廣西地不容內(nèi)生真菌疣孢漆斑菌DBR-11的抑菌活性

卿 朕，周秋艷，孫文斌，駱海玉，戴梅清，鄧業(yè)成

(廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004)

廣西地不容內(nèi)生真菌疣孢漆斑菌DBR-11的抑菌活性

卿 朕，周秋艷，孫文斌，駱海玉，戴梅清，鄧業(yè)成*

(廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004)

為了研究廣西地不容內(nèi)生真菌的抑菌活性，從廣西地不容塊根中分離純化出18株內(nèi)生真菌，采用拮抗試驗(yàn)測(cè)定了其對(duì)10種植物病原真菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)疣孢漆斑菌DBR-11對(duì)多數(shù)供試菌有很好的抑制活性。進(jìn)一步測(cè)定了DBR-11菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物對(duì)病原菌的抑制活性較高，質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)，對(duì)10種植物病原真菌的抑菌率均在90%以上，有效中濃度(EC50)為0.007 2～0.446 5 g/L，其中對(duì)煙草黑脛病菌的毒力最高,EC50值為0.007 2 g/L；發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)，72 h對(duì)15種供試動(dòng)物病原菌中的7種能完全抑制，最低抑制濃度(MIC)為0.062 5～0.25 g/L，其中對(duì)痢疾志賀氏菌的抑制活性最高,MIC值為0.062 5 g/L。DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物有廣譜的抗菌活性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

廣西地不容； 內(nèi)生真菌； 疣孢漆斑菌； 抑菌活性； 發(fā)酵產(chǎn)物

廣西地不容(StephaniakwangsiensisLo.)為防己科千金藤屬植物，主產(chǎn)于廣西西北部至西南部，生于山地灌叢的石灰?guī)r地區(qū)[1]。目前多數(shù)文獻(xiàn)都是對(duì)廣西地不容生物堿的研究[2]，也有一部分研究它的其他藥理性質(zhì)，如抑菌活性[3]、殺蟲(chóng)活性[4]等。近年來(lái)，由于藥用植物過(guò)度使用，使得許多藥用植物瀕臨滅絕。為了解決資源短缺問(wèn)題，藥用植物內(nèi)生菌成為藥用植物新資源研究的一個(gè)熱點(diǎn)[5]。植物內(nèi)生菌(endophtic)是指生活在健康的植物組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌，是與宿主植物在長(zhǎng)期的共同進(jìn)化過(guò)程中衍生的一類(lèi)微生物[6]。植物內(nèi)生真菌在植物微生態(tài)系統(tǒng)中長(zhǎng)期與宿主建立了和諧的聯(lián)合關(guān)系，不但能夠產(chǎn)生與其宿主相同或者相似的活性物質(zhì)，而且其次生代謝產(chǎn)物十分豐富[7]，從而可以用于多種生理活性研究，如抗腫瘤、抗菌、殺蟲(chóng)和免疫抑制等活性[6,8]。疣孢漆斑菌屬殼霉目杯霉科，對(duì)菌株疣孢漆斑菌的研究包括產(chǎn)酶[9-10]、殺蟲(chóng)[11]等方面。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)植物內(nèi)生真菌抑菌活性的研究雖然較多,但有關(guān)廣西地不容內(nèi)生真菌以及疣孢漆斑菌代謝物抑菌活性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)廣西地不容塊根中內(nèi)生真菌進(jìn)行分離、活性篩選和鑒定,并對(duì)疣孢漆斑菌DBR-11進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物各萃取相進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，以期為DBR-11 菌株的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物內(nèi)生真菌 供試的18個(gè)植物內(nèi)生真菌菌株從采自廣西植物研究所的廣西地不容塊根中分離獲得[12-14]，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)(ITS序列分析)技術(shù)相結(jié)合的方法鑒定DBR-11菌株為疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)。

1.1.2 供試植物病原真菌 包括玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)、煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasitica)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、甘藍(lán)黑斑病菌(Alternariaoleracea)、金橘砂皮病菌(Diaporthecitri)、甘蔗鳳梨病菌(Ceratocystisparadoxa)、茶輪斑病菌(Pestalotiopsistheae)、貢柑鏈格孢菌(Alternariacitri)、水稻胡麻葉斑病菌(Cochliobolusmiyabeanus)10種，除金橘砂皮病菌和貢柑鏈格孢菌由廣西特色作物研究所提供以外，其余8種均由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理室提供。

