益微微生物菌劑對乙草胺油菜藥害的緩解效果及作用機(jī)制初步研究

陳 然，江 慧，李 黎，李俊凱

(長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

益微微生物菌劑對乙草胺油菜藥害的緩解效果及作用機(jī)制初步研究

陳 然，江 慧，李 黎，李俊凱*

(長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

為了探索益微微生物菌劑拌種緩解乙草胺油菜藥害的效果及其作用機(jī)制，采用盆栽法測定了益微拌種對乙草胺油菜藥害的緩解效果，采用分光光度法分別測定益微拌種對油菜葉片中還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的影響，并采用GC-MS法檢測油菜植株中乙草胺的殘留量。結(jié)果表明：乙草胺的施用量為840～1 680 g/hm2時，對油菜生長均有一定的抑制作用；用益微拌種處理后，均能顯著緩解乙草胺對油菜的藥害，當(dāng)乙草胺用量為1 680 g/hm2、拌種量為25 g益微拌1 kg油菜種子時，油菜的株高、鮮質(zhì)量恢復(fù)率分別為79.31%和178.57%。與單用乙草胺處理相比，先用益微拌種后噴施乙草胺，油菜植株中GSH含量增加，GST活性提高，同時乙草胺殘留量極顯著降低。說明益微微生物菌劑能提高植株中相關(guān)抗逆酶的活性，促進(jìn)乙草胺的降解，從而顯著緩解乙草胺對油菜的藥害。

乙草胺； 油菜； 藥害； 微生物菌劑； 益微； 緩解效果； 作用機(jī)制

近年來由于勞動力成本的不斷升高，我國冬油菜種植模式逐漸由人工移栽向直播轉(zhuǎn)變，油菜田的雜草發(fā)生特點(diǎn)也發(fā)生了較大變化，嚴(yán)重危害油菜生產(chǎn)。除草劑的使用在控制油菜田雜草發(fā)生及危害方面起著重要的作用，特別是播后苗前土壤封閉處理成為直播油菜田雜草防除的關(guān)鍵技術(shù)[1-2]。目前酰胺類除草劑是油菜田應(yīng)用較廣泛的除草劑種類，其中乙草胺、異丙甲草胺常用于油菜播后苗前的土壤封閉以防除直播油菜田雜草[3-4]。乙草胺活性高、應(yīng)用范圍廣，但使用量、使用方式、土壤濕度等對藥效的發(fā)揮有較大的影響，特別是用藥量過大或施藥后遇持續(xù)低溫高濕天氣時，易對油菜產(chǎn)生藥害[5-6]。目前國內(nèi)外緩解除草劑藥害的主要手段是應(yīng)用除草劑安全劑[7-9]。然而，遺憾的是目前除草劑安全劑主要應(yīng)用在預(yù)防除草劑對單子葉作物的藥害方面，而用于預(yù)防除草劑對雙子葉作物產(chǎn)生的藥害鮮有報道[10-11]。微生物菌劑益微是將植物中分離得到的有益微生物制成的植物微生態(tài)制劑，其能在植物體內(nèi)形成有利于植物生長的微生態(tài)環(huán)境，具有促進(jìn)植物生長、增強(qiáng)植物抗逆性的功能。本研究以微生物菌劑益微為供試材料，通過拌種處理，在盆栽試驗(yàn)條件下，探索油菜免遭乙草胺藥害的保護(hù)措施，并試圖探明其緩解藥害的機(jī)制，旨在為大田生產(chǎn)中乙草胺藥害的補(bǔ)救提供理論依據(jù)和借鑒措施。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試作物：中雙4號油菜(BrassicacampestrisL.)，其種子購自湖北荊楚種業(yè)股份有限公司。

藥劑及試劑：益微微生物菌劑(枯草芽孢桿菌≥300×108cfu/g，膠凍樣類芽孢桿菌≥0.02×108cfu/g)，河北微生物技術(shù)有限公司提供；50%乙草胺乳油，山東勝邦綠野化學(xué)有限公司生產(chǎn)；三氯乙酸(TCA)，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)有限公司生產(chǎn)；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；2,4-二硝基氯苯(CDNB)，西亞試劑公司生產(chǎn)；5,5-二硫代雙乙硝基甲酸(DTNB)、還原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽還原酶(GR)、NADPH均為Sigma公司產(chǎn)品；乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品來自國家標(biāo)準(zhǔn)樣品發(fā)行中心；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、氯化鈉均為分析純。

