納米氧化鈰和碳納米管修飾的過氧化氫傳感器的研制

常艷兵，馮亞娟，何 瓊

(曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南曲靖655011)

納米氧化鈰和碳納米管修飾的過氧化氫傳感器的研制

常艷兵，馮亞娟，何 瓊

(曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南曲靖655011)

研制了一種基于碳納米管(CNT)、納米CeO2、殼聚糖(CHIT)有機(jī)－無機(jī)復(fù)合膜作為固定基質(zhì)的酶生物傳感器，該復(fù)合膜結(jié)合了無機(jī)碳納米管、納米CeO2和有機(jī)材料殼聚糖的優(yōu)點(diǎn)，固定的辣根過氧化酶較好的保持了其生物活性．在優(yōu)化測(cè)試條件下，連續(xù)加入相同量的H2O2，該傳感器對(duì)H2O2的濃度變化產(chǎn)生迅速靈敏的響應(yīng)，當(dāng)過氧化氫溶液濃度在3．2×10－6～2．0×10－3mol/L之間變化時(shí)，電極對(duì)其濃度成線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0．978．該生物傳感器具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)．

碳納米管;納米氧化鈰;辣根過氧化酶;過氧化氫;生物傳感器

納米材料因其特異性在催化、生物醫(yī)藥、磁介質(zhì)和生物電分析領(lǐng)域等方面有著廣闊的應(yīng)用前景［1］，隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，各種納米材料廣泛應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器［2－6］．

目前研究最多的電化學(xué)生物傳感器是電化學(xué)酶?jìng)鞲衅鳎傅墓潭ɑ菍⒚甘`在特殊的載體上，不僅能使酶和底物之間進(jìn)行分子交換，又能使酶和整體相互分隔開，保持酶催化特性的方法，該方法具有可反復(fù)使用、壽命長(zhǎng)的特點(diǎn)［7－9］．目前，酶的固定方法有吸附、共價(jià)、交聯(lián)嵌入法、溶膠－凝膠法［10］、固定含酶的生物組織法、交聯(lián)酶聚集體、定向固定和共固定技術(shù)等．這些固定方法復(fù)雜，所用試劑昂貴或溶劑受環(huán)境影響比較大，穩(wěn)定性差、酶易失活．因此，開發(fā)和改善電極表面的吸附性能和建立良好的生物相容性，保持酶的活性，對(duì)傳感器性能的改進(jìn)具有重要的意義［11］．將低毒、生物相容性好的無機(jī)納米材料摻雜到生物傳感器的敏感膜上，為生物材料提供合適的微環(huán)境，維持生物組分活性和改善生物傳感器性能，從而研制了葡萄糖氧化酶、辣根過氧化酶等一系列的傳感器［12－15］．殼聚糖(CHIT)具有無毒性、無刺激性、良好生物相容性、生物可降解性以及生物活性等諸多優(yōu)良性質(zhì)而在紡織、印染、制藥、食品、生物、環(huán)境保護(hù)等方面被廣泛使用［16－17］．

本實(shí)驗(yàn)將碳納米管和納米CeO2分散在殼聚糖醋酸溶液中，形成有機(jī)－無機(jī)雜化膜，吸附辣根過氧化酶后修飾到電極上制成過氧化氫傳感器，將其用于樣品中過氧化氫的檢測(cè)，結(jié)果令人滿意．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 試劑與儀器 CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司);超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲波儀器有限公司);納米氧化鈰、碳納米管及殼聚糖復(fù)合膜修飾的玻碳電極作工作電極．

納米氧化鈰(浙江納米材料應(yīng)用工程技術(shù)中心);碳納米管(深圳納米技術(shù)有限公司);磷酸鹽緩沖溶液(0．067 mol/L，pH=6．47);辣根過氧化酶(HRP，上海生化試劑公司);H2O2(體積分?jǐn)?shù)為30%的水溶液，上海化學(xué)試劑公司);殼聚糖(CHIT，美國(guó)Sigma公司);其它化學(xué)試劑均為分析純，水為二次蒸餾水．