1.1.3 供試動(dòng)物病原菌 包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphi)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、普通變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、乙型副傷寒桿菌(BacteriumparatyphosumB)、炭疽桿菌(Bacillusanthraci)、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)15種，由桂林醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌發(fā)酵 挑取保存的純化菌種接種于PDA平板上，待活化后，用0.4 cm打孔器在菌落平板上打取菌餅，用鑷子挑取1個(gè)菌餅，接種于裝有400 mL滅菌液體PDA的1 000 mL錐形瓶中，置于恒溫培養(yǎng)箱中(27±1)℃培養(yǎng)，每天搖晃2～3次，培養(yǎng)30 d。

1.2.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物粗提物的制備及初步分離 將內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物用無(wú)水乙醇按1∶1比例浸泡3 d[13]，再用2層紗布過(guò)濾，過(guò)濾得到的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)一步抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，得發(fā)酵濃縮液。用液-液萃取法分離內(nèi)生真菌粗提物，把發(fā)酵濃縮液置于分液漏斗中，依次用等量的乙酸乙酯和正丁醇萃取，每種溶劑萃取3～5次，合并萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至膏狀，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及萃余物。

1.2.3 抑菌活性測(cè)定

1.2.3.1 植物內(nèi)生真菌對(duì)植物病原真菌的拮抗試驗(yàn) 采用平板對(duì)峙法[15-16]，預(yù)先在培養(yǎng)皿底面用記號(hào)筆做記號(hào)，記號(hào)點(diǎn)以培養(yǎng)皿中心軸對(duì)稱(chēng)，兩點(diǎn)間距3 cm。將直徑為0.4 cm的打孔器滅菌后，在培養(yǎng)5 d的內(nèi)生真菌和病原菌的菌落邊緣打出菌餅，然后在無(wú)菌條件下取菌餅接種在平板培養(yǎng)基的標(biāo)記點(diǎn)上，于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d后觀(guān)察。依據(jù)對(duì)峙菌落之間有無(wú)抑菌帶來(lái)確定它們之間是否有拮抗作用。用尺子量取其抑菌帶寬度(單位為mm)，每個(gè)皿測(cè)量3個(gè)點(diǎn)，取其平均值作為評(píng)判抑菌效果大小的依據(jù)。每組處理3個(gè)重復(fù)，取其平均值記錄。

1.2.3.2 發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[17]測(cè)定。首先把樣品配成質(zhì)量濃度為50 g/L的藥液，溶劑為丙酮或者丙酮和水(1∶1)。在無(wú)菌潔凈工作臺(tái)中，把1 mL藥液(對(duì)照組用溶樣溶劑代替)與9 mL熱熔培養(yǎng)基混合均勻，倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中制成厚薄均勻的帶藥培養(yǎng)基(5 g/L)。在已活化的供試菌落邊緣，用直徑為0.4 cm的無(wú)菌打孔器切取菌餅，并使菌絲面朝下接于帶藥培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿接3個(gè)菌餅成“品”字形分布，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。置于(27±1)℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，根據(jù)下列公式計(jì)算抑制率：

抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-0.4)×100%。

測(cè)定有效中濃度(EC50)時(shí)，配制7個(gè)系列質(zhì)量濃度(2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g/L)的帶藥培養(yǎng)基，測(cè)定各個(gè)質(zhì)量濃度的抑菌率，用最小二乘法求出毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、EC50及EC50的95%置信限和相對(duì)毒力。

1.2.3.3 發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物病原菌的抑制活性測(cè)定 采用帶毒平板法[18]。將菌種接到液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，置于(37±1)℃的水浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)12～14 h進(jìn)行活化。把樣品配成質(zhì)量濃度為20 g/L的藥液，溶劑為丙酮或丙酮和水(1∶1)。在無(wú)菌潔凈工作臺(tái)中，將1 mL藥液與9 mL熱熔牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基混合均勻，制成厚薄均勻的帶藥培養(yǎng)基。將已活化的菌種搖勻，吸取0.1 mL于9.9 mL無(wú)菌水中稀釋成菌懸液。吸取0.1 mL菌懸液，加到帶藥培養(yǎng)基上，涂布均勻。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。陽(yáng)性對(duì)照組用溶樣溶劑代替藥液，其他條件不變，用于觀(guān)察細(xì)菌能否正常生長(zhǎng)。陰性對(duì)照則涂0.1 mL無(wú)菌水，其他條件不變，用于觀(guān)察培養(yǎng)基、藥液或無(wú)菌水是否污染。(37±1)℃條件下培養(yǎng)72 h后觀(guān)察并記錄結(jié)果。

