青鵬軟膏治療大鼠實驗性濕疹皮炎的作用機理

陳偉

(天津市第五中心醫(yī)院 皮膚科，天津 300450)

青鵬軟膏治療大鼠實驗性濕疹皮炎的作用機理

陳偉Δ

(天津市第五中心醫(yī)院 皮膚科，天津 300450)

目的 分析青鵬軟膏對濕疹皮炎大鼠治療的作用機理。方法 將濕疹皮炎造模成功的14只大鼠隨機分成對照組和研究組，對照組不給予任何處理，研究組給予青鵬軟膏治療，另選取7只大鼠為正常組，采取免疫組織化學法檢測皮膚組織中高遷移率族蛋白1(high mobility group protein，HMGB)、Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)及白細胞介素(interleukin-17，IL-17)蛋白表達水平。結果 對照組BUN顯著高于正常組，研究組BUN顯著低于對照組，而高于正常組(P<0.05)。研究組和對照組大鼠IL-17、HMGB1、TLR4在皮膚組織中的表達水平均較正常組明顯升高，而研究組大鼠3項指標水平較對照組大鼠明顯下降，上述對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 青鵬軟膏抑制濕疹皮炎大鼠HMGB1、TLR4、IL-17表達，并改善癥狀。

濕疹皮炎；青鵬軟膏；IL-17；HMGB1；TLR4

濕疹皮炎是一種常見的由多種內(nèi)外因素引起的表皮及真皮淺層的炎癥性皮膚病。其特點為自覺劇烈瘙癢，皮損多形性，對稱分布，有滲出傾向，慢性病程，易反復發(fā)作[1-2]。目前，關于濕疹皮炎的臨床研究較多，但其發(fā)病機制并未完全研究透徹，但有研究分析發(fā)現(xiàn)細胞因子高遷移率族蛋白1(high mobility group protein，HMGB)在濕疹皮炎致病中起著至關重要的作用，而Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)受體細胞及白細胞介素(interleukin-17，IL-17)表達與其有著緊密的協(xié)同作用[3-4]。本研究分析青鵬軟膏對濕疹皮炎大鼠皮膚組織中IL-17、HMGB1、TLR4表達的影響及作用，選取3組大鼠進行了對比研究，意在探究青鵬軟膏治療濕疹皮炎的作用機制，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組：選取14只雄性Wistar大鼠為濕疹皮炎模型，體質(zhì)量18～24 g，隨機分為對照組和研究組，另同時選取7只大鼠為正常組，所有選取大鼠均引種自美國Jackson實驗室，由北京大學醫(yī)學部免疫學系繁殖飼養(yǎng)，均于試驗前飼養(yǎng)1 w適應后進入實驗，自由飲食、飲水，開始實驗及終止實驗時間：12周齡初～16周齡末。

1.1.2 主要試劑：免疫組化檢測試劑盒(上海研卉生物科技有限公司)、兔抗大鼠TLR4多克隆抗體、兔抗大鼠HMGB1多克隆抗體、兔抗大鼠IL-17多克隆抗體(所有抗體均購自美國Abcam公司)、青鵬軟膏(西藏奇正藏藥股份有限公司，國藥準字421400Z50,20g/支)。

1.1.3 主要儀器：TU-1801紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；KHB，ST-360型酶標儀(上海科學實驗儀器有限公司)；TL-18M臺式高速冷凍離心機(上海市離心機械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法：除正常組外其他2組大鼠均于第1天于后背剪毛約2 cm×3 cm,并涂5%二硝基氯苯(DNCB)30 μL于皮膚首次致敏，7d后在大鼠右耳內(nèi)側涂0.2%的DNCB 50 μL激發(fā)，以后每隔3 d激發(fā)1次，連續(xù)5次。于第4、5次激發(fā)后24、36、72 h觀察大鼠右耳較左耳殼明顯紅腫，并出現(xiàn)滲出和結痂，表明造模成功。模型建立后，對照組和正常組大鼠均給予常規(guī)飼養(yǎng)，不給予其他處理，而研究組大鼠于試驗起點時于大鼠濕疹患處涂抹青鵬軟膏，每天2次，一共28 d。

1.2.2 標本采集方法：3組大鼠均于28 d時，行眼眶取血2 mL，常規(guī)分離(2000 r/min,離心10 min)血清后處死；將處死后大鼠雙側皮膚皮質(zhì)組織取樣，并分別行4%多聚甲醛、2%戊二醇固定；同時，切取部分組織冷凍，于-72 ℃環(huán)境下冷藏備用。

