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    秦巴山區(qū)黑木耳菌株酯酶同工酶的分析

    2016-07-25 15:46:47錢雪婷陳文強(qiáng)彭浩解修超
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年6期
    關(guān)鍵詞:親緣關(guān)系秦巴山區(qū)黑木耳

    錢雪婷++陳文強(qiáng)++彭浩++解修超++鄧百萬

    摘要:對(duì)秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株進(jìn)行酯酶同工酶垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,結(jié)果表明,41個(gè)供試菌株共檢測到19條不同遷移率酯酶同工酶酶帶,各菌株有5~9條不等的酶帶,共16個(gè)酶譜類型。應(yīng)用NTSYS-pc 2.11軟件分析,41個(gè)黑木耳菌株兩兩之間的相似系數(shù)分布在0.474~1.000之間,當(dāng)遺傳相似系數(shù)為80%時(shí),41個(gè)黑木耳供試菌株被聚類分成5類,初步鑒定了41個(gè)供試菌株間的親緣關(guān)系。

    關(guān)鍵詞:秦巴山區(qū);黑木耳;酯酶同工酶;親緣關(guān)系

    中圖分類號(hào): S646.603文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2016)06-0269-03

    收稿日期:2015-09-23

    基金項(xiàng)目:陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(編號(hào):2014K01-16-03);陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃(編號(hào):2012HBGC-20)。

    作者簡介:錢雪婷(1990—),女,陜西略陽人,碩士研究生,主要從事微生物資源利用開發(fā)等研究。E-mail:qianxueting163@163.com.

    通信作者:陳文強(qiáng),教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事微生物資源開發(fā)保護(hù)及利用相關(guān)研究。E-mail:wenqiangc@126.com.黑木耳(Auricularia auricular),別稱木耳、細(xì)耳、云耳、黑葉、木蛾,分類上屬異擔(dān)子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬,子實(shí)體一般較小,膠質(zhì),淺圓盤形、耳形或不規(guī)則形[1],是一種含有極高營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的美味食用菌[2]?,F(xiàn)代研究表明,黑木耳具有抗氧化、抗菌、抗癌,增強(qiáng)體液免疫等多種功效[3-5]。秦巴山區(qū)氣候溫和濕潤,適宜菌類生長,是我國黑木耳的主要栽培基地之一。近年來,由于部分地區(qū)對(duì)黑木耳菌株的管理存在很多缺陷,黑木耳菌株亂引種、亂命名的現(xiàn)象較為嚴(yán)重,使同一菌株冠以不同的品種代號(hào)或不同菌株冠以相同的品種代號(hào),造成黑木耳菌種、品種的混亂。目前,黑木耳種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究逐漸受到重視,Tang等[6]、李媛媛等[7]、張旭等[8]、唐利華等[9]分別利用ISSR和SRAP分子標(biāo)記、SCAR分子標(biāo)記、SRAP和ITS分子標(biāo)記、酯酶同工酶分析對(duì)我國不同地區(qū)黑木耳栽培菌株以及野生菌株的親緣關(guān)系,結(jié)果表明,我國黑木耳菌株具有較高的遺傳多樣性。本研究利用酯酶同工酶技術(shù)對(duì)秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行分析,旨在為黑木耳菌種管理和種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究提供理論依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1供試菌株秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株及來源見表1。

    1.1.2培養(yǎng)基母種培養(yǎng)基(CPDA):20%馬鈴薯,2%葡萄糖,0.5% KH2PO4,0.3% MgSO4·7H2O,0.001% 維生素B1,1.2%瓊脂,pH值自然。同工酶制備液體培養(yǎng)基(元蔥培養(yǎng)基):20%元蔥,1%蔗糖,0.006%阿魏酸,pH值自然。

