小麥高蛋白含量基因與部分優(yōu)質基因的聚合研究

胡云 徐如宏++程劍平

摘要：利用分子標記輔助選擇與傳統(tǒng)育種相結合的方法，將來自美國的小麥高蛋白基因GPC-B1與抗白粉病基因Pm21，優(yōu)質亞基1Dx5、1Dy10等優(yōu)良基因聚合到同一植株。首先將攜帶高蛋白含量基因GPC-B1小麥分別與抗白粉病基因Pm21、優(yōu)質亞基1Dx5、1Dy10小麥雜交得到F2，利用分子標記輔助選擇對親本及雜交后代進行篩選，結合小麥抗病性鑒定、小麥籽粒蛋白質含量測定等方法對結果做進一步鑒定。結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2群體中100個株系中有6株聚合了GPC-B1、Pm21、1Dx5、1Dy10 4種基因，11株聚合高蛋白基因GPC-B1和抗白粉病基因Pm21，8株聚合了GPC-B1和5+10亞基。本研究為培育具有高蛋白含量及多個優(yōu)質基因的小麥優(yōu)良品系提供了育種材料和理論依據(jù)。

關鍵詞：小麥；優(yōu)質；基因；聚合；高蛋白

中圖分類號： S512.103文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0050-03

收稿日期：2015-05-13

基金項目：貴州省省長基金 （編號：2005175）。

作者簡介：胡云（1982—），女，貴州織金人，講師，從事作物遺傳育種研究。E-mail：705498263@qq.com。

通信作者：徐如宏，教授，碩士生導師，從事小麥遺傳育種及分子標記研究，E-mail：xrhgz@163.com；程劍平，教授，博士生導師，從事野生麥類作物和我國西南巖溶地區(qū)石漠化綜合治理研究，E-mail：chengjianping@gmail.com。傳統(tǒng)育種技術通常受環(huán)境條件和顯隱性關系等因素的影響，存在效率低、選擇時間長等缺點。分子標記輔助選擇則可降低育種盲目性、縮短育種時間、提高選擇效率[1-2]。在聚合育種方面，相關報道并不少見，如通過聚合育種獲得了帶有抗白粉病基因Pm2+Pm4a，Pm4a+Pm21的新品系[3-4]，以及具有優(yōu)質亞基HNW-GS 1、14+15、5+10的聚合體[5-8]。但是，相關報道基本上是針對不同基因控制的同一表現(xiàn)性狀，而本研究是利用傳統(tǒng)育種和分子標記輔助選擇相結合的方法，將高蛋白含量基因GPC-B1、抗白粉病基因Pm21以及優(yōu)質亞基1Dx5和1Dy10等控制不同性狀的優(yōu)良基因進行雜交，選育出聚合有GPC-B1、Pm21、1Dx5和1Dy10等優(yōu)質基因的植株，為小麥選育優(yōu)良種質資源提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

本研究選用11個試驗小麥材料，詳見表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取采用CTAB法[9]提取小麥親本、雜交F1總DNA，以及100個F2抗病單株的DNA。待小麥長至3～4片葉時，取0.2 g新鮮幼嫩葉片放入研缽中，加入750 μL的提取緩沖液磨碎，緩沖液為50 mmol/L EDTA-Na2，100 mmol/L Tris-HCl，2% CTAB，100 mmol/L NaCl；倒入1.5 mL 離心管65 ℃下水浴1 h，其間上下顛倒2次；加入等體積的氯仿-異戊醇（24 ∶ 1），混勻10 min，18 ℃、13 000 r/min 冷凍離心機內離心10 min；取上清液放入1.5 mL 離心管中，加入750 μL異丙醇混勻10 min；去上清液，加入1 mL 70%乙醇清洗DNA，室溫下放置5～10 min，7 500 r/min 離心5 min，去上清液、干燥。加入100 μL 0.1×TE混勻，37 ℃下水浴1 h，取2 μL總DNA，1%瓊脂糖電泳檢測其純度和濃度。其余DNA在4 ℃條件下保存。

