主要作物中PAL基因家族的鑒定和序列分析

蓋江濤+++沈建凱++王鵬

摘要：苯丙氨酸解氨酶（PAL，phenylalanine ammonia-lyase [EC：4.3.1.24]）存在于各種植物和部分微生物中，是與植物抗病性相關(guān)的關(guān)鍵酶，具有重要的植物生理意義。采用BLASTP的方法，依托全基因組數(shù)據(jù)庫，獲得了擬南芥[Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.]、水稻（Oryza sativa L.）、玉米（Zea mays Linn.）、小麥（Triticum aestivum Linn.）、谷子[Setaria italica （L.） P. Beauv.]、大豆[Glycine max （Linn.） Merr.]6種植物中的PAL基因家族共45條序列，對其進行了系統(tǒng)進化分析、生物信息學(xué)分析等。分析結(jié)果顯示：單子葉植物與雙子葉植物分別聚集在不同的分支，說明單子葉植物水稻、玉米、小麥、谷子親緣關(guān)系較近，雙子葉植物擬南芥、大豆親緣關(guān)系較近，而單子葉植物與雙子葉植物親緣關(guān)系較遠，也說明PAL基因的分化在單子葉植物和雙子葉植物分化前形成；酸性蛋白質(zhì)占93.3%，穩(wěn)定性蛋白占97.8%，有信號肽的蛋白占2.2%，有導(dǎo)肽的蛋白占4.4%，所有蛋白均為有明顯跨膜現(xiàn)象的親水性蛋白；所有PAL基因亞細胞定位于細胞質(zhì)中，都有蛋白活性位點。分析結(jié)果為進一步研究作物中PAL代謝機理提供理論支持。

關(guān)鍵詞：苯丙氨酸解氨酶；PAL；基因家族；氨基酸

中圖分類號： Q78文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）06-0045-05

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL，EC：4.3.1.24）存在于各種植物和少數(shù)微生物中，是目前研究較多的與植物抗病性相關(guān)的酶，與植物抗毒素及酚類化合物的形成密切相關(guān)[1-2]。PAL不能直接抵御病蟲害，但在植物體內(nèi)通過苯丙烷類途徑進一步轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素、黃酮、異黃酮、生物堿等次生代謝產(chǎn)物來增強植株的抗性[3-4]。

1961年，Koukol等首次記錄了高等植物中PAL酶的提取分離[5]，此后關(guān)于這種酶的研究迅速展開，目前PAL已從水稻[6]、小麥[6]等多種植物中得到分離純化，并對擬南芥[7]、水稻[8]等植物PAL基因進行了cDNA克隆和序列分析。

研究發(fā)現(xiàn)，不同種植物中PAL活性不同，如水稻葉的PAL活性遠比小麥的高[6]。在同一株植物中，不同的組織部位PAL活性也不同，一般來說越嫩的部位PAL活性越高[9]，如楊樹PAL活性在正在發(fā)育的木質(zhì)部、嫩莖和嫩葉中最高[10]。免疫細胞化學(xué)研究顯示PAL合成于柵欄細胞和海綿細胞，主要在細胞質(zhì)和葉綠體內(nèi)[11]。組織印跡顯示PAL的mRNA常出現(xiàn)在表皮和微管附近的組織細胞中[12]。

PAL基因參與復(fù)雜的植物防御體系[13]，比如受傷害、病原菌侵染及光照（紅光、白光等）時，PAL與植物抗性表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。玉米大斑病[14]、小斑病[15]、葉斑病[16]，小麥赤霉病[17]，水稻抗UV-B輻射及稻瘟病[18]、大豆疫霉根腐病[19]等的研究中都證實感染病原菌的植物PAL活性增強。

