金屬硫蛋白基因MT1A在大腸桿菌中的自誘導表達條件優(yōu)化及其抗鎘性

王 昭，王 席，楊 威，彭 冬，柳忠玉*

(1.長江大學/濕地生態(tài)與農業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025；2.長江大學 生命科學學院， 湖北 荊州 434025)

金屬硫蛋白基因MT1A在大腸桿菌中的自誘導表達條件優(yōu)化及其抗鎘性

王 昭1,2，王 席2，楊 威2，彭 冬2，柳忠玉1,2*

(1.長江大學/濕地生態(tài)與農業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025；2.長江大學 生命科學學院， 湖北 荊州 434025)

為了提高金屬硫蛋白基因MT1A的高效表達和對重金屬的抗性，以菌體密度、可溶性目的蛋白表達量為評價指標，對工程菌自誘導的培養(yǎng)條件(誘導時間、誘導溫度)和培養(yǎng)基組分(蛋白胨、酵母粉、甘油、葡萄糖、乳糖)進行優(yōu)化，并對其抗鎘(Cd)性進行分析。結果表明，最優(yōu)自誘導培養(yǎng)基組分為2.0%蛋白胨、2.0%酵母粉、0.3%甘油、0.05%葡萄糖、0.3%乳糖；重組菌自誘導表達最優(yōu)培養(yǎng)條件為37 ℃培養(yǎng) 3 h，然后25 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 13 h，此時菌體密度、可溶性蛋白表達量、可溶性蛋白相對產(chǎn)量均最高，分別比未優(yōu)化ZYM-5052培養(yǎng)基提高77.7%、94.0%、244.8%。當Cd2+濃度為0.5 mmol/L時，高效表達金屬硫蛋白的菌株具有明顯的抗Cd活性。

金屬硫蛋白； 可溶性表達； 自誘導； 抗鎘性

隨著工農業(yè)的快速發(fā)展，大量工業(yè)廢水和生活污水被排放到環(huán)境中，造成水體和土壤重金屬污染日趨嚴重。如何有效地預防和治理重金屬污染已成為亟待解決的問題[1]。對重金屬污染的治理方法主要有農業(yè)生態(tài)修復、植物修復、微生物修復等。近年來，微生物修復以其高效性和安全性受到科研工作者的廣泛關注，并且取得一定進展，其中包括利用微生物表達金屬硫蛋白(metallothionein，MT)[2]。MT是一類普遍存在于生物體內的富含半胱氨酸、相對分子質量較低的金屬結合蛋白，具有高誘導特性和多種生物學功能[3]。尤其值得關注的是，由于 MT分子結構的特異性，MT可穩(wěn)定、高效地結合多種重金屬，如鎘(Cd)、汞(Hg)和 鉛(Pb)等，因而具有顯著地解除重金屬毒性的能力[4]。利用微生物高效表達MT可以實現(xiàn)重金屬的轉化和清除，而微生物體內MT的表達水平與重金屬轉化能力密切相關[5]。

本研究中心前期為了在大腸桿菌中表達人源金屬硫蛋白基因MT1A，以GST為表達標簽，構建了重組工程菌株 pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)。但是在LB培養(yǎng)基中，IPTG的誘導極易形成包涵體，并且對細胞生長有抑制作用，導致細胞不能高密度生長，大大限制工程菌修復重金屬污染的能力。而自誘導培養(yǎng)基中的乳糖無毒，乳糖作為誘導劑在表達大腸桿菌重組蛋白方面具有明顯的優(yōu)越性，可溶性蛋白表達量高，蛋白質產(chǎn)量高，成本低[6-8]。因此，本研究擬采用自誘導表達技術[9]實現(xiàn)MT1A基因的高產(chǎn)量及高活性表達，并研究重組工程菌株pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)對Cd的抗性， 以期為加強Cd污染的治理與修復，促進生態(tài)環(huán)境健康發(fā)展提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 表達融合蛋白 GS-MT1A的重組基因工程菌 pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)由暨南大學醫(yī)藥生物技術研究開發(fā)中心黃亞東教授惠贈。蛋白質分子量標準和 IPTG 均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基 ZYM-5052培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉、25 mmol/L Na2HPO4、25 mmol/L KH2PO4、50 mmol/L NH4Cl、5 mmol/L Na2SO4、2 mmol/L MgSO4、 0.5%甘油、0.05%葡萄糖、0.2%乳糖。LB培養(yǎng)基 ：1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉、1%NaCl。