1．2 CNT的處理 取100 mg CNT在350℃下煅燒2 h，除去殘余的無定形碳，然后將熱處理后的CNT分散在60 mL硝酸(7．0 mol/L)中，不斷攪拌，140℃回流12 h，以除去殘留的催化劑．離心分離，用去離子水洗滌至上層清液pH值為中性，最后在120℃下干燥2 h，得到純凈的CNT．

1．3 CeO2/CNT/CHIT溶液的制備 稱取2．5 mg碳納米管和25 mg CeO2納米粉末溶于殼聚糖乙酸溶液中，攪拌1 h，超聲波振蕩15 min，待碳納米管和納米 CeO2粉末均勻分散后得到 CeO2/CNT/ CHIT膜液．

1．4 H2O2傳感器的制備

1．4．1 GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP電極的制備稱取15 mg辣根過氧化酶，用磷酸鹽緩沖溶液(pH =6．47)配成0．5 mL溶液．取5 μL此溶液和5 μL CeO2/CNT/CHIT膜液混合均勻后液涂于預(yù)處理好的玻碳電極表面，4℃下干燥過夜，使用前用磷酸鹽緩沖溶液(0．067 mol/L，pH=6．47)洗滌酶電極，除去未固定在電極表面的酶．

1．4．2 GC/CNT/CHIT/HRP電極的制備 稱取2．0 mg CNT溶于4 mL殼聚糖乙酸溶液中，超聲波振動(dòng)15 min，取5 μL此混合液和5 μL HRP酶混勻后涂于預(yù)處理好的玻碳電極表面，4℃下干燥過夜待用．

1．4．3 GC/CeO2/CHIT/HRP電極的制備 稱取1．0 mg納米CeO2溶于1 mL殼聚糖乙酸溶液中，超聲波振動(dòng)15 min，取5 μL此混合液和5 μL HRP酶混勻后涂于預(yù)處理好的玻碳電極表面，4℃下干燥過夜，電極不用時(shí)，置于冰箱中4℃保存．

2 結(jié)果與討論

2．1 循環(huán)伏安行為 為了考察辣根過氧化酶的催化作用，比較了GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP傳感器在不同底液中的循環(huán)伏安行為，如圖1，其中(a)磷酸鹽緩沖溶液(pH=6．47);(b)含有1．0×10－3mol/L對(duì)苯二酚的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6．47); (c)含有1．0×10－3mol/L對(duì)苯二酚和過氧化氫的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6．47)．可見在磷酸鹽緩沖溶液(pH=6．47)中，酶電極產(chǎn)生較低的背景電流:在含有1．0 mmol/L對(duì)苯二酚的0．067 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=6．47)中產(chǎn)生一對(duì)氧化還原峰，但背景電流信號(hào)仍比較低;在1．0 mol/L對(duì)苯二酚的0．067 mol/L PBS(pH=6．47)溶液中加入1．0 mmol/L H2O2后氧化峰電流減少還原峰電流明顯增大，證實(shí)HRP對(duì)H2O2具有很好的催化作用．

同時(shí)考察了掃描速度對(duì)傳感器的影響，當(dāng)掃描速度從20到100 mV/s變化時(shí)，傳感器在含有1．0 mmol/L H2O2及1．0 mmol/L對(duì)苯二酚的緩沖溶液中的循環(huán)伏安行為(圖2)，從圖2中(a)到(e)隨著掃描速度的增大峰電流逐漸增大．為了考察電流的特性，將峰電流對(duì)掃描速度的平方根作圖(見內(nèi)置圖)，從圖中可以看出，峰電流與掃描速度的平方根成正比，說明此電流為擴(kuò)散控制的電流．