在擬南芥中，基因組編碼4個PAL基因，分別為PAL1 （AT2G37040）、PAL2（AT3G53260）、PAL3（AT5G04230）、PAL4（AT3G10340）。用過量的Cu處理植物顯示PAL活性增加，當(dāng)同時再增加Si的含量時，PAL1、PAL2、PAL3呈現(xiàn)出相似的基因表達模式，表達水平均降低；而PAL4無論是否增加Si的含量，都沒有引起PAL4表達水平降低。說明PAL基因?qū)χ参锏姆巧锩{迫有作用，但是4個基因表達模式有區(qū)別[20]。

本研究以已知PAL基因功能的擬南芥[Arabidopsis thaliana （Linnaeus） Heynhold]的PAL基因為參考，以禾本科（Poaceae）植物水稻（Oryza sativa Linnaeus）、玉米（Zea mays Linnaeus）、小麥（Triticum aestivum Linnaeus）、谷子[Setaria italica （Linnaeus） P. de Beauvois]、豆科植物大豆[（Glycine max （Linnaeus） Merrill]作為研究對象，以其全基因組數(shù)據(jù)庫為依托，通過BLAST的方法獲得了這5種植物PAL基因家族的全部序列，通過系統(tǒng)發(fā)育分析、理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)分析等生物信息學(xué)方法分析PAL基因家族，比較主要作物中PAL基因的特性，為推動主要作物中PAL基因功能研究提供理論支持。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫搜索

從phytozome V9.1[21] （http：//www.phytozome.net）中搜索得到擬南芥、水稻、玉米、谷子、大豆的PAL基因信息，從gramene（http：//ensembl.gramene.org/Triticum_aestivum/Info/Index）中搜索得到小麥的PAL基因信息，并下載數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列。

1.2多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

用Probcons[22]軟件對所得數(shù)據(jù)進行多序列比對，并于MEGA6.0[23]中對比對結(jié)果進行手動調(diào)整。用MrBayes 3.2.2[24]對調(diào)整后的序列進行系統(tǒng)聚類分析，設(shè)置1 000 000代檢測，取樣頻率為1 000，4條Markov鏈，其余參數(shù)均為軟件默認(rèn)值，運行2次，分裂頻率（split frequencies）小于0.01時終止運行。所得的系統(tǒng)發(fā)育進化樹在Figtree v1.4.0軟件中進行查看、編輯。

1.3蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

采用ProtParam tool[25] （http：//web.expasy.org/protparam/）在線工具預(yù)測分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，應(yīng)用TMpred[26]程序（http：//www.ch.embnet.org/software/TMpred-form.html）在線分析來預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向，亞細胞定位應(yīng)用Cell-PLoc 2.0 package[27]軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進行在線分析。用TargetP 1.1 Server[28] （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）在線預(yù)測氨基酸序列導(dǎo)肽，應(yīng)用signalP 4.1 server[29] （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）中完成蛋白質(zhì)信號肽的預(yù)測。活性位點運用在線分析軟件Expasy[30] （http：//prosite.expasy.org/）進行分析。

1.4擬南芥PAL基因生育期芯片數(shù)據(jù)表達模式的分析

從Plant Expression Database[31]網(wǎng)站的擬南芥數(shù)據(jù)庫（http：//www.plexdb.org/plex.php？database=Arabidopsis）中下載RMA文件，提取擬南芥的4條PAL基因（AT2G37040、AT3G53260、AT5G04230、AT3G10340）分別在各生育期組織[（子葉（7 d）、下胚軸（7 d）、幼苗（7 d）、幼葉（10 d）、根（7 d）、莖（17 d）、花（>21 d）、雄蕊（>21 d）、雌蕊（>21 d）、花粉（6周）、植株（21 d）]的表達情況，結(jié)果用gplots軟件包中的heatmap.2軟件繪制熱圖。