測(cè)定樣品對(duì)病原菌24 h的最低抑制濃度(MIC)時(shí)，采用常量肉湯稀釋法。將已活化的菌種搖勻，吸取0.1 mL于9.9 mL液體培養(yǎng)基中稀釋成菌懸液。再將樣品配成系列質(zhì)量濃度的藥液，取0.1 mL與0.9 mL菌懸液混合于10 mL的無(wú)菌試管中，制成系列質(zhì)量濃度(1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g/L)的含菌帶毒培養(yǎng)液。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。陽(yáng)性對(duì)照組用溶樣溶劑代替藥液，其他條件不變，用于觀(guān)察細(xì)菌能否正常生長(zhǎng)。陰性對(duì)照則為液體培養(yǎng)基，其他條件不變，用于觀(guān)察培養(yǎng)基是否污染。(37±1)℃條件下培養(yǎng)24 h后，觀(guān)察并記錄結(jié)果，以不長(zhǎng)菌的最低濃度作為樣品對(duì)動(dòng)物病原菌的MIC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 18株廣西地不容內(nèi)生真菌對(duì)植物病原真菌的抑制活性

試驗(yàn)結(jié)果顯示(表1)，18株廣西地不容內(nèi)生真菌對(duì)植物病原真菌的抑制效果不盡相同，DBR-11對(duì)玉米小斑病菌、金橘砂皮病菌、辣椒炭疽病菌有極強(qiáng)的抑制效果，對(duì)玉米大斑病菌、水稻胡麻葉斑病菌、甘蔗鳳梨病菌和茶輪斑病菌有強(qiáng)的抑制效果。DBR-5、DRB-6、DRB-14和DRB-18只對(duì)10種植物病原真菌中的1種抑制效果強(qiáng)。而DBR-3、DRB-7、 DRB-8、 DRB-10、DRB-12、DRB-15和DRB-23對(duì)10種病原真菌都沒(méi)有抑制效果。其余的內(nèi)生菌僅對(duì)少數(shù)病原真菌有較強(qiáng)抑制效果或者有抑制效果。

注：根據(jù)抑菌帶寬度(T)評(píng)判抑菌活性，并分為5個(gè)級(jí)別：“—”代表無(wú)抑菌活性，菌絲交叉，T=0；“+”表示有抑菌活性，0 mm

2.2 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對(duì)10種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物在質(zhì)量濃度為5 g/L 時(shí)對(duì)10種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的72 h抑制活性，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最好，對(duì)10種植物病原真菌的抑制率均達(dá)到90%以上，對(duì)其中8種病原真菌的抑制率達(dá)到100%。正丁醇萃取物也有較好的抑菌活性，對(duì)3種植物病原真菌的抑制率達(dá)到80%以上，對(duì)其余病原真菌的抑制率為40.40%～65.74%。萃余物基本沒(méi)有抑菌活性。由此可知，活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯萃取物中。

表2 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對(duì)10種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性

注：同列數(shù)據(jù)后字母相同者表示在5%水平上差異不顯著(DMRT法)。

2.3 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對(duì)10種植物病原真菌菌絲的毒力

為進(jìn)一步明確 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物的抑菌效果，測(cè)定了乙酸乙酯萃取物對(duì)10種植物病原真菌菌絲的毒力，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對(duì)煙草黑脛病菌的毒力最高，EC50為0.007 2 g/L，對(duì)甘藍(lán)黑斑病菌的毒力最低，EC50為 0.446 5 g/L，最大毒力是最小毒力的62.01倍，對(duì)其余8種植物病原真菌的EC50值為0.038 2～0.228 5 g/L。

表3 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對(duì)10種植物病原真菌菌絲的毒力

注：具有最大EC50值樣品的相對(duì)毒力為1.00，其他各樣品的相對(duì)毒力用最大EC50值除以該樣品的EC50值而得。

2.4 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對(duì)15種動(dòng)物病原菌的抑制活性

用帶毒平板法測(cè)定DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對(duì)15種動(dòng)物病原菌的72 h抑制活性，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，當(dāng)萃取物質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)，DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對(duì)7種供試動(dòng)物病原菌有抑制活性，并且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制活性較革蘭氏陰性菌好。DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物正丁醇萃取物和萃余物對(duì)15種供試動(dòng)物病原菌均無(wú)抑制活性。以上結(jié)果表明，DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物病原菌的抑菌物質(zhì)也主要存在于乙酸乙酯萃取物中。

2.5 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對(duì)7種動(dòng)物病原菌的最低抑制濃度

