SSR標記在糯玉米品種鑒定上的應用

張振良++郝德榮++陳國清++陸虎華+石明亮+冒宇翔++吳嘉點+黃小蘭+程玉靜+周廣飛++薛林

摘要：采用NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標記法》中的20對簡單重復序列（SSR）引物對市場上抽檢的蘇玉糯11、蘇玉糯901、蘇玉糯13、蘇玉糯14、蘇玉糯639等5個糯玉米品種進行真實性鑒定。結(jié)果表明，每個抽檢品種與標準品種至少有6個差異位點，這5個品種均與相應的標準品種不同；此外，umc1545y2、umc1335y5、umc2105k3、umc1705w1、umc1125y3、umc2007y4、phi053k2、bnlg2305k4等8對引物多態(tài)性較好，在今后糯玉米品種鑒定中可優(yōu)先采用。

關(guān)鍵詞：糯玉米；SSR標記；品種；鑒定；應用

中圖分類號： S513.03文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0104-02

收稿日期：2015-05-15

作者簡介：張振良（1987—），男，山東東平人，碩士，研究實習員，研究方向為玉米分子遺傳和育種。E-mail：zhenliang1110@163.com。

通信作者：薛林，研究員，研究方向為玉米育種。E-mail：417803648@qq.com。糯玉米因其營養(yǎng)豐富、風味獨特、適口，越來越受到廣大消費者歡迎。糯玉米種植面積越來越大，品種數(shù)量逐年上升，品種真實性鑒定需求也急劇增加。糯玉米育種中由于少數(shù)骨干親本的集中應用，造成品種間遺傳基礎(chǔ)狹窄，僅從形態(tài)上鑒定存在一定困難，給玉米品種的生產(chǎn)、經(jīng)營、使用以及種子管理部門的監(jiān)督帶來一定挑戰(zhàn)。隨著DNA指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展，以簡單重復序列（SSR）為代表的分子標記技術(shù)逐漸成熟并應用于農(nóng)業(yè)種子生產(chǎn)研究和種子質(zhì)量管理[1-2]。2014年，中國農(nóng)業(yè)部公布了一系列主要農(nóng)作物品種鑒定的行業(yè)標準，如NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標記法》、NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標記法》，代替了2007年公布的行業(yè)標準，使SSR標記技術(shù)對農(nóng)作物品種真實性鑒定的方法更加完善和準確。為進一步明確SSR標記在糯玉米品種真實性鑒定中的作用，本研究采用NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標記法》標準鑒定5個疑似套牌糯玉米雜交種的真實性，同時探討SSR分子標記技術(shù)在糯玉米品種真實性鑒定中的應用前景。

1材料與方法

1.1材料

市場上抽檢的蘇玉糯11、蘇玉糯901、蘇玉糯13、蘇玉糯14、蘇玉糯639等5個糯玉米品種，疑是套牌種子依次編號為A、B、C、D、E，標準品種分別編號為A1、B1、C1、D1、E1。其中套牌種子由種子管理部門提供，標準品種由江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所玉米室提供。分別對每個樣品（品種）的5個個體單獨進行分析。

1.2DNA提取

取約0.2 g玉米幼嫩葉片于液氮中研磨，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入800 μL預熱65 ℃的CTAB提取緩沖液，混勻，水浴60 min，每隔10 min小心搖動離心管；取出離心管，待冷卻至25 ℃，加入800 μL三氯甲烷 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1），小心充分搖動試管至有機相呈深綠色，室溫下于8 000 r/min離心 10 min；用剪口的1 mL槍頭將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入2/3體積預冷的異丙醇（-20 ℃），小心混勻；8 000 r/min 離心 2 min，棄上清液，用5 00 μL 70%乙醇清洗2次，棄上清液，干燥沉淀，加150 μL TE溶解。

1.3PCR擴增

根據(jù)NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標記法》標準，選用bnlg439w1、umc1335y5、umc2007y4、bnlg1940k7、umc2105k3、phi053k2、phi072k4、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、umc1125y3、bnlg240k1、phi080k15、phi065k9、umc1492y13、umc1432y6、umc1506k12等20對SSR標記，均勻分布在玉米10對染色體上。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系（10 μL）為：1 μL 模板DNA （100～150 ng），上、下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL、1 μL 10×Taq buffer、0.7 μL MgCl2、0.8 μL dNTP（2.5 mmol/L）、DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.2 μL（TIANGEN），其余以超純水補足至所需體積。反應液上加蓋15 μL石蠟油，以防反應過程中水分蒸發(fā)。PCR程序為： 94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共31個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃恒溫冷藏。

1.4非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及顯色。

PCR產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。

1.5品種真實性鑒定標準

從樣品中隨機抽取5個單株作為檢測樣本。根據(jù)抽檢樣本電泳譜帶和標準品種電泳譜帶的一致性鑒定品種的真實性。結(jié)果按照農(nóng)業(yè)部頒布的行業(yè)標準NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標記法》判定。當樣品間差異位點數(shù)≥2，判定為不同；當樣品間差異位點數(shù)=1，判定為近似；當樣品間差異位點數(shù)=0，判定為極近似或相同。