試驗(yàn)儀器：FA2004電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)、紫外分光光度計UV3200S(上海美譜達(dá)儀器有限公司)、離心機(jī)(德國Eppendorf 5810R)、7890A GC-5975C MS(安捷倫科技有限公司，配有EI離子源、自動進(jìn)樣器)、Florisil固相萃取柱(美國Agilent公司)。

1.2.1 盆栽法測定益微微生物菌劑對乙草胺油菜藥害的緩解效果 在塑料盆中加入定量過篩的風(fēng)干土，并用一定水量將其浸濕，分別用25 g益微微生物菌劑拌3 kg、1 kg油菜種子，并播于已裝土的塑料盆中，同時設(shè)未經(jīng)益微微生物菌劑處理的種子為空白對照(CK)，每盆25粒，每處理重復(fù)3次，覆蓋1 cm土，放于網(wǎng)室中。播種后1 d用0、840、1 260、1 680 g/hm2的乙草胺噴霧進(jìn)行土壤封閉，播后10 d測定株高、單株鮮質(zhì)量，計算乙草胺對油菜的抑制率、益微微生物菌劑單獨(dú)使用對油菜的促長率、益微微生物菌劑對油菜的恢復(fù)率。計算公式如下：

抑制率=(空白處理值-乙草胺單劑處理值)/空白處理值×100%

促長率=(益微單劑處理值-空白處理值)/空白處理值×100%

恢復(fù)率=(益微乙草胺處理值-乙草胺單劑處理值)/(空白處理值-乙草胺單劑處理值)×100%。

1.2.2 GSH、GSSG(氧化型谷胱甘肽)和GST(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)的提取和測定 播后10 d，取0.5 g新鮮油菜葉片，按照參考文獻(xiàn)[12-13]的方法對GSH、GSSG含量和GST活性進(jìn)行測定。

1.2.3 油菜中乙草胺含量的測定

1.2.3.1 提取與純化 在油菜播后第10天，稱取5 g待測樣品(整株油菜)于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇，超聲提取3 min，再加入5 g氯化鈉震蕩3 min，5 000 r/min下離心3 min，取上清液10 mL于圓底燒瓶中，旋干，加入淋洗液(乙酸乙酯∶石油醚=1∶9)溶解。用5 mL石油醚活化固相萃取柱，加入待分離樣品，再加淋洗液20 mL，收集20 mL液體，旋干待測。

護(hù)理人員是經(jīng)過專業(yè)的護(hù)理學(xué)校畢業(yè),通過專業(yè)的考試并領(lǐng)有執(zhí)照的醫(yī)務(wù)工作者。由于護(hù)理人員的工作與人們的健康,甚至生命息息相關(guān),所以要求護(hù)理人員不僅要具有完備的專業(yè)素質(zhì),更要有健康的身體和良好的心理素質(zhì)。伴隨著科學(xué)技術(shù)水平的提高,人類對健康和疾病的思考也發(fā)生了相應(yīng)的改變,致使醫(yī)學(xué)模式也發(fā)生了大轉(zhuǎn)變,醫(yī)療事業(yè)也是飛速發(fā)展,與此同時,護(hù)理工作日益展現(xiàn)出其重要的作用與地位。護(hù)理工作要求高、責(zé)任重、操作多、工作量超負(fù)荷、上班時間沒有規(guī)律是護(hù)理工作的一大特點(diǎn)。據(jù)報道,護(hù)理工作壓力明顯高于一般職業(yè),護(hù)理人員身心健康水平遠(yuǎn)低于普通職業(yè)人群。

1.2.3.2 色譜條件 采用HP-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。載氣:He，1.0 mL/min，恒流；柱溫:90 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至150 ℃，保持4 min，以4 ℃/min升至200 ℃，保持8 min，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；接口溫度：280 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量:1 μL；四極桿溫度:150 ℃；離子源溫度:230 ℃；電子能量：70 eV；數(shù)據(jù)采集模式：選擇離子監(jiān)測(SIM)，選擇離子為m/z 162、174、234、269，m/z 162為定量離子，其他均為定性離子[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 益微微生物菌劑對油菜生長的影響

從表1可以看出，益微微生物菌劑單獨(dú)處理?xiàng)l件下，當(dāng)25 g益微微生物菌劑拌種1 kg油菜種子時，對油菜的株高和單株鮮質(zhì)量有顯著的促進(jìn)作用，促長率分別為14.07%和28.75%；當(dāng)25 g益微微生物菌劑拌種3 kg油菜種子時，對油菜的株高和單株鮮質(zhì)量無顯著的促進(jìn)作用。