根據(jù)表4的結(jié)果，將 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物配成系列質(zhì)量濃度梯度，并制成含菌帶毒培養(yǎng)液，測(cè)定其對(duì)7種動(dòng)物病原菌的24 h最低抑制濃度，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對(duì)痢疾志賀氏菌的抑制活性最高，MIC值為0.062 5 g/L，對(duì)其余6種動(dòng)物病原菌的MIC值為0.125～0.25 g/L。

表4 DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對(duì)15種供試動(dòng)物病原菌的抑制活性

注：“+”表示有菌生長(zhǎng)，“—”表示無(wú)菌生長(zhǎng)，下同。

表5 DBR-11 乙酸乙酯萃取物對(duì)7種供試動(dòng)物病原菌的最低抑制濃度

3 結(jié)論與討論

在拮抗試驗(yàn)中疣孢漆斑菌DBR-11對(duì)多數(shù)供試植物病原真菌有很好的抑制活性。該試驗(yàn)采取了平板對(duì)峙法，初步、定性判斷菌株是否對(duì)供試菌有抑菌活性，可減少不必要的工作量，節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間。拮抗試驗(yàn)中沒(méi)有抑制效果的菌株并非說(shuō)明其不能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，可能是5 d的時(shí)間太短而不能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)或者所使用的平板對(duì)峙法阻礙了抑菌物質(zhì)的擴(kuò)散，所以還可以用內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)病原菌進(jìn)行生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)，進(jìn)一步確認(rèn)和篩選抑菌優(yōu)良菌株。

有研究結(jié)果[13,19-20]顯示，內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物有廣泛的抑菌活性，本試驗(yàn)也表明，疣孢漆斑菌DBR-11乙酸乙酯萃取物有較強(qiáng)的抑菌活性，在5 g/L的質(zhì)量濃度下，其對(duì)10種植物病原菌的72 h抑制率均在90%以上，對(duì)煙草黑脛病菌的毒力最高，EC50為0.007 2 g/L；在2 g/L的質(zhì)量濃度下，其對(duì)15種動(dòng)物病原菌中的7種具有72 h的完全抑制能力，對(duì)痢疾志賀氏菌抑制效果最好，24 h最低抑制濃度為0.062 5 g/L。DBR-11發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物有廣譜的抗菌活性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，可以進(jìn)一步研究其中活性物質(zhì)的組分和單體結(jié)構(gòu)，探究其與廣西地不容抗菌成分的關(guān)系。

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Antimicrobial Activity of Endophytic FungusMyrotheciumverrucariaDBR-11 fromStephaniakwangsiensis

QING Zhen,ZHOU Qiuyan,SUN Wenbin,LUO Haiyu,DAI Meiqing，DENG Yecheng*

(College of Life Science,Guangxi Normal University/Key Laboratory of Ecology and Environmental Protection of Rare and Endangered Species，Ministry of Education of China,Guilin 541004,China)

To study the antimicrobial activity of endophytic fungi fromStephaniakwangsiensis,eighteen strains of endophytic fungi were isolated from the earthnuts ofStephaniakwangsiensis.Antagonism test was used for determining the inhibitory activity of the endophytic fungi against 10 plant pathogenic fungi.The results showed thatMyrotheciumverrucariaDBR-11 had good inhibitory activities against most tested pathogens.By further determining the antimicrobial activity of DBR-11 fermentation product,it found that ethyl acetate extract from its fermentation product had high inhibitory activity against the tested pathogentic microbes.The inhibition rates against 10 kinds of plant pathogenic fungi were more than 90% when the concentration of ethyl acetate extract of fermentation product was 5 g/L,with EC50value from 0.007 2 to 0.446 5 g/L,and it had highest virulence againstPhytophthoraparasiticawith the EC50value of 0.007 2 g/L.While there was a utterly inhibitory activity against seven species among fifteen animal pathogenic bacteria when the concentration of ethyl acetate extract of fermentation product was 2 g/L after 72 h observation,with the MIC values of 0.062 5—0.25 g/L,and it showed the best inhibitory activity againstShigelladysenteriaewith the MIC value of 0.062 5 g/L.The ethyl acetate extract of DBR-11 fermentation product has a broad spectrum of antimicrobial activity,with potential applications.

Stephaniakwangsiensis； endophytic fungi；Myrotheciumverrucaria； antimicrobial activity; fermentation product

2015-10-28

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013GXNSFAA019058)；廣西高校科研資助項(xiàng)目(2013YB037)

卿 朕(1988-)，男，廣西桂林人，在讀碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物。E-mail：491520293@qq.com

*通訊作者：鄧業(yè)成(1965-)，男，廣西全州人，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物及植物保護(hù)等研究工作。 E-mail:dyecheng@163.com

S476;S482.2+92

A

1004-3268(2016)05-0077-06