基于點擊化學的炔雌醇熒光傳感器

王春梅，盧麗君，林振宇

(1.龍巖學院化學與材料學院，福建龍巖364000; 2.福州大學化學學院，福建福州350116)

基于點擊化學的炔雌醇熒光傳感器

王春梅1，盧麗君2，林振宇2

(1.龍巖學院化學與材料學院，福建龍巖364000; 2.福州大學化學學院，福建福州350116)

炔雌醇是一種環(huán)境干擾物，高濃度的炔雌醇會對環(huán)境、生物等造成一定的傷害.根據(jù)Cu(I)可以催化炔雌醇與帶疊氮基團的疊氮香豆素之間的點擊化學反應(CuAAC反應)，生成具有1，2，3–三唑五元環(huán)的大分子結構化合物.由于整個分子中共軛結構的增加，使得反應后體系的熒光信號增強.通過檢測反應前后熒光信號的變化，可以實現(xiàn)對炔雌醇的高靈敏檢測.在最佳條件下，傳感器的相對熒光強度與炔雌醇的質(zhì)量濃度在0.1～2.5 μg·L－1范圍內(nèi)具有良好的線性關系，檢測限為0.05 μg·L－1.

炔雌醇;疊氮香豆素;Cu(I);熒光傳感器

0 引言

炔雌醇是重要的人工合成雌激素，屬于甾類同化激素中的一種［1］.炔雌醇常用作口服避孕藥和促進家畜生長的同化激素，在維持蛋白質(zhì)副特征和蛋白質(zhì)同化方面具有重要的作用.但是，如果人體長期大量攝入此激素，則可能使人體的生殖機能和生殖器官出現(xiàn)異常現(xiàn)象，導致性早熟、女性化，抑制骨骼和精子的發(fā)育等傷害［2］.另外，炔雌醇還可能通過魚肉、奶制品等食物危害人體健康，嚴重者甚至能誘發(fā)癌癥等疾?。?］.高濃度的炔雌醇同樣會影響魚類等海生生物的染色體表達等，從而對魚類的繁殖起到一定程度的危害作用，間接給人類帶來經(jīng)濟損失和生命傷害.環(huán)境內(nèi)分泌干擾物是指通過干擾生物天然激素的水平，對免疫系統(tǒng)、生物生殖系統(tǒng)等功能產(chǎn)生影響的外源性物質(zhì).炔雌醇被認為是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，常以藥物原形或其代謝產(chǎn)物形式隨排泄物排放到環(huán)境中.炔雌醇在體內(nèi)代謝后失活，但在污水中細菌的作用下又會被激活［4］，為重要的環(huán)境污染物之一.因此，炔雌醇的副作用引起了社會的廣泛關注和研究［5］，對環(huán)境土壤或水樣中的炔雌醇的含量進行研究檢測具有重要意義.

目前檢測炔雌醇常用的方法有液相色譜法［6］、質(zhì)譜法［7－9］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［10］、酶聯(lián)免疫分析方法［11－12］等.這些檢測方法能夠較好地實現(xiàn)對炔雌醇的檢測并且具有較高的選擇性和靈敏度，但色譜分析方法對檢測溶液的要求較嚴格，常常需要復雜、繁瑣的前處理步驟［13－14］，并且所使用的檢測儀器大型、昂貴，需要專業(yè)技術人員操作，需要花費較長的時間進行分析檢測，無法實現(xiàn)對炔雌醇的快速檢測;而酶聯(lián)免疫分析方法雖然具有較好的選擇性，避免了許多背景物質(zhì)帶來的干擾，但是其實驗操作步驟還是相對較繁瑣，同樣無法實現(xiàn)對炔雌醇的高效、快速檢測.因此，有必要設計出一種能夠操作步驟簡單、快速檢測炔雌醇的簡便傳感器.