2結(jié)果與分析

2.1PAL基因家族的系統(tǒng)進化分析

通過BlastP的方法，去掉冗余序列，共得到45條氨基酸序列，其中擬南芥4條、水稻5條、玉米5條、谷子4條、小麥20條、大豆7條。對45條編碼PAL的氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖1）。分析結(jié)果顯示這45條PAL基因家族序列聚為明顯的2支（Ⅰ、Ⅱ），單子葉植物綱禾本科的水稻、玉米、小麥、谷子聚為一支（Ⅰ），雙子葉植物綱的擬南芥、大豆聚為一支（Ⅱ）。說明在進化過程中，PAL基因的分化在單子葉植物和雙子葉植物分化前形成；且主要作物單子葉植物綱禾本科的水稻、玉米、小麥、谷子的親緣關(guān)系較近，它們與雙子葉植物綱的擬南芥、大豆親緣關(guān)系較遠。

在已知的擬南芥PAL基因功能的前提下，可以推測出與擬南芥最近的分支上的序列可能與擬南芥中PAL基因具有相似功能。小麥、大豆2個物種的PAL基因在分支上聚集得相對集中，推測他們在物種形成中具有重要的生理功能。

2.2PAL蛋白的理化性質(zhì)分析

對45條氨基酸序列進行理化性質(zhì)分析。結(jié)果顯示：除Traes_1AS_6BDC65775、Traes_4AL_892C47ED5、Traes_2AS_EC4ADE04E為堿性蛋白（理論等電點pI>7）外，其余蛋白均為酸性蛋白質(zhì)（理論等電點pI<7）（圖2）；根據(jù)Guruprasad等的方法[32]，除Traes_1AS_6BDC65775為不穩(wěn)定性蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)Ⅱ>40）外，其余蛋白均為穩(wěn)定性蛋白（Ⅱ<40） （圖3）；相對分子量除Traes_1BS_A3B2A0DAD為46.97 ku、Si009345m為91.20 ku外，其余位于65.49～78.34 ku之間（圖4），與之前報道的分子量一般在55～88 ku之間一致[33]；所有蛋白都有明顯跨膜現(xiàn)象；除Traes_1AS_6BDC65775有信號肽（圖5）外，其余蛋白均無信號肽；僅小麥基因Traes_1AS_6BDC65775、Traes_2AS_EC4ADE04E具有葉綠體轉(zhuǎn)運肽（Chloroplast transit peptide，CTP），其余氨基酸序列均沒有導(dǎo)肽。

所有蛋白均為親水性蛋白（GRAVY<0）。半衰期一致表現(xiàn)為：序列的N-端為甲硫氨酸（Met），在哺乳動物的活體中半衰期為30 h，在酵母活體中半衰期大于20 h，在大腸桿菌的活體中半衰期大于10 h。

2.3PAL的結(jié)構(gòu)分析

所有PAL基因亞細胞定位于細胞質(zhì)中。活性位點分析得出：所有基因都有活性位點，Glyma10g35381.1、Glyma20g32135.1的活性位點為GTITASGDLvPLSyvaG、LOC_Os02g41670.1、GRMZM2G170692_T01、GRMZM2G334660_T01，Si016475m、Si019385m的活性位點為GTVTASGDLvPLSyiaG，其余氨基酸序列的活性位點為GTITASGDLvPLSyiaG，具有活性位點的蛋白均屬于PAL絲氨酸（Ser）酶，屬于PAL基因家族的特征序列。

2.4擬南芥PAL基因生育期芯片中的表達模式

根據(jù)擬南芥各生育期芯片可以得出其4條PAL基因的表達模式。由圖6可知，AT3G53260和AT2G37040在花粉（6周）中無明顯表達，在其余組織中均有較強表達；AT3G10340主要在雄蕊（>21 d）、花（>21 d）、根（7 d）中有較強表達，在其他組織中無明顯表達；AT5G04230在子葉（7 d）中有較弱表達，在其余各組織中均無明顯表達。