1.2.3 檢測方法：①尿素氮(BUN)檢測：對3組大鼠BUN水平用AU-400全血自動生化分析儀進行檢測；②免疫組化檢測：免疫組織化學法對取樣皮膚組織中的IL-17、HMGB1及TLR4蛋白的表達水平進行檢測：行常規(guī)切片→脫蠟水化→HE染色→抗原修復→稀釋后IL-17多克隆抗體、HMGB1多克隆抗體及TLR4多克隆抗體處理(一抗與二抗的稀釋比例均為1:200)→4 ℃過夜；陰性對照用PBS代替一抗。免疫組化結果利用Leica 全自動顯微鏡(model DMLA，Leica Inc.，德國)統(tǒng)一在400×(10×40)采集圖像，并利用Image-Pro Plus 圖像分析軟件(Version 4.1, Media Cybernetics)進行灰度分析，以反映響應蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 BUN水平對比 對照組為(9.62±0.81)μmol/L，與正常組(6.92±0.94)μmol/L比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=5.76，P<0.05)。研究組(8.34±0.80)μmol/L與對照組和正常組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(t=2.97，t=3.04，P<0.05)。

2.2 免疫組化檢測結果 免疫組化結果見圖1、表1。與正常組比較，對照組皮膚組織中IL-17、HMGB1、TLR4蛋白表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。研究組皮膚組織中上述指標較正常組高，但顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 IL-17、HMGB1和TLR4在研究組和對照組皮膚組織中的免疫組化結果(×400)Fig.1 The immunohistochemical results of IL-17, HMGB1 and TLR4 in skins of two groups of rats(×400)

組別 IL-17(ng/mL)HMGB1(μg/L)TLR4(ng/L)正常組1.07±0.051.00±0.041.01±0.08對照組1.51±0.11*1.33±0.07*1.37±0.11*研究組1.29±0.09*#1.17±0.05*#1.19±0.09*#

*P<0.05，與正常組比較，compared with normal group；#P<0.05，與對照組比較，compared with control group

3 討論

濕疹皮炎病理改變具有多樣性及非均一性，濕疹為多數(shù)粟粒大紅色丘疹、丘皰疹或水皰，伴有明顯點狀或小片狀糜爛，滲液，結痂。損害境界不清。合并感染時可出現(xiàn)膿皰、膿性滲出及痂屑等[5-6]。濕疹皮炎的發(fā)病機制復雜，其發(fā)病機制與遺傳、免疫、環(huán)境、生理等多種因素有關，且此類疾病發(fā)病初期比較隱匿或急驟，發(fā)作兇險且治療后易出現(xiàn)復發(fā)現(xiàn)象，這些均給臨床治療帶來了困難[7-8]。濕疹皮炎發(fā)病機理目前尚無肯定的、可重復驗證的、動物實驗與臨床結果一致的結論[9-10]。目前多數(shù)學者認為，一些外來抗原(如逆病毒)和內(nèi)源性抗原作用于免疫調(diào)節(jié)功能異常的患者，使B淋巴細胞高度活躍增殖，產(chǎn)生大量自體抗體，并與相應抗原結合形成免疫復合物沉積于皮膚小球是濕疹皮炎的主要發(fā)病機制[11-12]。DNA與皮膚小球基底膜結合，并與循環(huán)中抗DNA抗體原位形成免疫復合物亦可參與濕疹皮炎的發(fā)生。一些補體成分的缺陷以紅細胞和吞噬細胞上FC或C3b受體密度減低，對免疫復合物的清除能力下降，可增加免疫復合物在組織中的沉積，加重組織損害[13-14]。補體激活，趨化因子形成，白細胞聚集，再釋出一系列炎癥介質(zhì)及細胞因子，導致小血管炎癥及皮膚小球損害。與此同時，皮膚組織也有明顯白細胞和巨噬細胞浸潤，這與細胞間粘附因子(ICAM)及MHC抗原有關[15-16]。由于濕疹皮炎的發(fā)病機制十分復雜，因此其皮膚病理改變也呈多樣化及多變化，每一患者的皮膚組織及小血管均可能出現(xiàn)不同的改變。濕疹皮炎主要組織學改變在皮膚組織，但是皮膚小血管的改變同樣也決定患者的預后。皮膚組織病理的損傷，在很大程度上取決于抗體沉積的數(shù)量和所誘發(fā)的炎癥反應的強度。持續(xù)的抗體沉積，不斷引發(fā)炎癥，最終導致不可逆的損害。其皮膚病理改變的特征為：“鐵絲圈”病損：由于內(nèi)皮沉積物而使基膜增厚，電鏡和免疫熒光檢查有大量的內(nèi)皮下沉積物，是濕疹皮炎皮膚損害的重要特征；蘇木素小體：一般認為是抗核體在原位造成細胞損傷所致，由核染色聚集而成；壞死性血管炎：微動脈和毛細血管呈纖維素壞死；電鏡下可見電子致密物沉積、核碎裂、病毒樣顆粒和包涵物；免疫熒光檢查：有彌漫性顆粒狀沉積物，以IgG、C3為主[17-18]。

