胃癌患者血清miR-200b和miR-200c水平變化及臨床意義

陳志凱，傅松維，鮑舟君，李卓棟

(浙江省舟山醫(yī)院 檢驗(yàn)中心，浙江 舟山 316000)

胃癌患者血清miR-200b和miR-200c水平變化及臨床意義

陳志凱Δ，傅松維，鮑舟君，李卓棟

(浙江省舟山醫(yī)院 檢驗(yàn)中心，浙江 舟山 316000)

目的 觀察胃癌患者血清miR-200b和miR-200c水平變化特點(diǎn)，探討其臨床意義。方法 回顧性分析浙江省舟山醫(yī)院自2012年1月～2014年6月消化內(nèi)科及胃腸外科收治的84例胃癌患者為研究對(duì)象(觀察組)，選擇30例健康人為對(duì)照組。采用qRT-PCR檢測(cè)所有研究對(duì)象血清miR-200b和miR-200c水平，比較2組間血清miR-200b和miR-200c水平差異，探討胃癌患者血清miR-200b和miR-200c水平與其臨床及病理特點(diǎn)之間的關(guān)系。結(jié)果 胃癌組血清miR-200b和miR-200c水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。胃癌患者不同年齡、性別、分化程度和浸潤(rùn)深度之間血清miR-200b和miR-200c水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；較高臨床分期及合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清miR-200b和miR-200c水平明顯低于較低臨床分期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。血清miR-200b和miR-200c水平診斷胃癌的AUC分別為0.826(95%CI：0.741～0.911，P<0.001)和0.856(95%CI：0.778～0.935，P<0.001)。結(jié)論 胃癌患者血清miR-200b和miR-200c水平明顯降低，并且與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，檢測(cè)血清miR-200b和miR-200c水平有助于判斷胃癌并判斷預(yù)后。

胃癌；血清；miR-200b；miR-200c；臨床意義

近年來(lái)胃癌的發(fā)生率越來(lái)越高，但是因?yàn)槿狈τ行У暮Y查手段，大多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)到了病程的中晚期，因而失去最佳治療時(shí)機(jī)，因此其死亡率較高。血清腫瘤標(biāo)志物仍是診斷腫瘤性疾病的主要指標(biāo)之一，簡(jiǎn)單易行，無(wú)論是在大醫(yī)院還是基層醫(yī)院都可以實(shí)現(xiàn)。傳統(tǒng)的與胃癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物如CA72-4、CA12-5、CA19-9及CEA等雖然具有一定的臨床價(jià)值，但是其敏感性和特異性有限，難以滿(mǎn)足臨床需要[1]。隨著人們對(duì)于微小RNA(miRNA)的研究逐漸深入，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA與腫瘤性疾病的發(fā)生和發(fā)展具有密切聯(lián)系，因而有望成為診斷腫瘤的新指標(biāo)[2]。尤其是miR-200家族與消化系統(tǒng)腫瘤的關(guān)系已經(jīng)成為臨床醫(yī)師關(guān)注和研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，主要包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429五個(gè)成員[3]。研究顯示胃癌組織中miR-200b及miR-200c表達(dá)減少，且擁有較差的預(yù)后[4]。但是對(duì)于胃癌患者血清中的miR-200b和miR-200c水平變化及臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系報(bào)道較少。本研究旨在觀察胃癌患者血清miR-200b和miR-200c水平變化特點(diǎn)并探討其臨床意義，為臨床上更好地診斷胃癌提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究采用回顧性分析，選擇自2012年1月～2014年6月在浙江省舟山醫(yī)院消化內(nèi)科及胃腸外科住院治療的84例胃癌患者為研究對(duì)象，所有患者均符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)：①初次診斷為胃癌；②血清miR-200b和miR-200c水平的測(cè)定均在術(shù)前進(jìn)行；③均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為胃癌。排除以下患者：①既往診斷為胃癌，此次再次入院治療者；②測(cè)定血清miR-200b和miR-200c水平時(shí)已接受過(guò)胃癌切除手術(shù)者；③臨床資料不完整者。其中男49例，女35例；年齡36～84歲，平均(59.67±6.26)歲；分化程度為低分化54例，中分化18例，高分化12例；腫瘤浸潤(rùn)深度為侵及漿膜46例，未及漿膜38例；腫瘤的臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期44例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例。選取同期在我院進(jìn)行體檢的30例健康人為對(duì)照組，其中男18例，女12例；年齡34～83歲，平均(57.35±6.37)歲。2組間性別及年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 治療方法：所有研究對(duì)象均在入院時(shí)或體檢時(shí)抽取外周靜脈血5 mL用于檢測(cè)血清miR-200b和miR-200c水平，所有血液標(biāo)本采集后統(tǒng)一放置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存最后統(tǒng)一進(jìn)行操作。血清miR-200b和miR-200c水平的檢測(cè)均采用qRT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，所有試劑盒均由上海吉瑪生物科技有限公司提供，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。比較2組間血清miR-200b和miR-200c水平差異，探討胃癌患者血清miR-200b和miR-200c水平與其臨床及病理特點(diǎn)之間的關(guān)系，采用相關(guān)性分析探討血清miR-200b和miR-200c之間的相關(guān)性。