2．2 電極的選擇 為了考察不同修飾電極對(duì)H2O2的催化性能，比較了CeO2/CNT/CHIT/HRP、CeO2/CHIT/HRP和CNT/CHIT/HRP 3種過氧化氫傳感器在含有1．0 mmol/L對(duì)苯二酚和0．1 mmol/L H2O2的磷酸鹽緩沖液(pH=6．47)中的計(jì)時(shí)電流動(dòng)態(tài)響應(yīng)見圖3，其中(a)納米氧化鈰、碳納米管和殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極的計(jì)時(shí)電流動(dòng)態(tài)響應(yīng);(b)納米氧化鈰和殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極的計(jì)時(shí)電流動(dòng)態(tài)響應(yīng);(c)碳納米管和殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極的計(jì)時(shí)電流動(dòng)態(tài)響應(yīng)．從圖中可以看出3種修飾電極的計(jì)時(shí)響應(yīng)電流由高到低依次為 GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP、GC/CeO2/CHIT/HRP、GC/CNT/ CHIT/HRP，表明無機(jī)納米粒子CeO2、CNT與有機(jī)物CHIT一起對(duì)H2O2有協(xié)同催化作用．因此，本實(shí)驗(yàn)選擇GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP作為傳感器用于檢測(cè)H2O2．

2．3 測(cè)量條件的優(yōu)化

2．3．1 苯二酚用量對(duì)傳感器的影響 圖4為不同濃度的對(duì)苯二酚存在時(shí)酶電極的響應(yīng)電流．從圖可看出，電流響應(yīng)隨著對(duì)苯二酚濃度的增加而增大，達(dá)到飽和后下降．電子媒介濃度較低時(shí)，酶－媒介動(dòng)力機(jī)制將限制響應(yīng)的線性范圍，而電子媒介濃度較高時(shí)，背景電流又太大，因此在本實(shí)驗(yàn)選擇使用1．0 mmol/L的對(duì)苯二酚．

2．3．2 pH的影響 考察了緩沖液pH值在4．92～8．04范圍內(nèi)對(duì)傳感器的影響．如圖5所示，在pH值為6．47時(shí)，響應(yīng)電流最大，之后隨pH值的增大響應(yīng)電流反而逐漸減?。虼耍緦?shí)驗(yàn)選擇6．47為最佳pH值．

2．3．3 工作電位的影響 在不同工作電位下測(cè)定了傳感器的響應(yīng)電流，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電位在350 mV至－40 mV區(qū)間，傳感器的響應(yīng)電流平緩增加，但幅度不大;從－40 mV降至－300 mV區(qū)間，傳感器的響應(yīng)電流顯著增大．為了避免其它物質(zhì)的干擾，選擇拐點(diǎn)－40 mV作為安培測(cè)量時(shí)的工作電位．

2．4 傳感器的性能

2．4．1 傳感器的響應(yīng)性能 在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下向底液中連續(xù)加入等量H2O2，分別用GC/CeO2/CNT/ CHIT/HRP、GC/CeO2/CHIT/HRP、GC/CNT/CHIT/ HRP修飾電極進(jìn)行測(cè)定，其電流計(jì)時(shí)曲線如圖6，校正曲線見內(nèi)置圖，在含有對(duì)苯二酚的硫酸鹽緩沖溶液中連續(xù)加入20 μL 1．0×10－3mol/L H2O2進(jìn)行測(cè)定，其中(a)納米氧化鈰、碳納米管和殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極對(duì)H2O2的動(dòng)態(tài)響應(yīng);(b)納米氧化鈰和殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極對(duì)H2O2的動(dòng)態(tài)響應(yīng);(c)碳納米管和殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極對(duì)H2O2的動(dòng)態(tài)響應(yīng)．從圖中可以看出，用納米氧化鈰、殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極和碳納米管、殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極對(duì)H2O2進(jìn)行測(cè)定，響應(yīng)電流較弱，且測(cè)定H2O2溶液的濃度線性范圍較窄，線性較差，相關(guān)系數(shù)較?。眉{米氧化鈰、碳納米管和殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，當(dāng)H2O2的濃度發(fā)生變化，傳感器會(huì)產(chǎn)生迅速靈敏的響應(yīng)，說明酶電極有優(yōu)良的電催化行為．響應(yīng)電流值隨H2O2濃度的增加而增大，當(dāng)H2O2達(dá)到一定濃度時(shí)電流也達(dá)到飽和，說明此時(shí)酶的活性位點(diǎn)被底物飽和．測(cè)定H2O2溶液的濃度線性范圍是3．2×10－6～2．0×10－3mol/L，回歸方程為i=0．783+18．67C，相關(guān)系數(shù)為0．978．