    1.1.3主要儀器高壓蒸汽滅菌鍋(MJ-54A型,上海施都凱儀器設(shè)備有限公司);超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2F型,蘇州凈化設(shè)備有限公司);電子分析天平(TB-214型,北京賽得利斯儀器系統(tǒng)有限公司);離心機(jī)(5418R型,德國Eppendorf);電泳儀(DYCZ-24B型,北京市六一儀器廠);凝膠成像系統(tǒng)(GEL-RAD型,美國伯樂)。

    1.2方法

    1.2.1樣品制備將黑木耳菌株接種于CPDA斜面培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng),待菌絲長滿管后,4 ℃冰箱保藏備用;將活化后的黑木耳菌株,接種到元蔥培養(yǎng)基中,250 mL三角瓶裝液量為100 mL,28 ℃靜置培養(yǎng)20 d。將菌絲體過濾,蒸餾水沖洗,濾紙吸干水分,稱質(zhì)量,放入研缽中,加入液氮充分研磨,分裝于離心管,8 000 r/min,4 ℃離心20 min,上清液為酶液。

    1.2.2酯酶同工酶的檢測采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳法[10],配制5%濃縮膠,10%分離膠,電極緩沖液為Tris-Glycine系統(tǒng),pH值8.3。上樣量:酶液6 μL,溴酚藍(lán)指示劑2 μL,10%蔗糖5 μL。濃縮膠電壓80 V,室溫,電泳45 min,分離膠電壓120 V,4 ℃,電泳4 h。取下凝膠,置于α、β-乙酸萘酯和堅(jiān)牢藍(lán)配制的染色液中,37 ℃,輕微振蕩,染色 25 min,將出現(xiàn)紅褐色酶帶的凝膠置于7%醋酸溶液中脫色、保存,掃描照相。

    1.2.3聚類分析相對(duì)遷移率Rf=X/Y,X為從點(diǎn)樣孔下沿開始,酶帶在凝膠中的遷移距離,Y為從點(diǎn)樣孔下沿開始,指示劑在凝膠中的遷移距離。在測量遷移距離時(shí),以酶帶的中部位置為準(zhǔn)。依據(jù)酯酶酶譜,按照條帶的有無進(jìn)行標(biāo)記,在相同遷移率位置上,有條帶的記為1,無條帶的記為0。利用NTSYS-pc 2.11軟件,分析得到秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳菌株的聚類分析樹狀圖。

    2結(jié)果與分析

    2.1酯酶同工酶酶譜分析

    秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株酯酶同工酶酶譜見圖1。根據(jù)各菌株間酶帶顏色和寬窄的差異[9],酯酶酶帶可分為:一級(jí)酶帶(色深而寬);二級(jí)酶帶(色較深而寬);三級(jí)酶帶(色較淺而窄);四級(jí)酶帶(色很淺而窄),結(jié)合酯酶酶譜,繪制酯酶同工酶模式圖(圖2)。

    圖1顯示,秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株共檢測到281條酯酶同工酶酶帶,各菌株有5~9條不等的酶帶,且多數(shù)為6~8條。41個(gè)供試菌株的遷移率分析表明,共有19條遷移率不同的酶帶,遷移率都在0.344~0.606之間。41個(gè)供試菌株在Rf值為0.356和0.469這2處均有酶帶出現(xiàn),可能為黑木耳的共有酯酶酶帶。41個(gè)菌株共得到16個(gè)酶譜類型,其中黑木耳36#、耳菊3#、耳266、耳913、耳2、耳269、神農(nóng)A8、RF201以及甘1各為1個(gè)酶譜類型;耳5#、分四、國興2#、野1#、耳1#、國興1#、耳冬梅1#、高產(chǎn)1#、耳3#、新耳5#、新科1#、木耳(袋)、耳256以及新科的酶譜帶型基本相同;耳91、新科4#、LY16#、商洛Li、耳801以及耳261的酶譜帶型基本相同;QD3#、QD4#、新科5#以及Au29的酶譜帶型基本相同;耳238與耳629的酶譜帶型基本相同;耳268與112冬的酶譜帶型基本相同;國興3#與分六的酶譜帶型基本相同;耳235與耳97-2的酶譜帶型基本相同。