1.2.2 血清miR-200b和miR-200c的檢測(cè)方法：①血清總miRNA的提取：所有標(biāo)本均取離心后血清400 μL并參照Ambion公司提供的試劑盒提取血清總miRNA；②血清中總miRNA水平的檢測(cè)：根據(jù)Applied Biosystems公司提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用real-time qPCR進(jìn)行定量分析。采用RNU6作為內(nèi)參，所有引物均由Applied Biosystems公司合成，其中miR-200b和miR-200c的引物分別為5’-TGGATGGAGTCAGGTCTCTA-3’和5’-CAGTGAGGCTGGATTCG-3’。

2 結(jié)果

2.1 2組間血清miR-200b和miR-200c水平比較 胃癌組血清miR-200b和miR-200c水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組間血清miR-200b和miR-200c水平比較Tab.1 Comparison of serum miR-200b and miR-200c levels between

*P<0.05，與對(duì)照組比較，compared with control group

2.2 胃癌患者血清miR-200b水平與臨床及病理參數(shù)之間的關(guān)系 胃癌患者不同年齡、性別、分化程度和浸潤(rùn)深度之間血清miR-200b水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但是較高臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清miR-200b水平明顯低于較低臨床分期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 胃癌患者血清miR-200b水平與臨床及病理參數(shù)之間的關(guān)系Tab.2 The relation between serum miR-200b and clinical or pathological features in gastric cancer patients(±s)

2.3 胃癌患者血清miR-200c水平與臨床及病理參數(shù)之間的關(guān)系 胃癌患者不同年齡、性別、分化程度和浸潤(rùn)深度之間血清miR-200c水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但是較高臨床分期及合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清miR-200c水平明顯低于較低臨床分期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 胃癌患者血清miR-200c水平與臨床及病理參數(shù)之間的關(guān)系Tab.3 The relation between serum miR-200c and clinical or pathological features in gastric cancer patients(±s)

2.4 血清miR-200b和miR-200c水平診斷胃癌的ROC曲線分析 對(duì)血清miR-200b和miR-200c水平繪制診斷胃癌的ROC曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清miR-200b和miR-200c水平診斷胃癌的AUC分別為0.826(95% CI：0.741～0.911，P<0.001)和0.856(95% CI：0.778～0.935，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 血清miR-200b和miR-200c水平診斷胃癌的ROC曲線Fig.1 Receiver operating characteristic of serum miR-200b and miR-200c diagnosed as gastric cancer

3 討論

目前臨床上對(duì)于早期胃癌的診斷仍缺乏特異性的指標(biāo)和有效的手段，血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)仍然是臨床上常用的協(xié)助診斷腫瘤性疾病的方法之一。經(jīng)典的腫瘤標(biāo)志物主要包括以下3類(lèi)[5-6]：在胚胎期大量表達(dá)而正常人體內(nèi)僅少量表達(dá)，如甲胎蛋白(AFP)；腫瘤細(xì)胞膜糖基化形成的糖鏈抗原，如CA12-5；腫瘤組織中大量表達(dá)的酶、激素和蛋白質(zhì)等抗原。這些腫瘤標(biāo)志物在一定程度上能夠協(xié)助臨床醫(yī)師發(fā)現(xiàn)和診斷一些腫瘤性疾病，但是由于敏感性和特異性有限，其臨床價(jià)值難以滿(mǎn)足臨床需要。