3結(jié)論與討論

PAL是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝途徑第一步反應(yīng)的酶，是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，苯丙烷類代謝途徑的產(chǎn)物在植物生長發(fā)育過程中起著重要的作用，而這些物質(zhì)的含量總是與PAL的活性密切相關(guān)，因此PAL對植物有著非常重要的生理意義。

本研究對擬南芥、水稻、玉米、小麥、谷子和大豆6種植物中共45條PAL基因家族蛋白進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，單子葉植物水稻、玉米、小麥、谷子的基因聚集在一支，雙子葉植物擬南芥、大豆基因聚集在一支，單子葉植物與雙子葉植物分別聚集在不同的分支，說明單子葉植物水稻、玉米、小麥、谷子親緣關(guān)系較近，雙子葉植物擬南芥、大豆親緣關(guān)系較近，單子葉植物與雙子葉植物親緣關(guān)系相對較遠，說明以PAL基因家族構(gòu)建系統(tǒng)進化樹能夠準(zhǔn)確地反映植物物種之間的親緣關(guān)系及進化關(guān)系，也說明在進化過程中，PAL基因的分化在單子葉植物和雙子葉植物分化前形成；同時，與擬南芥最近的分支上共有7條大豆基因和1條小麥基因，推測它們可能屬于PAL基因家族；在已知的擬南芥的PAL基因功能的前提下，可以推測出與擬南芥最近的分支上的序列可能與擬南芥中PAL基因具有相似功能。

理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，酸性蛋白質(zhì)占93.3%，與之前報[JP2]道的PAL是一種酸性蛋白一致[33-35]。穩(wěn)定性蛋白占978%，[JP]有信號肽的蛋白占2.2%，有導(dǎo)肽的蛋白占4.4%，所有蛋白均為有明顯跨膜現(xiàn)象的親水性蛋白；僅小麥基因 Traes_1AS_6BDC65775、Traes_2AS_EC4ADE04E具有葉綠體轉(zhuǎn)運肽，其余氨基酸序列均沒有導(dǎo)肽。說明大多數(shù)蛋白為非分泌性蛋白，它們由游離的核糖體合成，在細胞質(zhì)內(nèi)參與生化反應(yīng)，在細胞內(nèi)代謝過程中發(fā)揮重要作用。

結(jié)構(gòu)分析結(jié)果得出，所有氨基酸序列均有蛋白活性位點，均屬于PAL絲氨酸（Ser）酶，具有PAL基因家族的特征序列，初步認(rèn)為這些基因?qū)儆赑AL基因家族。同時，亞細胞定位發(fā)現(xiàn)所有PAL基因都定位于細胞質(zhì)中，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致，進一步說明PAL基因在細胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用。

擬南芥PAL基因生育期芯片表達模式分析結(jié)果表明，AT3G53260和AT2G37040在子葉（7 d）、下胚軸（7 d）、幼苗（7 d）、幼葉（10 d）、根（7 d）、莖（17 d）、花（>21 d）、雄蕊（>21 d）、雌蕊（>21 d）等中均有較強表達，在花粉（6周）中無明顯表達；AT3G10340主要在雄蕊（>21 d）、花（>21 d）、根（7 d）中有較強表達，在子葉（7 d）、下胚軸（7 d）、幼苗（7 d）、幼葉（10 d）、莖（17 d）、雌蕊（>21 d）、花粉（6周）中表達較弱；AT5G04230在子葉（7 d）中有較弱表達，在其余各組織中均表達較弱。說明擬南芥中PAL基因的表達模式呈現(xiàn)明顯的組織特異性，為本研究中主要作物的PAL基因表達研究提供參考。

目前，雖有關(guān)于主要作物中PAL基因的研究，但都是對單個基因的克隆，尚未發(fā)現(xiàn)有從主要作物中PAL基因家族層面的報道。本研究選取了5種主要作物的PAL基因家族為研究對象，對其基因家族系統(tǒng)進化、理化性質(zhì)、定位、結(jié)構(gòu)等進行了分析，對今后在主要作物中研究PAL基因的時空表達模式及功能，增強多個基因的協(xié)同表達，更好地利用 PAL對主要作物進行改造，從而增強主要作物的抗病性有重要意義。

[HS2][HT8.5H]參考文獻：[HT8.SS]

[1][ZK（#]Pellegrini L，Rohfritsch O，F(xiàn)ritig B，et al. Phenylalanine ammonia-lyase in tobacco （molecular cloning and gene expression during the hypersensitive reaction to tobacco mosaic virus and the response to a fungal elicitor） [J]. Plant Physiology，1994，106（3）：877-886.