炔雌醇分子結構中帶有一個端炔基團，因此可以與帶有疊氮基團的疊氮香豆素發(fā)生CuAAC反應.實驗著眼于一種快速且簡易檢測環(huán)境中炔雌醇的研究設想，基于CuAAC反應原理，設計了一種能夠快速檢測炔雌醇的熒光傳感器.將炔雌醇作為CuAAC反應中的反應物之一，其質(zhì)量濃度大小與反應前后熒光的變化成一定的定量關系，因此通過檢測體系熒光信號的變化進而檢測炔雌醇，并進行加標回收驗證.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熒光的測定利用Eclipse熒光分析光譜儀(Varian公司，美國)，熒光分析檢測實驗參數(shù):電壓650 V，λex=395 nm(slit 10 nm)，λem=400～550 nm(slit 10 nm).核磁共振波譜儀(AVANCE III 500，Bruker，瑞士)用于核磁共振氫譜檢測;質(zhì)譜采用離子阱質(zhì)譜儀(DECAX－30000 LCQ Deca XP，ThermoFinnigan，美國)測量;傅立葉紅外光譜儀(Nicolet 6700，Thermo Scientific，美國)用于紅外光譜掃描.

抗壞血酸鈉、五水硫酸銅、2，4－二羥基苯甲醛、N－乙酰基甘氨酸、無水乙酸鈉、乙酸酐，以及丙酮購自國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純;疊氮化鈉購自阿爾法埃莎中國有限公司;炔雌醇(EE2)購自上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司;3－疊氮基－7－羥基香豆素根據(jù)文獻報道方法合成［15］.

1.2 實驗方法

3－疊氮基－7－羥基香豆素化合物采用Wang課題組提出的方法［15］進行制備，具體步驟如下:分別稱取1.38 g 2，4－二羥基苯甲醛和1.12 g N－乙酰甘氨酸、無水乙酸鈉至50 mL乙酸酐溶液中，并超聲溶解，然后回流攪拌4 h，反應完成后，所得混合物倒入冰水中，得到黃色沉淀，過濾取黃色沉淀，并用冰水清洗沉淀物，然后再在30 mL鹽酸和乙醇的混合液(體積比2∶1)中回流1 h，反應完成后，采用冰浴將上述溶液冷卻，并用20 mL冰水稀釋上述溶液;加入20 mmol亞硝酸鈉，攪拌10 min后，再加入30 mmol疊氮化鈉，攪拌20 min.經(jīng)過濾、減壓干燥后得到的棕色固體為3－疊氮－7羥基香豆素化合物.

利用叔丁醇溶解疊氮香豆素固體粉末，配制5 mmol·L－1疊氮香豆素溶液.用二次水分別配制1 mmol·L－1硫酸銅溶液和0.1 mol·L－抗壞血酸鈉溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用).用溶劑丙酮溶解炔雌醇固體粉末，配制不同濃度的炔雌醇溶液.在200 μL的PBS緩沖溶液中先后加入5 μL、5 mmol·L－1疊氮香豆素溶液，5 μL含有不同質(zhì)量濃度炔雌醇的溶液(包含炔雌醇質(zhì)量濃度為0的空白對照組溶液)，5 μL、1 mmol·L－1硫酸銅溶液和5 μL、0.1 mol·L－1抗壞血酸鈉溶液，振搖混勻后室溫下反應1 h.檢測反應后溶液的熒光信號.

2 結果與討論

2.1 實驗原理

實驗所構建的基于CuAAC檢測炔雌醇環(huán)境干擾物熒光傳感器的實驗原理如圖1所示.

檢測目標物炔雌醇是帶有端炔基團的分子化合物，在硫酸銅和抗壞血酸鈉存在的條件下，能夠與帶有疊氮基團的疊氮香豆素發(fā)生CuAAC反應，生成具有強熒光信號的化合物.通過檢測反應前后熒光信號的變化，達到檢測炔雌醇的目的.