2結(jié)果與分析

2.1糯玉米雜交種DNA檢測

對提取的糯玉米基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，提取的玉米基因組DNA主帶清晰一致，適合進一步的SSR分析。

2.2品種內(nèi)遺傳一致性分析

20對引物中有umc1125y3、bnlg161k8、umc1506k12等3對引物在品種內(nèi)發(fā)生變異，均發(fā)生在抽檢的蘇玉糯13、蘇玉糯14、蘇玉糯639中，且都屬于在5個單株檢測重復中只發(fā)現(xiàn)1個不一致的情況（圖2）。20對引物對10個糯玉米雜交種的200次擴增中，出現(xiàn)了共計5次品種內(nèi)變異，占2.5%，說明品種內(nèi)變異較小，電泳譜帶比較結(jié)果是可靠的。

2.3糯玉米SSR鑒定分析

對抽檢的5個糯玉米雜交種和標準品種電泳譜帶比較可知，抽檢的蘇玉糯11與標準品種相比有11個差異位點，占引物總數(shù)的55%；蘇玉糯901與標準品種相比有7個差異位點，占引物總數(shù)的35%；蘇玉糯13與標準品種相比有6個差異位點，占引物總數(shù)的30%；蘇玉糯14與標準品種相比有9個差異位點，占引物總數(shù)的45%；蘇玉糯901與標準品種有6個差異位點，占引物總數(shù)的30%（表1）。按照農(nóng)業(yè)部頒布的行業(yè)標準NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR標記法》，可判定待檢測的5個抽檢樣品與相應的標準品種為不同品種。

2.4引物多態(tài)性分析

umc1545y2在5個品種鑒定中均為差異位點（圖3），umc1335y5、umc2105k3、umc1705w1、umc1125y3在4個品種中均檢測到差異位點，umc2007y4、phi053k2、bnlg2305k4、bnlg1702k1 在3個品種中均檢測到差異位點（表1）。上述差異位點均在多個抽檢品種與標準品種間檢測到，說明這些位點多態(tài)性較高。

3結(jié)論與討論

SSR分子標記為共顯性遺傳，反映的是具體DNA片段的大小，既不受組織器官及發(fā)育階段的影響，也不受季節(jié)和環(huán)境因素的制約，與傳統(tǒng)田間種植鑒定相比，是一種更加快速、準確鑒定品種真實性的方法，廣泛應用于種質(zhì)資源分析和農(nóng)作物品種鑒定[3-7]。本研究采用SSR標記對市場上抽檢的5份糯玉米品種進行鑒定，結(jié)果表明，抽檢的5個糯玉米品種均與相應的標準品種不同，與田間鑒定結(jié)果一致，說明SSR標記鑒定結(jié)果可靠準確。

引物篩選是SSR標記鑒定品種真實性的關(guān)鍵，選用多態(tài)性高、染色體上分布均勻、穩(wěn)定性好的引物可有效提高工作效率、降低成本[7-8]。本研究采用農(nóng)業(yè)部公布的NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標記法》中的前20對引物，這20個SSR位點的帶型清晰、穩(wěn)定性較好，平均分布在玉米的10條染色體上，其中有9對引物在至少3個糯玉米品種中檢測出差異位點，說明這9對引物在糯玉米品種中多態(tài)性較好，在今后糯玉米品種鑒定中可優(yōu)先采用，以減少工作量、降低成本。

由于剩余遺傳效應作用，品種內(nèi)變異普遍存在，品種內(nèi)變異導致品種內(nèi)不同個體之間重復帶型不一致，在品種真實性鑒定中會干擾判斷[3]。為避免糯玉米品種內(nèi)產(chǎn)生遺傳變異造成的誤差，本研究對每份糯玉米雜交種均采用5個單株重復。結(jié)果表明，20對引物只有3對引物發(fā)生品種內(nèi)變異，且5個單株檢測重復中只發(fā)現(xiàn)1個不一致情況，屬于可控范圍內(nèi)。針對品種內(nèi)重復性差的樣品，則需要擴大檢測樣品的重復次數(shù)。

品種真實性鑒定作為種子生產(chǎn)和種子檢驗的重要環(huán)節(jié)，應得到種子管理部門的高度重視。SSR標記因其多態(tài)性高、重復性強的特點已被農(nóng)業(yè)部確定為品種真實性鑒定的有效方法。SSR分子標記技術(shù)在種子管理工作中應充分發(fā)揮作用，一方面應用于市場糯玉米種子質(zhì)量監(jiān)督抽查，以阻止套牌侵權(quán)品種上市流通，保障農(nóng)民合法權(quán)益；另一方面應用于糯玉米品種審定區(qū)域試驗，以維護區(qū)試工作中的公正、公平，維護育種單位以及廣大種子生產(chǎn)者的利益。

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