表1 益微微生物菌劑對油菜生長的影響

注：同列不同小、大寫字母分別表示不同拌種量處理間差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)，下同。

2.2 盆栽條件下益微微生物菌劑拌種對乙草胺油菜藥害的緩解效應(yīng)

如表2所示，在盆栽條件下乙草胺使用量為840、1 260、1 680 g/hm2時，其對油菜株高的抑制率分別為31.11%、37.04%、42.96%，對單株鮮質(zhì)量的抑制率分別為13.75%、20.00%、17.50%，表現(xiàn)出對油菜植株的藥害效應(yīng)。益微微生物菌劑拌種處理對乙草胺在油菜株高和單株鮮質(zhì)量方面產(chǎn)生的藥害均有顯著的緩解作用，且在相同的乙草胺用量下，不同用量的益微微生物菌劑對油菜的緩解效果存在差異。當(dāng)25 g益微微生物菌劑拌種1 kg油菜種子時，對各使用量(840、1 260、1 680 g/hm2)的乙草胺藥害緩解效果最明顯，油菜株高的恢復(fù)率分別為32.14%、46.67%、79.31%，油菜單株鮮質(zhì)量的恢復(fù)率分別為190.91%、168.75%、178.57%。

表2 盆栽條件下益微微生物菌劑拌種對乙草胺油菜藥害的緩解效應(yīng)

2.3 益微微生物菌劑對油菜GSH、GSSG含量及GST活性的影響

如表3所示，單獨(dú)用益微微生物菌劑拌種，可提高油菜葉片中GSH含量；單獨(dú)使用乙草胺噴霧處理，可顯著降低油菜葉片中GSH含量。而經(jīng)過益微微生物菌劑拌種處理后再噴施乙草胺，與單獨(dú)噴施乙草胺相比，均增加了油菜葉片中GSH含量，在3種不同使用量的乙草胺條件下，益微微生物菌劑25 g拌1 kg油菜種子時，油菜葉片中GSH含量均顯著或極顯著增加。

單獨(dú)用益微微生物菌劑拌種，低用量增加油菜葉片中GSSG含量，高用量降低油菜葉片中GSSG含量。單獨(dú)使用乙草胺噴霧，可增加油菜葉片中GSSG含量，而用益微微生物菌劑25 g拌1 kg油菜種子時，均顯著或極顯著降低GSSG含量。

單獨(dú)用益微微生物菌劑拌種，可提高油菜葉片中GST活性。單獨(dú)使用乙草胺噴霧，可減低油菜葉片中GST活性，而經(jīng)過益微微生物菌劑不同用量處理后再噴施乙草胺均提高了油菜葉片中GST活性，在益微微生物菌劑25 g拌1 kg油菜種子時，乙草胺3個使用量的油菜葉片中GST活性均顯著或極顯著提高。

表3 益微微生物菌劑對油菜GSH、GSSG含量及GST活性的影響

2.4 乙草胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

將乙草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在前述色譜條件下進(jìn)行測定，保留時間為20.609 min，以峰面積對質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，在0.05～5.0 mg/L范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)，線性方程為：Y=280 388X-33 879(R=0.995 8)。說明該色譜條件滿足乙草胺定量分析的需要。

2.5 乙草胺測定方法的回收率與精密度

在不含乙草胺的空白油菜樣品中加入定量(0.1～1.0 mg/L)的乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品，按1.2.3中方法進(jìn)行提取純化并測定油菜樣品中的乙草胺含量，計算回收率。結(jié)果表明，平均回收率為83.2%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于6.3%(表4)。

表4 乙草胺添加回收率測定結(jié)果

2.6 油菜中乙草胺的殘留量

在播后10 d檢測油菜中乙草胺的殘留量，從表5可以看出，25 g益微微生物菌劑拌種3 kg和1 kg條件下，乙草胺使用量為840 g/hm2時油菜植株中乙草胺殘留量分別減少36.84%和31.58%，乙草胺使用量為1 260 g/hm2時油菜植株中乙草胺殘留量分別減少30.77%和34.62%，乙草胺使用量為1 260 g/hm2時油菜植株中乙草胺殘留量分別減少48.57%和45.71%，表明使用益微微生物菌劑拌種處理能夠顯著降低油菜中乙草胺殘留量。