微小RNA(miRNA)是人體內(nèi)非編碼的內(nèi)源性單鏈RNA分子，其大小約為22個(gè)核苷酸組成，涉及到體內(nèi)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程[7]。近年來(lái)隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)約52.5%編碼miRNA的基因位于腫瘤相關(guān)區(qū)域或染色體的脆性位點(diǎn)，這一點(diǎn)提示miRNA在腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用，并且被稱(chēng)為新型的腫瘤標(biāo)志物[8]。miR-200家族是其中研究較多的一類(lèi)微小RNA，諸多研究已經(jīng)證實(shí)miR-200家族在多種腫瘤(如惡性黑色素瘤、胰腺癌、膀胱癌、肝癌等)的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用[9]。miR-200b和miR-200c又是miR-200家族中研究較多的微小RNA，2者分別位于人類(lèi)的1號(hào)和12號(hào)染色體上，并且具有類(lèi)似的核心RNA序列，且在多數(shù)腫瘤疾病中表現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用，大量研究表明miR-200b和miR-200c與抑制腫瘤的侵襲性轉(zhuǎn)移具有密切聯(lián)系[10]。迄今為止對(duì)于miR-200研究較多地集中在抑制轉(zhuǎn)錄因子ZEB1/ZEB2的表達(dá)上，主要表現(xiàn)在miR-200可以直接抑制ZEB1/ZEB2的表達(dá)并增加E-鈣粘蛋白的生成，最終阻斷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。已有研究表明胃癌組織中miR-200b和miR-200c表達(dá)明顯下調(diào)，并且隨著其表達(dá)的降低，患者的臨床分期越高，且生存時(shí)間越短，并推測(cè)這種表達(dá)的下調(diào)與其直接抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNAMT3A和DNAMT3B和間接抑制DNAM1的表達(dá)有關(guān)[12]。但是對(duì)于胃癌患者血清中的miR-200b和miR-200c水平與腫瘤特征之間的關(guān)系研究較少。

本研究中通過(guò)檢測(cè)胃癌患者血清miR-200b和miR-200c水平后發(fā)現(xiàn)，胃癌組血清miR-200b和miR-200c水平均明顯低于健康人組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；胃癌患者不同年齡、性別、分化程度和浸潤(rùn)深度之間血清miR-200b和miR-200c水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但是較高臨床分期及合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清miR-200b和miR-200c水平明顯低于較低臨床分期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這一點(diǎn)與何利恒[13]的研究結(jié)果一致。表明胃癌患者體內(nèi)miR-200b和miR-200c水平的降低減弱了其正常的抗腫瘤作用，導(dǎo)致腫瘤擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移加劇。進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)表明血清miR-200b和miR-200c水平診斷胃癌的AUC分別為0.826(95% CI：0.741～0.911，P<0.001)和0.856(95% CI：0.778～0.935，P<0.001)，具有極高的臨床診斷價(jià)值。說(shuō)明血清miR-200b和miR-200c水平可以作為協(xié)助診斷胃癌的有效腫瘤標(biāo)志物，筆者相信隨著進(jìn)一步研究的深入和檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，血清miR-200b和miR-200c水平必將成為臨床上診斷胃癌的常規(guī)且有效的手段。

綜上所述，胃癌患者血清miR-200b和miR-200c水平明顯降低，并且與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，檢測(cè)血清miR-200b和miR-200c水平簡(jiǎn)單可行，并且有助于判斷胃癌及預(yù)后。

[1] 甘建春，劉寧，王德候，等.血清腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9及CA72-4在胃癌中的應(yīng)用價(jià)值研究[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2014，12(6)：882-884，919.

[2] Bracken CP，Gregory PA，Kolesnikoff N，et al.A double-negative feedback loop between ZEB1-SIP1 and the microRNA-200 family regulates epithelial-mesenchymal transition[J].Cancer Res，2008，68(19)： 7846-7854.

[3] Snowdon J，Zhang X，Childs T，et al.The microRNA-200 family is upregulated in endometrial carcinoma[J].PLoS One，2011，6 (8)：e22828.

[4] 李小華. MiR-200家族在人胃癌組織的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究[D].南京：南京醫(yī)科大學(xué)，2011.