1.2.2小麥優(yōu)質基因的分子標記輔助選擇（1）小麥高蛋白基因的SSR分析。與高蛋白基因GPC-B1連鎖的特異引物為Xuhw89[9]，其序列為：UHW89-BF：5′-TCTCCAAGAGGGGAGAGACA-3′，UHW89-R：5′-TTCCTCTACCCATGAATCTAGCA-3′。特異引物UHW89-BF、UHW89-R擴增多態(tài)性標記為SSR122。所有PCR反應都在Perkin-Thermocycle 480上進行，反應總體積為20 μL。SSR反應體系中含有10 mmol/L Tris-HCl（pH值8.8），50 mmol/L KCl；2 mmol/L MgCl2；100 μmol/L dNTP；0.5 μmol/L 特異引物；1U Taq DNA聚合酶（上述藥品均購自上海生工生物工程技術服務有限公司）；50～100 ng模板DNA，加ddH2O至終體積 20 μL。加1滴礦物油覆蓋后進行擴增。反應條件為94 ℃預變性 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72℃ 2 min，循環(huán)40次；最后 72 ℃ 延伸5 min，4 ℃ 保存。

（2）小麥抗白粉病基因的SCAR分析。與Pm21基因連鎖的SCAR引物序列：D-R： 5′-CCTCGTTGTCAGCCTCTATG-3′，D-L：5′-CTATGGAGTATCAATACGACTCCT-3′。 其擴增多態(tài)性標記SCAR140。SCAR反應體系中含有 10 mmol/L Tris-HCl（pH值 8.8），50 mmol/L KCl；2 mmol/L MgCl2；100 μmol/L dNTP；0.5 μmol/L 特異引物；1 U Taq DNA聚合酶；50～100 ng模板DNA，加ddH2O至終體積20 μL。加1滴礦物油覆蓋后進行擴增。反應條件為94 ℃預變性 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72℃ 2 min，循環(huán)40次；最后 72 ℃ 延伸 5 min，4 ℃保存。

（3）小麥高分子量谷蛋白亞基的PCR分析[10-15]。1對Glu-D1y位點的特異引物設計[7]，其序列為：10S-1：5′-GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG-3′，10S-2：5′-TGGAGAAGTTGGATAGTACC-3′；與Glu-D1x位點連鎖的特異引物序列為：P1：5′-GCCTAGCAACCTTCACAATC-3′，P2：5′-GAAACCTGCTGCGGACAAGT-3′。1Dx5基因擴增片段為450 bp，1Dy10基因擴增片段為576 bp。擴增程序同上。

1.2.3小麥白粉病的抗性鑒定參照徐如宏等的方法[5]。當感病對照萊州137發(fā)病嚴重時對田間所有小麥植株進行白粉病抗性鑒定和記錄。

1.2.4小麥籽粒蛋白質含量的測定采用微量凱氏定氮法測定小麥籽粒的蛋白質含量。準確稱取0.1 g干燥樣品3份于50 mL消化管內，加0.5 g催化劑（硫酸鉀 ∶ 硫酸銅=3 ∶ 1）、5 mL 30%過氧化氫-濃硫酸-蒸餾水（3 ∶ 2 ∶ 1）混合液。稍加振蕩，斜置于電爐上，在通風櫥內進行消化；消化到溶液顯淺藍綠色的透明狀時，繼續(xù)加熱沸騰10 min。撤離熱源，待消化液冷卻至室溫后，加水10～20 mL，待溶液溫度降至室溫后，轉入100 mL的容量瓶中，加水稀釋到刻度混勻備用。然后用Foss kjeltecTM2200型全自動凱氏定氮儀測定。

2結果與分析

2.1小麥高蛋白含量基因GPC-B1的SSR標記

引物Xuhw89 在122 bp的位置顯示特征帶，4個小麥高蛋白材料都在同一位置出現(xiàn)了1條特征DNA片段。對照材料萊州137和其他5個貴州地方小麥材料都不具有此特征帶（圖1）。再對F2群體的100個單株進行檢測，其中76株中檢測出攜帶GPC基因，24株未檢測出特異帶（圖2）。