2．4．2 傳感器的重現(xiàn)性 在0．1 mmol/L H2O2溶液中考察了HRP酶電極響應(yīng)電流的重現(xiàn)性，用同一根過氧化氫傳感器連續(xù)測(cè)定16次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4．67%，說明該傳感器具有很好的重現(xiàn)性．

2．4．3 干擾實(shí)驗(yàn) 為了考察電極的選擇性，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定了草酸、酒石酸、抗壞血酸、谷氨酸、葡萄糖等對(duì)GC/CeO2/CHIT/CNT/HRP電極的影響，結(jié)果見表1．從測(cè)定結(jié)果可以看出，在相同測(cè)定條件下，以上物質(zhì)對(duì)GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP電極響應(yīng)電流都沒有明顯干擾．

表1 干擾物質(zhì)對(duì)電極的影響Table 1 The effects of interfering substances on electrode

2．5 樣品及加標(biāo)回收檢測(cè) 為了考察該傳感器的實(shí)用性，用其測(cè)定市售利爾康質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫消毒液(溫州康林醫(yī)療器械有限公司)中H2O2的濃度，并與高錳酸鉀氧化還原滴定法測(cè)定的濃度對(duì)比，結(jié)果見表2．實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明利用該傳感器和氧化－還原滴定法所測(cè)得的結(jié)果無明顯差異，具有較高的一致性，這表明用該傳感器檢測(cè)H2O2的方法可行．

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，向市售利爾康質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫消毒液(以用該過氧化氫傳感器檢測(cè)其平均濃度1．005 0 mmol/L作為計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均濃度)中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)過氧化氫溶液，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果列于表3．從檢測(cè)結(jié)果可以看出，回收率較好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較低．

表2 實(shí)際樣品的測(cè)定Table 2 Determination of H2O2in actual sample(n=5)

表3 加標(biāo)回收的測(cè)定結(jié)果Table 3 Recovery test of H2O2standards(n=7)

3 結(jié)語(yǔ)

本文研制了一種利用CeO2/CNT/CHIT復(fù)合膜作為固定基質(zhì)的新型H2O2傳感器，這種有機(jī)－無機(jī)復(fù)合膜結(jié)合了兩種材料的優(yōu)勢(shì)，用該復(fù)合膜固定的HRP具有更高的生物活性．將傳感器用于檢測(cè)H2O2，獲得了令人滿意的結(jié)果．該傳感器具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好、制作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)．

［1］鄧祥，黃小梅．基于L－半胱氨酸/納米金固定酶的過氧化氫生物傳感器［J］．四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2011，34(2):236－239．

［2］楊云慧，羅文超，趙曉慧，等．基于石墨烯/鉑納米顆粒復(fù)合材料的過氧化氫無酶?jìng)鞲衅鞯难兄疲跩］．云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2011，31(4):11－14．

［3］楊光明，常艷兵，楊云慧，等．金納米管的制備及其在電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］．材料導(dǎo)報(bào)，2010，24(15):81－83．

［4］常艷兵，楊光明，楊云慧，等．基于Al/Ni雙氫氧化物納米線無酶葡萄糖傳感器的研究［J］．分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28(5): 670－671．

［5］曾云龍，李霞飛，黃昊文，等．基于金納米棒－辣根過氧化物酶協(xié)同效應(yīng)的過氧化苯甲酰生物傳感器［J］．分析化學(xué)研究

報(bào)告，2011，39(8):1171－1175．

［6］楊光明，李麗，楊云慧，等．金屬納米帶的制備及其在電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］．材料導(dǎo)報(bào)，2011，25(3):5－8．