[2]Dorey S，Kopp M，Geoffroy P，et al. Hydrogen peroxide from the oxidative burst is neither necessary nor sufficient for hypersensitive cell death induction，phenylalanine ammonia lyase stimulation，salicylic acid accumulation，or scopoletin consumption in cultured tobacco cells [JP2]treated with elicitin [J]. Plant Physiology，1999，121（1）：163-172.[JP]

[3]Hartley S E，F(xiàn)irn R D. Phenolic biosynthesis，leaf damage，and insect herbivory in birch （Betula pendula） [J]. Journal of Chemical Ecology，1989，15（1）：275-283.

[4]江昌俊，余有本. 苯丙氨酸解氨酶的研究進展 （綜述） [J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，28（4）：425-430.

[5]Koukol J，Conn E E. The metabolism of aromatic compounds in higher plants IV. Purification and properties of the phenylalanine deaminase of Hordeum vulgare [J]. Journal of Biological Chemistry，1961，236（10）：2692-2698.

[6]歐陽光察，應(yīng)初衍，沃紹根，等. 植物苯丙氨酸解氨酶的研究——Ⅵ. 水稻、小麥 PAL 的純化及基本特性[J]. 植物生理學(xué)報，1985，11（2）：204-214.

[7]Mauch-Mani B，Slusarenko A J. Production of salicylic acid precursors is a major function of phenylalanine ammonia-lyase in the resistance of Arabidopsis to Peronospora parasitica [J]. The Plant Cell，1996，8（2）：203-212.

[8]Minami E I，Ozeki Y，Matsuoka M，et al. Structure and some characterization of the gene for phenylalanine ammonia-lyase from rice plants [J]. European Journal of Biochemistry，1989，185（1）：19-25.

[9] Ritter H，Schulz G E. Structural basis for the entrance into the phenylpropanoid metabolism catalyzed by phenylalanine ammonia-lyase [J]. The Plant Cell，2004，16（12）：3426-3436.[ZK）]

[10][ZK（#]Kawamata S，Shimobarai K，Imura Y，et al. Temporal and spatial pattern of expression of the pea phenylalanine ammonia-lyase gene1 promoter in transgenic tobacco [J]. Plant and Cell Physiology，1997，38（7）：792-803.

[11]Santiago L J M，Louro R P，de Oliveira D E. Compartmentation of phenolic compounds and phenylalanine ammonia-lyase in leaves of Phyllanthus tenellus Roxb. and their induction by copper sulphate [J]. Annals of Botany，2000，86（5）：1023-1032.

[12]Nakazawa A，Nozue M，Yasuda H，et al. Expression pattern and gene structure of phenylalanine ammonia-lyase in Pharbitis nil[J]. Journal of Plant Research，2001，114（3）：323-328.

[13]Raes J，Rohde A，Christensen J H，et al.Genome-wide characterization of the lignification toolbox in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2003，133（3）：1051-1071.

[14]王光達，黃初女，吳委林，等. 不同玉米品種對大斑病的抗性與相關(guān)防御酶活性的關(guān)系研究[J]. 玉米科學(xué)，2014，22（5）：146-152.

[15]馬春紅，翟彩霞，鄭秋玲，等. 玉米小斑病菌 T 小種毒素誘導(dǎo)對玉米葉片苯丙氨酸解氨酶活性的影響[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，29（1）：21-25.