2.2Glu-1位點等位基因的PCR檢測

2.2.1小麥優(yōu)質亞基1Dx5特異PCR標記對F2群體的

100個單株進行檢測，其中在38株中未檢測出特異帶，62株中檢測出攜帶1Dx5基因（圖3）。1Dx5亞基引物的特異性較強，可用作1Dx5基因的PCR檢測。

2.2.21Dy10亞基特異PCR標記對F2群體的100個單株進行檢測），其中42個樣本株中檢測出攜帶1Dy10基因，58株中未檢測出特異帶（圖4）。對HWM-GS基因檢測結果表現(xiàn)為共顯性（10亞基的PCR標記）或顯性（5亞基的PCR標記），與梁榮奇等的研究結果[15]一致。

2.3抗白粉病基因的SCAR標記

對F2群體中100個單株進行抗白粉病基因Pm21分子標記檢測，結果見圖5和表2。具有抗病標記的單株有78株，無特異標記的有22個單株。在F2群體中，抗白粉病性狀呈現(xiàn)近3 ∶ 1的比例，表明了抗白粉病基因Pm21是顯性單基

因控制的遺傳。

2.4小麥白粉病抗性鑒定

為驗證小麥抗白粉病基因分子標記結果，對親本材料及F2群體中的100個單株分別進行了田間白粉病抗性鑒定。鑒定結果表明，親本材料中除X-2003、貴農(nóng)775、貴農(nóng)17號、貴農(nóng)21、laura×貴農(nóng)21 F1對白粉病免疫以外，萊州137和4份高蛋白材料A-GPC、R-GPC、PF638741、PI638740均感病。另外，PI638740的成熟期比其他研究材料提前1周左右；F2群體中100個單株的白粉病抗性見表2（此處僅列出前20個單株的鑒定結果）。

在F2群體中的100個單株中，同時具有5+10亞基、高蛋白基因GPC-B1和抗白粉病基因Pm21標記的單株有6株；同時有高蛋白基因、抗白粉病基因標記的有11株；具有高蛋白基因GPC-B1和5+10亞基的群體為8 株。

2.5小麥籽粒蛋白質含量的測定

用微量凱氏定氮法對供試材料進行蛋白質含量的測定（表3）。 7個母本材料中小麥蛋白質含量在13.05%～1861%，平均含量16.55%。4個父本中PI638740的蛋白質含量比另外3個材料較高，為20.41%；其余3個高蛋白材料比部分貴州當?shù)夭牧系牡鞍踪|含量低，而分子標記的結果表明它們均含有高蛋白含量基因GPC-B1，這可能是由于地理、氣候等方面的因素所致，使其性狀未表達。在4組雜交F1中，小麥籽粒蛋白質含量有的在2個親本之間，有的比蛋白質含量最低的親本稍小。

3討論

本研究表明，來自美國的高蛋白材料PI638740不僅蛋白質含量比貴州當?shù)匦←湼?，而且其成熟期也提?周左右[8-13]。對于4個攜帶高蛋白基因的育種材料而言，綜合其分子標記輔助選擇、小麥籽粒蛋白質含量的測定、抗病性鑒定以及成熟時間來看，在今后的小麥育種過程中，我們將首選PI638740作為父本材料來進行下一步的聚合研究。蛋白質含量低一直是貴州小麥品質發(fā)展的一個瓶頸，GPC基因是小麥育種者眼中的一個亮點，是提高貴州小麥蛋白質含量的一個寶貴資源，將其轉育到具有優(yōu)質基因的小麥種質中是一個重要育種目標，有望進一步改善貴州小麥的營養(yǎng)價值，以逐漸符合人們對小麥越來越高的飲食要求。

在本研究中，利用分子標記輔助選擇和多基因聚合研究相結合，快速準確鑒別所需轉移的目的基因，對選育優(yōu)質、高蛋白質、抗病的小麥品種（系）具有重要意義。跟傳統(tǒng)育種技術相比，分子標記技術在育種過程中不僅可以對早代材料的目的基因進行選擇，并且還能快速掌握親本的育種特點，對其選擇適合的雜交方式如回交、復交等，可縮短育種年限，大大提高育種效率，加快品種的繁育速度。

本研究通過傳統(tǒng)育種技術和分子標記相結合的育種方式，將控制高蛋白含量的基因GPC-B1、與烘烤品質有關的優(yōu)質亞基1Dx5、1Dy10和抗白粉病基因Pm21中的2個或2個以上的基因聚合到同一植株中，為培育貴州小麥新品系提供了重要育種材料和理論依據(jù)。

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