［7］CONROY P J，HEARTY S，LEONARD P，et al．Antibody production，design and use for biosensor－based applications［J］．Seminars in Cell＆Developmental Biology，2009，20(1):10－26．

［8］LIU Y，YU T．Polymers and enzyme biosensors．J．M．S．－Rev［J］．Macromolecular Chem Phys，1997，C37:459－00．

［9］劉佳，殷立峰，江帆，等．電化學(xué)酶?jìng)鞲衅髟诃h(huán)境污染監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用［J］．化學(xué)進(jìn)展，2012，24(1):131－133．

［10］黃淑芳，姜忠義，吳洪，等．溶膠－凝膠法固定化酶的問題與解決途徑［J］．高分子通報(bào)，2003，4(5):28－29．

［11］MIAO Y Q，TAN S W．Amperometric hydrogen peroxide biosensor based on immobilization of peroxidase in chitosan matrix cross－linked with glutaraldehyde［J］．The Analyst，2000，125(9):1591－1594．

［12］張一，田甜，孫艷紅，等．無機(jī)納米材料的生物催化活性［J］．科學(xué)通報(bào)，2014，59(2):158－160．

［13］ZHAO J，HENKENS R W，STONEHUERNER J G．Direct electron transfer at horseradish peroxidase－colloidal gold modified electrodes［J］．J Electroanalytical Chemistry，1992，327(1/2):109－119．

［14］范慧敏，鄧春艷，陽(yáng)明輝，等．基于新型二氧化錳－碳納米管復(fù)合材料的高靈敏過氧化氫傳感器［J］．分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28(4):459－463．

［15］劉艷，牛衛(wèi)芬，徐嵐．基于層層自組裝技術(shù)制備石墨烯/多壁碳納米管共修飾的過氧化氫傳感器的研究［J］．分析化學(xué)研究報(bào)告，2011，39(11):1676－1681．

［16］OKUMA H，WATANABE E．Flow system for fish freshness determination based on double multi－enzyme reactor electrodes［J］．Biosensors and Bioelectronics，2002，17(5):367－372．

［17］葉光輝．殼聚糖的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］．廣州化工，2015，43(2):21－24．

［18］GRABAR K C，F(xiàn)REEMAN R G，HOMMER M B．Preparation and characterization of Au colloid monolayers［J］．Analytical

Chemistry，1995，67(4):735－743．

Study on the Hydrogen Peroxide Biosensor Modified by Cerium Oxide Nanoparticles and Carbon Nanotube

CHANG Yanbing，F(xiàn)ENG Yajuan，HE Qiong

(School of Chemistry and Chemical Engineering，Qujing Normal College，Qujing 655011，Yunnan)

We presented an novel enzyme biosensor based on Carbon nanotube(CNT)，CeO2nanoparticles and chitosan of inorganic-organic complex film as immobilization matrix with good stability．This material combined the advantages of inorganic CNT，CeO2nanoparticles and organic polymer CHIT，and it maintained a good biological activity that fixed horseradish peroxidase．While adding the same amount of H2O2continuously under the condition of optimization test，the sensor produces high sensitive response to H2O2concentration change．When the concentration of hydrogen peroxide solution changes from 3．2×10－6to 2．0×10－3mol/L，there is a linear relation between electrode and its concentration，and the correlation is 0．978．This biosensor has a fast response，a high sensitivity，a good reproducibility．It can be used for the actual sample testing．

carbon nanotube(CNT);Cerium oxide nanoparticles;HRP;hydrogen peroxide;biosensor

O657．15

A

1001－8395(2016)04－0571－05

10．3969/j．issn．1001－8395．2016．04．021

(編輯 周 俊)

2015－05－29

云南省教育廳科學(xué)研究基金(2013Y014)和云南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201310684002)

常艷兵(1980—)，男，副教授，主要從事電分析化學(xué)及生物傳感器方面的研究，E－mail:chang－yanbing@126．com