表5 油菜中乙草胺的殘留量 mg/kg

3 結(jié)論與討論

GSH的主要生理功能是清除植物在逆境下體內(nèi)產(chǎn)生并積累的過量活性氧，以維持活性氧的正常平衡，從而保護(hù)植物免受活性氧引起的傷害。它是生物細(xì)胞中普遍存在的一種具有特殊功能的多肽，在生物的許多代謝生理過程中起到重要的作用。而GSH和GSSG在植物體內(nèi)通常處于穩(wěn)恒性動態(tài)平衡，即當(dāng)機(jī)體內(nèi)積累較多的GSSG時，GSH還原酶將GSSG還原成GSH。在該生化反應(yīng)中，GSSG本身無清除自由基作用，只參與維持2種形態(tài)谷胱甘肽的動態(tài)平衡，除此之外，還可能參與其他生化反應(yīng)。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，除草劑安全劑可以提高植物中GSH含量，達(dá)到解毒的目的[16-17]。

GST是一類胞質(zhì)酶，能催化GSH經(jīng)半胱氨酸的硫原子與多種疏水化合物親電基團(tuán)的連接作用，這種作用是生物體進(jìn)行脫毒和排毒的重要方式。GST在植物體抵御外源物質(zhì)傷害及對多種逆境的抗性中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，GST可以催化GSH與乙草胺的軛合反應(yīng)，加速乙草胺的代謝，從而進(jìn)行解毒[18-19]。

本研究表明，乙草胺對油菜幼苗的株高、鮮質(zhì)量和油菜葉片中的GSH含量、GST活性都有抑制作用，隨著乙草胺用量的增加，抑制作用加強(qiáng)，而對GSSG含量有促進(jìn)作用，隨著乙草胺用量的增加，促進(jìn)作用加強(qiáng)。在用25 g益微微生物菌劑拌1 kg油菜種子時，油菜的株高、鮮質(zhì)量和油菜葉片中的GSH含量、GST活性均有不同程度的提高，油菜葉片中GSSG含量和乙草胺的殘留量減低；在相同的乙草胺用量下，益微微生物菌劑各用量處理之間的解毒效果存在差異，用25 g益微微生物菌劑拌1 kg油菜種子時，對油菜的保護(hù)效果最好。這說明高用量的益微微生物菌劑會刺激和促進(jìn)作物的生長。益微微生物菌劑能夠提高油菜植株中GST活性和GSH含量，并減低GSSG含量和乙草胺殘留量，從而緩解乙草胺對油菜幼苗產(chǎn)生的藥害，表明使用益微微生物菌劑拌種是減輕乙草胺對油菜藥害的有效措施之一。

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Curing Effect of Antidote Yiwei on Rape Injury Caused by Acetochlor and Its Functional Mechanism

CHEN Ran,JIANG Hui,LI Li,LI Junkai*

(College of Agriculture,Yangtze University,Jingzhou 434025,China)

In order to study the mitigation effect of the microbial agent Yiwei on acetochlor herbicide injury to rape,and its preliminary mechanism,the curing effect of Yiwei as a seed-dressing agent was studied by pot growing method.The contents of glutathione(GSH),oxidized glutathione(GSSG) and the activity of glutathione S-transferase(GST) in rape leaf were measured by UV-Vis and the residue of acetochlor in rape was determined by GC-MS.The results showed that when acetochlor was applied with concentration of 840—1 680 g/ha,it inhibited the growth of rape.Yiwei as a seed-dressing agent could remarkably ease this injury caused by acetochlor.When 25 g Yiwei was used to deal with 1 kg rape seed,the recovery ratios of rape seedling height and fresh weight from the injury caused by 1 680 g/ha acetochlor were 79.31%,178.57% respectively.Compared with the rape seedlings injured by acetochlor alone, Yiwei could increase the content of GSH,outstandingly enhance the activity of GST,and reduce the residue of acetochlor in rape seedlings.It turned out that Yiwei could improve activities of related enzymes such as GST and accelerate the degradation of acetochlor residue in rape seedlings to cure rape injury caused by acetochlor.

acetochlor; rape(BrassicacampestrisL.)； phytotoxicity； microbial agent; Yiwei； curing effect; mechanism

2015-11-04

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203098);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371976)

陳 然(1990-)，男，湖北洪湖人，在讀碩士研究生，研究方向：植物保護(hù)。E-mail：changdachenran@163.com

*通訊作者：李俊凱(1969-)，男，湖北荊門人，教授，博士，主要從事新農(nóng)藥開發(fā)與農(nóng)藥環(huán)境毒理研究。E-mail：junkaili@sina.com

S482.4+6;S451.22+3

A

1004-3268(2016)05-0082-05