    圖2顯示,在相同Rf值處,不同黑木耳菌株的酶帶等級(jí)不同(酶帶顏色深淺與寬窄不同)。且41個(gè)黑木耳菌株在Rf值為0.441處,一級(jí)酶帶較多,表明黑木耳菌株該酯酶活性高且含量高;在Rf值為0.469與0.494這2處,二級(jí)酶帶較多,表明這些酯酶活性較高且含量較高;在Rf值為0.356、0.396以及0.586等處,三級(jí)酶帶與四級(jí)酶帶較多,表明這些酯酶活性低且含量低。

    2.2聚類分析

    根據(jù)酯酶酶譜,應(yīng)用NTSYS-pc 2.11軟件,構(gòu)建秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株聚類分析樹狀圖(圖3)。

    圖3顯示,當(dāng)遺傳相似系數(shù)為70%時(shí),秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株被聚類分成3類。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為80%時(shí),41個(gè)黑木耳供試菌株被聚類分成5類,第1類:耳266、國興3#以及分六;第2類:耳5#、分四、國興2#、野1#、耳1#、國興1#、耳冬梅1#、高產(chǎn)1#、耳3#、新耳5#、新科1#、木耳(袋)、256、新科、耳菊3#、耳268、112冬、耳91#、新科4#、LY16#、商洛Li、耳801、耳261、36號(hào)、耳238、耳629以及耳913;第3類:QD4#、QD3#、新科5#、Au29以及RF201;第4類:耳97-2、耳235、耳269以及神農(nóng)A8;第5類:耳2以及甘1。

    3討論

    同工酶分子標(biāo)記是從基因產(chǎn)物水平來研究生物的遺傳變異,是一種重要的分子遺傳標(biāo)記技術(shù)[11],酶帶的變化可作為鑒定物種,研究分類、進(jìn)化、遺傳和變異的重要指標(biāo)[12],也是對(duì)食藥用菌進(jìn)行遺傳分析或生化鑒定中的最適標(biāo)記手段之一。自Markert等提出同工酶概念以來,酯酶同工酶標(biāo)記技術(shù)在食用菌研究中逐步得到廣泛的應(yīng)用[13-15]。

    本研究將秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株在嚴(yán)格統(tǒng)一的條件下,如相同的培養(yǎng)溫度、時(shí)間,相同的酶液制備方法等,采用5%濃縮膠與10%分離膠進(jìn)行垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳,共檢測到19條不同遷移率的酯酶酶帶,16個(gè)酶譜類型,當(dāng)遺傳相似系數(shù)為80%時(shí),聚類分成5類,如耳97-2、耳235、耳269以及神農(nóng)A8被聚類在一個(gè)分支上,表明這4個(gè)菌株親緣關(guān)系較近。彭浩等對(duì)陜南10種黑木耳主要栽培種進(jìn)行酯酶同工酶的分析,檢測到8條不同遷移率的酯酶酶帶,當(dāng)遺傳相似系數(shù)為80%時(shí),聚類分成5類[16]。與之相比,本研究選用的供試菌種地域和菌株數(shù)更為廣泛,且檢測出的酯酶酶帶較豐富,聚類結(jié)果更加精細(xì)。

    通過酯酶同工酶分析,得到秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株聚類分析樹狀圖,初步鑒定了不同菌株之間的親緣關(guān)系。結(jié)果表明,秦巴山區(qū)黑木耳菌株的酯酶多態(tài)性高,種質(zhì)資源較為豐富,為秦巴山區(qū)黑木耳優(yōu)良菌種的選育以及菌種的管理工作提供理論依據(jù)。由于酯酶活性很容易受到外界因素的影響,酯酶同工酶的穩(wěn)定性以及試驗(yàn)的可重復(fù)性不高,對(duì)秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株進(jìn)行RAPD和酯酶同工酶指紋圖譜的分析還有待進(jìn)一步研究。

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