[16]陳捷，藺瑞明，高增貴，等. 玉米彎孢葉斑病菌毒素對寄主防御酶系活性的影響及誘導(dǎo)抗性效應(yīng)[J]. 植物病理學(xué)報，2002，32（1）：43-48.

[17]王雅平，吳兆蘇，劉伊強. 小麥抗赤霉病性的生化研究及其機制的探討[J]. 作物學(xué)報，1994，20（3）：327-333.

[18]李元，高瀟瀟，高召華，等. UV-B 輻射和稻瘟病菌脅迫對水稻幼苗苯丙氨酸解氨酶活性和類黃酮含量的影響[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，18（4）：856-860.

[19]張淑珍，徐鵬飛，吳俊江，等. 大豆疫霉根腐病菌毒素處理抗感不同大豆品種后苯丙氨酸解氨酶活性的變化[J]. 作物雜志，2008（1）：47-49.[HJ1.7mm]

[20]Khandekar S，Leisner S. Soluble silicon modulates expression of Arabidopsis thaliana genes involved in copper stress [J]. Journal of Plant Physiology，2011，168（7）：699-705.

[21]Goodstein D M，Shu S，Howson R，et al. Phytozome：a comparative platform for green plant genomics [J]. Nucleic Acids Research 2012，40（D1）：D1178-D1186.

[22]Do C B，Mahabhashyam M S，Brudno M，et al. probCons：Probabilistic consistency-based multiple sequence alignment [J]. Genome Research，2005，15（2）：330-340.

[23]Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al. MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 [J]. Molecular Biology and Evolution，2013，30（12）：2725-2729.

[24]Ronquist F，Teslenko M，van der Mark P，et al. MrBayes 3.2：efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space [J]. Systematic Biology，2012，61（3）：539-542.

[25]Walker J M. The proteomics protocols handbook [M]. Totowa，New Jersey：Humana Press，2005：571-607.

[26]Hofmann K，Stoffel W. Tmbase-a database of membrane spanning protein segments [J]. Biological Chemistry Hoppe-Seyler，1993，374：166.

[27]Chou K-C，Shen H-B. Plant-mPLoc：a top-down strategy to augment the power for predicting plant protein subcellular localization[J]. PLoS One，2010，5（6）：e11335.

[28]Emanuelsson O，Brunak S，von Heijne G，et al. Locating proteins in the cell using TargetP，SignalP and related tools [J]. Nature Protocols，2007，2（4）：953-971.

[29]Petersen T N，Brunak S，von Heijne G，et al. SignalP 4.0：discriminating signal peptides from transmembrane regions [J]. Nature Methods，2011，8（10）：785-786.

[30]Sigrist C J，Cerutti L，Hulo N，et al. PROSITE：a documented database using patterns and profiles as motif descriptors [J]. Briefings in Bioinformatics，2002，3（3）：265-274.

[31]Dash S，van Hemert J，Hong L，et al. PLEXdb：gene expression resources for plants and plant pathogens [J]. Nucleic Acids Research，2012，40（D1）：D1194-D1201.

[32]Guruprasad K，Reddy B B，Pandit M W. Correlation between stability of a protein and its dipeptide composition：a novel approach for predicting in vivo stability of a protein from its primary sequence [J]. Protein Engineering，1990，4（2）：155-161.

[34]劉郵洲，張搖磊，錢國良，等. 生防菌sf628對梨葉片苯丙氨酸解氨酶和過氧化物酶活性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，30（2）：268-274.

[35]王燕芳，吳瑛. 外源水楊酸對棉花相關(guān)抗蟲酶活性誘導(dǎo)的時間和濃度效應(yīng)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（4）：138-140.

[36]崔建東，李艷，牟德華. 苯丙氨酸解氨酶 （PAL） 的研究進展[J]. 食品工業(yè)科技，2008，29（7）：306-308.