[5] Zhu YB，Ge SH，Zhang LH，et al.Clinical value of serum CEA，CA19-9，CA72-4 and CA24-2 in the diagnosis and prognosis of gastric cancer[J].Zhonghua Weichang Waike Zazhi，2012，15(2):161-164.

[6] Emoto S，Ishigami H，Yamashita H，et al.Clinical significance of CA125 and CA72-4 in gastric cancer with peritoneal dissemination[J]. Gastric Cancer，2012，15(2): 154-161.

[7] Li A，Omura N，Hong SM，et al.Pancreatic cancers epigenetically silence SIP1 and hypomethylate and overexpress miR-200a/200b in association with elevated circulating miR-200a and miR-200b levels[J].Cancer Res，2010，70(13)： 5226-5237.

[8] Karakatsanis A，Papaconstantinou I，Gazouli M，et al.Expression of microRNAs，miR-21， miR-31，miR-122，miR-145，miR-146a，miR-200c，miR-221，miR-222，and miR-223 in patients with hepatocellular carcinoma or intrahepatic cholangiocarcinoma and its prognostic significance[J].Mol Carcinog，2011(3): 24.

[9] Korpal M，Lee ES，Hu G，et al.The miR-200 family inhibits epithelial-mesenchymal transition and cancer cell migration by direct targeting of E-cadherin transcriptional repressors ZEB1 and ZEB2[J].J Biol Chem，2008，283(22)： 14910-14914.

[10] Smith CM，Watson DI，Leong MP，et al.miR-200 family expression is downregulated upon neoplastic progression of Barrett’s esophagus[J].World J Gastroenterol，2011，17(8)：1036-1044.

[11] Kurashige J，Kamohara H，Watanabe M，et al.MicroRNA-200b regulates cell proliferation，invasion，and migration by directly targeting ZEB2 in gastric carcinoma[J].Ann Surg Oncol，2012(5):64.

[12] 常靚.胃癌中 microRNA-200 家族的表達(dá)及其功能的研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2013.

[13] 何利恒. miR-200b和miR-200c在人胃癌患者血清中的表達(dá)及其臨床意義[D].衡陽(yáng)：南華大學(xué)，2014.

(編校：王儼儼)

Changes of serum levels of miR-200b and miR-200c in patients with gastric cancer and its clinical significance

CHEN Zhi-kaiΔ, FU Song-wei, BAO Zhou-jun, LI Zhuo-dong

(Inspection Center，Zhoushan Hospital of Zhejiang Province, Zhoushan 316000, China)

ObjectiveTo obverse the changes of serum levels of miR-200b and miR-200c in patients with gastric cancer and discuss its clinical significance. MethodsA total of 84 patients with gastric cancer admitted at the department of gastroenterology and gastrointestinal surgery of Zhoushan Hospital of Zhejiang Province from January 2012 to June 2014 were retrospectively investigated(the observation group) and 30 healthy people were selected as the control group. The levels of serum miR-200b and miR-200c of all people were tested by qRT-PCR and the difference about serum miR-200b and miR-200c were compared between the two groups and the relation among the serum miR-200b and miR-200c and clinical or pathological features were discussed. ResultsThe levels of serum miR-200b and miR-200c of the gastric cancer group was lower than that of the control group, respectively, there were significant differences(allP<0.05). There were no statistical significances in serum miR-200b and miR-200c with different ages, genders, differentiation degree and depth of invasion. The levels of serum miR-200b and miR-200c of the gastric cancer patients with higher degree of clinical stage and lymphatic metastasis was lower than that of the gastric cancer patients with lower degree of clinical stage and without lymphatic metastasis,respectively, the differences were statistically significant(allP<0.05).The AUC of the levels of serum miR-200b and miR-200c to diagnose gastric cancer were respectively 0.826(95% CI 0.741-0.911,P<0.001) and 0.856(95% CI：0.778-0.935,P<0.001). ConclusionThe levels of serum miR-200b and miR-200c in patients with gastric cancer decrease obviously and they are closely related to clinical stages and lymph node metastasis; it is helpful to diagnose gastric cancer and pedict prognosis to test the serum miR-200b and miR-200c.

gastric cancer; serum; miR-200b; miR-200c; clinical significance

陳志凱，通信作者，男，本科，初級(jí)檢驗(yàn)師，研究方向：胃癌腫瘤標(biāo)志物血清檢驗(yàn)，E-mail：sdlwwlli@126.com。

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.64