1.2 菌體培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.1 培養(yǎng)基的對比 挑取工程菌 pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)的單菌落接種到含5 mL LB培養(yǎng)基的試管中，在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)14 h作為種子液。然后按1∶100接種到搖瓶中，分別加入新鮮 LB 培養(yǎng)基、ZYM-5052 自誘導培養(yǎng)基，在 37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。其中，LB 培養(yǎng)基中菌體培養(yǎng)至 OD600值達到 0.5時(大約3 h)，加入終濃度為 0.5 mmol/L 的 IPTG進行誘導。檢測不同培養(yǎng)時間菌體OD600值，繪制生長曲線，并在培養(yǎng)終點測定可溶性蛋白表達量，計算相對產(chǎn)量。

1.2.2 培養(yǎng)溫度的選擇 以 1%的接種量將種子液接種到ZYM-5052培養(yǎng)基中，首先在37 ℃培養(yǎng)3 h ，然后分別在30、25、20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)17 h。以在ZYM-5052培養(yǎng)基中 37 ℃恒溫培養(yǎng) 20 h 作為對照。發(fā)酵結束時測定菌體密度(OD600)和可溶性蛋白表達量，并計算相對產(chǎn)量。

1.2.3 培養(yǎng)時間的選擇 采用兩階段溫度進行培養(yǎng)， 37 ℃培養(yǎng)3 h，然后降溫至25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別在降溫后1、5、9、13、17 h取樣檢測菌體OD600和可溶性蛋白表達量，并計算相對產(chǎn)量。

1.2.4 ZYM-5052培養(yǎng)基組分的優(yōu)化 選取蛋白胨、酵母粉、乳糖、甘油、葡萄糖 5 個因素，每個因素選取 4 個水平，采用L16(45)正交試驗進行優(yōu)選(試驗設計見表1)。以1%的接種量將種子液接種于培養(yǎng)基中，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后以可溶性蛋白相對產(chǎn)量為指標篩選最優(yōu)組合。

表1 優(yōu)化培養(yǎng)基組分的正交試驗設計 %

1.3 可溶性蛋白表達量的測定

培養(yǎng)結束后收集菌體，加入1/20菌液體積的PBS懸浮菌體，冰上超聲裂解， 12 000×g離心10 min，分別收集上清和沉淀，進行 12% SDS-PAGE電泳。經(jīng)凝膠光密度掃描分析融合蛋白GS-MT1A的可溶性蛋白表達量，并計算可溶性蛋白的相對產(chǎn)量。相對產(chǎn)量=OD600×可溶性蛋白表達量。

1.4 重組工程菌的抗Cd性測定

以空載體菌株pET20b/BL21(DE3)為對照菌株，考察重組工程菌 pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)在優(yōu)化后的ZYM-5052培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件下的抗Cd性。當菌體 OD600值達到 0.5時，加入Cd(NO3)2使Cd2+的終濃度分別為0、0.1、0.5 mmol/L。每隔1 h取一次樣測OD600，培養(yǎng)直到出現(xiàn)平臺期。

2 結果與分析

2.1 2種菌體生長培養(yǎng)基的對比分析

由圖1和圖2可見，在IPTG誘導的 LB 培養(yǎng)基中， pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)重組基因工程菌在 0～6 h 菌體密度呈對數(shù)增長，10 h后菌體密度不再增加，培養(yǎng)終點菌體OD600為2.21，可溶性蛋白表達量為 9.2%，可溶性蛋白相對產(chǎn)量為20.24%；在ZYM-5052自誘導培養(yǎng)基中，pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)重組基因工程菌在 0～6 h 菌體密度呈對數(shù)增長，10 h 后菌體密度繼續(xù)增長，培養(yǎng)終點菌體 OD600為 2.78，可溶性蛋白表達量為 10.21%，可溶性蛋白相對產(chǎn)量為28.38%。由此可見，同LB培養(yǎng)基相比，ZYM-5052 培養(yǎng)基更適合菌體密度的提高和可溶性蛋白的表達，后續(xù)試驗將對該菌在ZYM-5052培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化。

圖1 pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)重組基因工程菌生長曲線

圖2 不同培養(yǎng)基對重組基因工程菌密度和可溶性蛋白表達量的影響

2.2 菌體培養(yǎng)條件的優(yōu)化結果

2.2.1 培養(yǎng)溫度 由圖3可見，隨著培養(yǎng)溫度的降低，可溶性蛋白表達量明顯提高，可溶性蛋白相對產(chǎn)量在 25 ℃ 時最大，此時菌體OD600為2.38，可溶性蛋白表達量為18.3%，比37 ℃恒溫培養(yǎng)提高了79.2%。由此可見，同37 ℃恒溫培養(yǎng)相比，兩階段溫度培養(yǎng)的可溶性蛋白表達量大幅度提升，后續(xù)試驗選擇兩階段溫度控制進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃培養(yǎng)3 h，25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。

A.37 ℃恒溫； B.兩階段溫度37 ℃/30 ℃；C.兩階段溫度37 ℃/25 ℃； D.兩階段溫度37 ℃/20 ℃圖3 不同培養(yǎng)溫度對重組基因工程菌密度和可溶性蛋白表達量的影響