2.2 炔雌醇和雌二醇對比研究

為了探究上述設計的傳感器的可行性，實驗選擇了和炔雌醇結構相似、僅比炔雌醇缺少一個端炔基團的另外一種雌性激素雌二醇，進行對照實驗.

實驗結果如圖2(a)所示，隨著炔雌醇質(zhì)量濃度的增大，體系熒光強度逐漸增大;而對于雌二醇，當其質(zhì)量濃度增大時，體系的熒光強度幾乎沒有發(fā)生變化，如圖2(b)所示.該對照實驗結果表明，炔雌醇因具有端炔基團而能夠同疊氮香豆素發(fā)生CuAAC反應，從而使熒光增強，而與炔雌醇結構相似的雌二醇由于不具有端炔基團而無法與疊氮香豆素發(fā)生CuAAC反應.因此，上述構建的基于CuAAC檢測炔雌醇的傳感器原理可行.

2.3 檢測條件的優(yōu)化

為了獲得最佳實驗檢測條件，對實驗中影響較大的條件進行了優(yōu)化.首先，對CuAAC反應的時間進行優(yōu)化.如圖3(a)所示，熒光強度隨著反應時間的增加而逐漸增大，當反應時間達到60 min之后，體系的熒光強度趨于穩(wěn)定.因此，實驗選擇60 min作為CuAAC反應的時間.然后，對疊氮香豆素的濃度進行優(yōu)化.如圖3(b)所示，隨著疊氮香豆素濃度的增大，體系的相對熒光強度(即F/F0，F(xiàn)為不同濃度的疊氮香豆素與炔雌醇反應后溶液的熒光信號，F(xiàn)0為沒有炔雌醇參加反應、相應濃度下疊氮香豆素的熒光信號)先增強后減小，當疊氮香豆素濃度為0.125 mmol·L－1時，體系的熒光強度達到最大.出現(xiàn)此趨勢現(xiàn)象的原因，可能是因為疊氮香豆素本身具有微弱的熒光，當疊氮香豆素的濃度增大，體系的背景熒光也劇烈增強，導致F/F0的值增大得不夠明顯甚至減小.因此，實驗選擇0.125 mmol·L－1作為疊氮香豆素參與反應的濃度.第三，對硫酸銅溶液的濃度進行優(yōu)化，如圖3(c)所示，體系的相對熒光強度(即F/F0，F(xiàn)為不同濃度的Cu(II)參加反應后溶液的熒光信號，F(xiàn)0為沒有Cu(II)參加的溶液的熒光信號)隨著Cu(II)濃度的增大先是劇烈增大后下降，當Cu(II)濃度為0.25 μmol·L－1時，相對熒光值達到最大.出現(xiàn)此趨勢現(xiàn)象的原因可能是過量的Cu(II)會猝滅體系的熒光，使得檢測到的熒光信號減小.因此，實驗選擇0.25 μmol·L－1作為Cu(II)參與反應的濃度.

最后，對還原劑抗壞血酸鈉(SA)進行了優(yōu)化.如圖3(d)所示，體系的相對熒光強度(即F/F0，F(xiàn)為不同濃度的抗壞血酸鈉參加反應后溶液的熒光信號，F(xiàn)0為沒有SA參加的溶液的熒光信號)隨著SA濃度的增大先逐漸增大后趨于穩(wěn)定(略有下降)，當SA濃度大于2.5 mmol·L－1時，熒光強度已基本趨于穩(wěn)定.因此，實驗選擇2.5 mmol·L－1作為SA參與反應的濃度.

