘆醇的最佳條件，為葡萄愈傷組織中白藜蘆醇的大規(guī)模生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用的葡萄葉柄、莖段和葉片等材料取自當(dāng)?shù)仄咸褕@；白藜蘆醇對(duì)照品購(gòu)于四川成都曼斯特生物科技公司；MS培養(yǎng)基、NAA、6-BA等均購(gòu)自浙江臨安木木生物有限公司。

1.2方法

1.2.1葡萄愈傷組織的培養(yǎng)選取無(wú)病害葡萄葉柄、葉片和莖段，用低濃度的洗衣粉浸泡30 min，在無(wú)菌超凈臺(tái)下，用75%乙醇消毒30 s，用1% NaClO3 浸泡1～2 min，再用無(wú)菌蒸餾水沖洗數(shù)次；將葉片剪成約0.5 cm×0.5 cm的片段，葉柄、莖段則切成0.3～0.5 cm長(zhǎng)的小段，接種于MS培養(yǎng)基（含 2 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA，pH值為5.8）中，（26±1） ℃進(jìn)行暗培養(yǎng)，每個(gè)月繼代培養(yǎng)1次。

1.2.2不同濃度的AgNO3處理將繼代培養(yǎng)的愈傷組織分別轉(zhuǎn)移到質(zhì)量濃度為0、1、10、30 mg/L AgNO3的繼代培養(yǎng)基MS（2 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA，pH值5.8）中，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，（26±1） ℃繼續(xù)進(jìn)行暗培養(yǎng)30 d備用。

1.2.3紫外光處理將繼代培養(yǎng)的愈傷組織在紫外燈下分別照射0、1、3、5、10、15 min，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，照射后繼續(xù)在（26±1） ℃暗培養(yǎng)30 d備用。

1.2.4染菌處理將繼代培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至有培養(yǎng)基的廣口瓶后敞開20 min，然后繼續(xù)蓋上，（26±1） ℃暗培養(yǎng)30 d備用。同時(shí)，用正常培養(yǎng)的愈傷組織作對(duì)照，處理和對(duì)照均進(jìn)行9次重復(fù)。

1.2.5白藜蘆醇含量的測(cè)定（1）白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。精確稱取2.0 mg白藜蘆醇對(duì)照品，用甲醇在10 mL容量瓶中混勻，定容得到0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將其稀釋至質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10、12、14、16 ug/mL的溶液。以濃度為0作空白，用紫外可見分光光度計(jì)在306 nm處分別測(cè)出各濃度的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。

（2）白藜蘆醇提取及含量計(jì)算。將愈傷組織烘至恒質(zhì)量，研磨至粉后，精確稱取2.000 g，轉(zhuǎn)移至50 mL圓底燒瓶中，以料液比為1 g ∶ 20 mL加入70%甲醇，60 ℃恒溫回流提取2 h。之后將所得溶液進(jìn)行真空抽濾，洗滌2次，合并洗滌液和濾液，記錄體積，取2 mL樣品加70%甲醇至10 mL，用紫外可見分光光度計(jì)在306 nm處分別測(cè)出各提取液的吸光度，按照下式計(jì)算白藜蘆醇的含量（mg/g）：

白藜蘆醇含量=C×V×D/（103×m）。

式中：C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品液吸光度對(duì)應(yīng)的白藜蘆醇的濃度，μg/mL；V為樣品溶液的體積，mL；m為樣品稱取的質(zhì)量，g；D為樣品溶液稀釋倍數(shù)。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不同組織來(lái)源的愈傷組織中白藜蘆醇含量的單向方差分析以及染菌與對(duì)照樣本的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，均用SPSS 20.0進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

由“1.2.5”節(jié)中標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，得到回歸方程為y=0.142 8x+0.137 2，r2=0.996 1，表明白藜蘆醇濃度在2～16 μg/mL 間呈線性關(guān)系（圖1）。

2.2AgNO3濃度對(duì)葡萄愈傷組織白藜蘆醇含量的影響

由圖2可知，隨AgNO3濃度的提高，白藜蘆醇含量呈先上升后又逐漸下降的趨勢(shì)，這與張真等的研究結(jié)果[4]類似。當(dāng)AgNO3濃度為10 mg/L時(shí)，白藜蘆醇含量達(dá)最大，此時(shí)莖段、葉片和葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織中白藜蘆醇含量分別為2669、2.926、3.011 mg/g，均明顯高于未處理的 1.562、1786、1.159 mg/g；但隨著AgNO3濃度的升高，白藜蘆醇含量開始下降，當(dāng)AgNO3濃度達(dá)到30 mg/L時(shí)，莖段、葉片和葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織中白藜蘆醇含量分別下降至 1.230、1238、1063 mg/g。因此，濃度低于10 mg/L的AgNO3能夠促進(jìn)白藜蘆醇的生成，而濃度超過(guò)10 mg/L的AgNO3則會(huì)抑制其積累。