2.2.2 培養(yǎng)時間 由圖4可知，隨著培養(yǎng)時間的延長菌體密度逐漸增大，可溶性蛋白表達量和可溶性蛋白相對產(chǎn)量均先升高后趨于平穩(wěn)，在13 h時最高。因此，確定培養(yǎng)條件為 37 ℃培養(yǎng)3 h，降溫至25 ℃后繼續(xù)培養(yǎng) 13 h。

圖4 不同培養(yǎng)時間對重組基因工程菌密度及可溶性蛋白表達量的影響

2.3 ZYM-5052培養(yǎng)基的優(yōu)化結果

2.3.1 培養(yǎng)基組分的正交試驗優(yōu)化 由表2可知，培養(yǎng)基對可溶性蛋白相對產(chǎn)量的影響順序為C>B>D>E>A，即5種因素的重要性依次為乳糖> 酵母粉>甘油>葡萄糖>蛋白胨。優(yōu)化的培養(yǎng)基組分組合為A4B4C4D1E2，即2.0%蛋白胨、2.0%酵母粉、0.3%乳糖、0.3%甘油、0.05%葡萄糖。

2.3.2 ZYM-5052優(yōu)化培養(yǎng)基的驗證 用優(yōu)化后的 ZYM-5052 自誘導培養(yǎng)基對重組基因工程菌進行自誘導發(fā)酵，并以 IPTG誘導的 LB 培養(yǎng)基、文獻[5]中的ZYM-5052自誘導培養(yǎng)基為對照進行比較，結果見表 3。用優(yōu)化后的自誘導培養(yǎng)基發(fā)酵獲得的菌體密度、可溶性蛋白表達量、可溶性蛋白相對產(chǎn)量均最高，分別比未優(yōu)化ZYM-5052培養(yǎng)基提高77.7%、94.0%、244.8%，比LB 培養(yǎng)基(IPTG 誘導)提高124.5%、115.3%、383.5%。

表2 優(yōu)化培養(yǎng)基組分對可溶性蛋白相對產(chǎn)量的影響

表3 培養(yǎng)基優(yōu)化前后培養(yǎng)重組基因工程菌效果的比較

2.4 重組基因工程菌的抗Cd性

在優(yōu)化后的ZYM-5052培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，以pET20b/BL21(DE3)作為對照菌，檢測重組菌pET20b-GSMT/BL21(DE3)對Cd的抗性，結果如圖5所示。當Cd2+濃度≤0.1 mmol/L時，重組菌pET20b-GSMT/BL21(DE3)和對照菌pET20b/BL21(DE3)的生長沒有明顯的差異，菌液密度總體隨處理時間延長逐漸增加 。當Cd2+濃度為0.5 mmol/L時，在處理4 h 后對照菌的生長開始明顯受到抑制，而重組菌的生長依舊保持較大增長趨勢，說明該重組菌株具有明顯的抗Cd2+活性。

圖5 不同Cd2+濃度下重組基因工程菌的生長情況

3 結論與討論

自誘導培養(yǎng)基已經(jīng)成功應用于多種酶和蛋白的高效表達[10-11]。本研究中心組前期構建了表達人源金屬硫蛋白基因MT1A的重組工程菌pET20b-GSMT/BL21(DE3)，但是目的蛋白在LB培養(yǎng)基(IPTG誘導)中以包涵體的形式表達，而且菌體密度低，因此，本研究探討了在ZYM-5052 培養(yǎng)基中高效自誘導表達金屬硫蛋白的可行性。

與單一溫度培養(yǎng)模式相比，在變溫培養(yǎng)模式下可溶性蛋白表達量明顯提高。張芙華等[12]提出，利用枯草芽孢桿菌(Bucillussubtilis)分批發(fā)酵生產(chǎn)角質酶的兩階段溫度控制策略，采用該策略最高酶活比37 ℃恒溫培養(yǎng)提高了83.4%。本研究采用兩階段溫度培養(yǎng)，即37 ℃培養(yǎng)3 h，降溫至25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)13 h，結果表明,可溶性蛋白表達量比37 ℃恒溫培養(yǎng)提高了79.2%。兩階段溫度調控策略有助于提高蛋白質的可溶性表達，可能是由于先在 37 ℃下培養(yǎng)增加菌體量，然后低溫培養(yǎng)減緩重組蛋白的合成速率以促進蛋白質正確折疊[12]。