傳統(tǒng)治療濕疹皮炎的臨床方案為糖皮質(zhì)激素和環(huán)磷酰胺，雖然在一定程度上使得患者得到治愈，但其有效率不穩(wěn)定，且長期使用糖皮質(zhì)激素和環(huán)磷酰胺會出現(xiàn)感染、高血糖、高血壓、消化道潰瘍以及肝毒性、性腺損壞等不良反應[5-6]。目前如何提高臨床治療效果以及抑制復發(fā)和不良反應的出現(xiàn)、減少用藥量等已經(jīng)成為近年來濕疹皮炎臨床治療的研究熱點[19]。本研究結果顯示，濕疹皮炎會直接導致大鼠體內(nèi)血液中BUN的含量上升(P<0.05)，這說明該病癥會直接對大鼠皮膚功能造成損害，而給予青鵬軟膏處理后，發(fā)現(xiàn)研究組大鼠BUN水平較對照組下降(P<0.05)，這說明青鵬軟膏在一定程度上有助于改善大鼠皮膚功能的作用；濕疹皮炎大鼠模型皮膚組織中IL-17、HMGB1、TLR4蛋白表達水平均較正常組明顯提升(P<0.05)，這說明3者在皮膚致炎中可能起到一定的致炎作用，且3者之間呈現(xiàn)為協(xié)同作用，而這一研究結果得到了陳寧等的證實[9-10]；另外，研究組大鼠在給予青鵬軟膏處理后，發(fā)現(xiàn)該組大鼠皮膚組織中三指標蛋白表達水平較對照組大鼠明顯下降(P<0.05)，這說青鵬軟膏在一定程度上具備治療濕疹皮炎的效果，其能抑制上述三項指標的蛋白表達，進而起到緩解炎癥的作用。

綜上所述，青鵬軟膏能抑制IL-17、HMGB1、TLR4在皮膚組織中的表達，一定程度上能夠防止?jié)裾钇ぱ?，這對于治療因濕疹皮炎引發(fā)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡有一定的臨床價值。

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(編校：王儼儼)

Mechanism of Qingpeng ointment in the treatment of experimental eczema dermatitis in rat

CHEN WeiΔ

(Department of Dermatology, Tianjin Fifth Central Hospital, Tianjin 300450, China)

ObjectiveTo study the effect of Qingpeng ointment on LI-17, HMGB1 and TLR4 expression levels in the rat with eczema dermatitis.MethodsFourteen rats established eczema dermatitis model were randomly divided into study group and control group, control group were not given any treatment, study group

Qingpeng ointment, another 7 rats were selected as normal group.The expression levels of high mobility group protein (HMGB), Toll like receptor 4 (TLR4) and interleukin-17 (IL-17) in skin were detected by immunohistochemistry.ResultsThe BUN in control group was higher than the normal group, the BUN in study group was lower than the control group but higher than normal group(P<0.05).The expression levels of IL-17,HMGB1 and TLR4 in skin of study group and control group were higher than normal group,respectively,while the above indicators in study group were lower than control group (P<0.05).ConclusionQingpeng ointment could inhibit the expression levels of HMGB1, TLR4 and IL-17 in the rat with eczema and dermatitis, and improve the symptoms.

eczema dermatitis; Qingpeng ointment; IL-17; HMGB1; TLR4

陳偉，通信作者，女，副主任醫(yī)師，研究方向：變態(tài)反應性疾病，E-mail: chenweixs111@163.com。

R758.23

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.14