2.4 線性范圍與檢測限

在最優(yōu)條件下，對傳感器的線性范圍和檢測限進行了探究.如圖4所示，體系的熒光強度隨著炔雌醇質(zhì)量濃度的增大而增強，并且在0.1～2.5 μg·L－1范圍內(nèi)，體系的相對熒光強度與炔雌醇的質(zhì)量濃度呈良好的線性關系.線性方程為F/F0=1.202 7+0.343 3 ρ(μg·L－1)(其中F為不同質(zhì)量濃度的炔雌醇參加反應后溶液的熒光信號，F(xiàn)0為沒有炔雌醇參加反應的溶液的熒光信號;ρ為炔雌醇的質(zhì)量濃度)，如圖5所示，相關系數(shù)R為0.997 1，傳感器的檢測限為0.05 μg·L－1.

2.5 傳感器的重現(xiàn)性與選擇性實驗

實驗對傳感器的重現(xiàn)性做了考察，制備了5組平行檢測炔雌醇的傳感器(1.0 μg·L－1)，測得實驗結果的相對標準偏差(RSD)為4.6%，表明該傳感器具有較好的重現(xiàn)性.

為了探究該傳感器的選擇性，實驗選擇了除炔雌醇之外的3種不同環(huán)境干擾物(己烷雌酚、雙酚A、雌二醇)作為干擾實驗.如圖6所示，己烷雌酚、雙酚A、雌二醇對傳感器幾乎沒有熒光響應，只有炔雌醇熒光強度增強(其中己烷雌酚、雙酚A、雌二醇的質(zhì)量濃度均為50 μg·L－1，炔雌醇質(zhì)量濃度為0.5 μg·L－1).結果表明，該傳感器對炔雌醇的檢測具有較好的選擇性.

2.6 水樣添加回收率實驗

基于傳感器的檢測原理，實驗對超純水、自來水、河水(福建閩江)3種水樣分別檢測了炔雌醇的質(zhì)量濃度.實驗結果如表1所示，采用以上實驗檢測炔雌醇的方法，3種水樣中均未檢測出炔雌醇.分別對3種水樣做3個不同水平(0.25、0.50、2.5 μg·L－1)的添加回收率實驗.得到的回收率為94%～110%，相對標準偏差為4%～7%，實驗結果較理想，說明該檢測方法在復雜實際樣的檢測中是可行的.

表1 水樣中炔雌醇的檢測Tab.1Analysis of ethinylestradiol in water samples

3 結論

利用CuAAC反應，構建一種高選擇性、快速檢測環(huán)境干擾物炔雌醇的熒光傳感器.該檢測方法的優(yōu)勢在于操作簡單、檢測快速，無需太多的處理步驟，具有即時性.將該傳感器應用于水環(huán)境中炔雌醇的檢測，結果較理想，具有一定的實用性.

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(責任編輯:洪江星)

Fluorescence sensor for ethinylestradiol based on click chemistry

WANG Chunmei1，LU Lijun2，LIN Zhenyu2
(1.College of Chemistry and Material Science，Longyan University，Longyan，F(xiàn)ujian 364000，China; 2.College of Chemistry，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350116，China)

Ethinylestradiol is an environmental distractor，high concentrations of ethinylestradiol may cause certain harm to environment and biological.In this study，a selective fluorescent sensor based on click chemistry for ethinylestradiol detection of had been proposed.Ethinylestradiol has the terminal alkyne which can react with 3－azido－7－h(huán)ydroxycoumarin through Cu(I)catalysed alkyne－azide cycloaddition(CuAAC)reaction to form a strong fluorescent compound.The fluorescence increased factor (represented by F/F0)of the system exhibited a good linear relationship with the mass concentration of ethinylestradiol in the range of 0.1 to 2.5 μg·L－1and the detection limit was 0.05 μg·L－1(S/N=3).

ethinylestradiol;3－azido－7－h(huán)ydroxycoumarin;Cu(I);fluorescent sensor

TP212.2

A

10.7631/issn.1000－2243.2016.06.0901

1000－2243(2016)06－0901－05

2016－07－04

林振宇(1976－)，研究員，主要從事化學傳感器方面的研究，zylin@fzu.edu.cn

國家自然科學基金資助項目(21175024)