白藜蘆醇是植物在惡劣環(huán)境下或遇到病原微生物侵害時(shí)自身產(chǎn)生的一種抗逆性物質(zhì)。低濃度銀離子存在時(shí)，植物體可能為了消除銀離子的傷害，從而刺激生物體合成更多的抗逆性物質(zhì)[5]。當(dāng)硝酸銀濃度過(guò)高時(shí)，則可能會(huì)使細(xì)胞受到毒害，抑制白藜蘆醇的生成。其中的原因可能是離體植物細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生并積累乙烯，Ag+通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞膜上的乙烯受體蛋白，抑制乙烯的活性，繼而抑制愈傷組織形成[6]。另外，重金屬脅迫可能導(dǎo)致活性氧自由基在植物細(xì)胞內(nèi)增多，其強(qiáng)氧化性對(duì)許多生物功能分子造成破壞，從而使細(xì)胞的生長(zhǎng)受到影響[4]。

2.3紫外線照射對(duì)葡萄愈傷組織白藜蘆醇含量的影響

如圖3所示，隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄不同組織誘導(dǎo)的愈傷組織中白藜蘆醇含量呈現(xiàn)先上升隨后又逐漸下降的趨勢(shì)。經(jīng)紫外光輻射3～5 min的愈傷組織中，白藜蘆醇含量較高。其中，莖段和葉片誘導(dǎo)的愈傷組織經(jīng)輻照3 min后白藜蘆醇的含量最高，達(dá)到2.543、2.180 mg/g，分別為對(duì)照組（莖段1.562 mg/g，葉片1.786 mg/g）的1.63、1.22倍；葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織則在輻照5 min處理組中的白藜蘆醇含量最高（1.446 mg/g），為對(duì)照組（1.159 mg/g）的1.25倍。但當(dāng)輻照時(shí)間超過(guò)15 min時(shí)，葡萄愈傷組織中的白藜蘆醇含量均低于對(duì)照，莖段、葉片、葉柄來(lái)源的愈傷組織中白藜蘆醇含量分別比對(duì)照下降了11.7%、41.8%、11.3%，葉片誘導(dǎo)的愈傷組織受到的影響最大。

白藜蘆醇為芪類次生代謝物，芪合酶（stilbene synthase， STS）是白藜蘆醇生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶[6-7]。Fritzemeier等發(fā)現(xiàn)，紫外光照射可顯著提高葡萄葉片的STS 活性，與白藜蘆醇生物合成相關(guān)的另外2種酶（苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸-4-羥化酶）也同時(shí)被誘導(dǎo)[8]。Bruno等也研究發(fā)現(xiàn)，北美沙地葡萄品種（Vitis rupestris）在紫外誘導(dǎo)2 h后，STS mRNA持續(xù)高水平表達(dá)，白藜蘆醇含量也急劇增加[9]。本研究結(jié)果表明，少于5 min的紫外光照射可提高葡萄愈傷組織中的白藜蘆醇含量。然而，紫外光輻射也是一種環(huán)境脅迫因子，過(guò)度照射可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷并影響白藜蘆醇等代謝物的生成。

2.4染菌對(duì)白藜蘆醇含量的影響

從圖4可以看出，正常的愈傷組織中，莖段來(lái)源的白藜蘆醇含量最高（9次重復(fù)均值達(dá)到1.95 mg/g），其次為葉片愈傷組織（1.79 mg/g），含量最低的為葉柄愈傷組織（1.51 mg/g），但是不同組織之間的白藜蘆醇含量沒有顯著差異（P>005）。染菌處理后，無(wú)論是葉片、葉柄還是莖段來(lái)源的愈傷組織中白藜蘆醇含量均顯著高于對(duì)照（葉片P=0007、葉柄P=0.001、莖段P=0.009）。這可能是由于雜菌污染可以作為一種脅迫，可以引發(fā)植物細(xì)胞產(chǎn)生防御性應(yīng)答反應(yīng)，誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，從而激活特定代謝途徑，促使葡萄離體細(xì)胞中白藜蘆醇的積累。已有研究表明，健康葡萄葉片中白藜蘆醇含量大大低于染病的葉片，感染的程度越大葉片中白藜蘆醇含量相對(duì)越高[10]。另外，文濤等發(fā)現(xiàn)真菌誘導(dǎo)可以提高虎杖愈傷組織中的白藜蘆醇含量[11]。本研究結(jié)果表明，染菌可以顯著提高愈傷組織生成白藜蘆醇的量，不同重復(fù)得到的結(jié)果差別偏大可能跟愈傷組織受到感染程度不同有關(guān)。

3結(jié)論

葡萄愈傷組織中白藜蘆醇的含量隨著AgNO3濃度的增加呈現(xiàn)先上升隨后又逐漸下降的趨勢(shì)，當(dāng)其濃度為10 mg/L時(shí)，白藜蘆醇含量最高；而在濃度超過(guò)30 mg/L時(shí)，白藜蘆醇積累

受到抑制。葡萄愈傷組織中白藜蘆醇含量隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升隨后又逐漸下降的趨勢(shì)。其中，光照 3 min 后莖段與葉片來(lái)源的愈傷組織白藜蘆醇含量最高，光照 5 min 后葉柄白藜蘆醇含量最高。但紫外光照超過(guò) 15 min，愈傷組織中的白藜蘆醇積累則會(huì)受到抑制。外植體的差異也會(huì)造成愈傷組織中白藜蘆醇含量不同，其中含量從高到低依次為葉片>莖段>葉柄，但無(wú)顯著差異。染菌處理可以顯著提高愈傷組織中白藜蘆醇的含量。

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