通常使用的LB培養(yǎng)基組成成分簡單，不能滿足高密度發(fā)酵對營養(yǎng)的要求。而自誘導培養(yǎng)基中的乳糖既可以作為能源促進細胞高密度生長，也可以作為誘導劑提高細胞活性和蛋白質表達量，使菌體密度和可溶性蛋白表達量增加數(shù)倍[13]。叢楠等[14]對自誘導培養(yǎng)基成分優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，菌體密度和重組毒素IL-6表達量分別是優(yōu)化前的1.76 倍和 2.12 倍。本研究通過正交試驗對ZYM-5052自誘導培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化。優(yōu)化后培養(yǎng)基成分為： 2.0%蛋白胨、2.0%酵母、0.3%乳糖、0.3%甘油、0.05%葡萄糖，用優(yōu)化后的自誘導培養(yǎng)基發(fā)酵獲得菌體密度、可溶性蛋白表達量、可溶性蛋白相對產(chǎn)量均最高，分別比未優(yōu)化ZYM-5052培養(yǎng)基提高77.7%、94.0%、244.8%，分別比LB 培養(yǎng)基(IPTG 誘導)提高124.5%、115.3%、383.5%。由此可見，在ZYM-5052 培養(yǎng)基中高效自誘導表達金屬硫蛋白是可行的。另外，乳糖自誘導表達系統(tǒng)既保證了蛋白質表達的穩(wěn)定性，同時自誘導發(fā)酵過程中無需檢測菌體的生長狀態(tài)，避免了不必要的污染，并且節(jié)省成本[15-16]。

金屬硫蛋白主要包含MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ4種異構體，又可以劃分為多個功能亞型，例如MT-ⅠA、MT-ⅠB、MT-ⅠE、MT-ⅠF、MT-ⅠG、MT-ⅠH、 MT-ⅠX、MT-ⅡA等。徐玉鳳等[17]將水稻的10 個水稻 I 類 MT 基因在鋅(Zn) 和 Pb的酵母敏感突變體中異源表達，結果表明，表達水稻Ⅰ類 MT 基因的酵母細胞都在一定程度上提高了對Zn和 Pb 的耐受性。李華玲等[18]研究顯示，表達小鼠MT1 和MT2基因的大腸桿菌菌株對重金屬銅(Cu)的抗性明顯提高。李敏等[19]發(fā)現(xiàn)，與野生菌株相比，表達人源金屬硫蛋白基因mt的釀酒酵母細胞對Pb的吸附量提高了11%。許黎明等[4]研究顯示，人金屬硫蛋白基因MT1E的表達有助于提高釀酒酵母細胞對鉻(Cr)離子的抗性，而對Cu、Zn、錳(Mn)、鈷(Co)的抗性沒有明顯改善。由此可見，不同物種及不同亞型的MTs 對重金屬的解毒能力各不相同。本研究中高表達人源金屬硫蛋白基因MT1A的菌株具有明顯的抗Cd 活性，該菌株對其他重金屬離子的抗性以及抗性機制還有待進一步開展，該菌株有望在重金屬解毒和修復重金屬污染的環(huán)境中發(fā)揮作用。

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Optimization of Auto-induction Expression Conditions of Metallothionein GeneMT1AinEscherichiacoliand Its Cadmium Tolerance

WANG Zhao1,2,WANG Xi2,YANG Wei2,PENG Dong2,LIU Zhongyu1,2*

(1.Engineering Research Center of Ecology and Agricultural Use of Wetland,Ministry of Education/Yangtze University, Jingzhou 434025,China; 2.College of Life Sciences,Yangtze University,Jingzhou 434025,China)

In order to increase the protein yield and heavy metal resistance of metallothionein geneMT1A，auto-induction medium composition(tryptone,yeast extract,glycerol,glucose and lactose) and culture conditions(induction time and temperature) were optimized with bacterial density and expression level of soluble target protein as evaluation indexes,and the Cd tolerance was detected. The results showed that the optimal auto-induction medium composition were 2.0% yeast extract,0.3%glycerol,0.05%glucose,0.3% lactose.The optimum culture conditions were cultivating in 37 ℃ for 3 h firstly,then culturing in 25 ℃ for 13 h.Under the optimal condition,the bacterial density,the expression level and relative yield of soluble protein increased by 77.7%,94.0%,244.8%,respectively,compared to the unoptimized ZYM-5052 medium.Furthermore，the engineered bacteria had an obvious resistance to 0.5 mmol/L Cd2+.

metallothionein; soluble expression; auto-induction; Cd resistance

2015-12-24

長江大學濕地生態(tài)與農業(yè)利用教育部工程研究中心開放基金項目(KF201511)；長江大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(104892013034)

王 昭(1991-)，男，湖北仙桃人，在讀本科生，研究方向：環(huán)境生物技術。 E-mail:594226195@qq.com

*通訊作者：柳忠玉(1978-)，女，湖北潛江人，講師，博士，主要從事環(huán)境污染與生態(tài)修復方面的研究。 E-mail:zyliu2004@126.com

X171.5;Q78

A

1004-3268(2016)05-0066-05