核桃楸青果皮中胡桃醌的提取工藝

馮遲++王舒雅++高俊

摘要：以核桃楸青果皮為原料，以固液比、超聲溫度、超聲時(shí)間和超聲功率為考察因素，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)選核桃楸青果皮中胡桃醌的最佳提取方法，通過L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)提取過程進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，超聲輔助提取為最佳提取方法，其最佳工藝條件：提取溶劑為90%乙醇溶液，固液比1 mg ∶18 L，超聲溫度30 ℃，超聲時(shí)間30 min，超聲功率 200 W，此時(shí)胡桃醌的提取率為1.72 mg/g。

關(guān)鍵詞：胡桃醌；核桃楸青果皮；正交試驗(yàn)；超聲輔助提取

中圖分類號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0340-03

核桃楸（Juglans mandshurica）為胡桃科胡桃屬落葉喬木，是我國珍貴的藥源植物。核桃楸青果皮中含有較多的活性物質(zhì)胡桃醌（5-羥基-1，4-萘醌）[1]。核桃成熟期間，大量核桃楸青果皮被當(dāng)作垃圾堆放于地頭、溝邊或田間，對(duì)環(huán)境造成極大污染，如果能對(duì)核桃楸青果皮中的有效物質(zhì)進(jìn)行有效利用，則在保護(hù)環(huán)境的同時(shí)還能增加果農(nóng)的收入，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益?，F(xiàn)代藥用研究表明，胡桃醌具有很好的鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和抑癌作用，胡桃醌進(jìn)入細(xì)胞體具有抗真菌細(xì)胞毒素和抗濾過性病原體的性質(zhì)[2-3]。本試驗(yàn)以胡桃醌提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)胡桃醌的提取方法及其工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為核桃楸青果皮及其藥用價(jià)值的充分利用提供依據(jù)[4-6]。

1材料與方法

1.1材料與試劑

核桃楸果實(shí)，購自吉林省通化市（長白山林區(qū)）；對(duì)照品為胡桃醌，純度≥97%，由Sigma公司生產(chǎn)；甲醇為色譜純，由J&K化學(xué)有限公司生產(chǎn)；去離子水自制；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器

Agilent 1260LC高效液相色譜儀，配置G1311-B四元泵、G1311-B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316-A柱溫箱、G1314-F紫外檢測器，由美國Agilent公司生產(chǎn)；Milli-Q純水儀，由美國Millipore公司生產(chǎn)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，由江蘇省昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；Allegra X-30R型離心機(jī)，由美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)。

1.3原料的預(yù)處理

因胡桃醌為小分子萘醌，于45 ℃左右易升華，所以采用真空冷凍干燥方法，先將核桃楸青果皮用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，再將核桃楸青果皮進(jìn)行粉碎，過60～80目篩，即得試驗(yàn)所需原料[7]。

1.4分析方法

通過全波長掃描，胡桃醌在250 nm處有特征吸收峰，采用高效液相色譜法檢測樣品中胡桃醌含量（圖1）[8]。色譜條件為：Agilent ODS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相A相為超純水溶液，B相為甲醇溶液，流動(dòng)相配比為A ∶B=35 ∶65[9]。

1.5胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品4.00 mg，用甲醇溶解于10 mL容量瓶中，定容[10]，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液；精確量取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋配制成濃度為0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0.003 125 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；分別用0.22 μm濾膜過濾，進(jìn)行HPLC檢測，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次[11]。以胡桃醌濃度（XJuglone）為橫坐標(biāo)，以胡桃醌峰面積積分值（YJuglone）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程YJuglone=99.053XJuglone -0.237 15（r2=0.999 4），胡桃醌在0.006 25～0.3 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.6提取方法的比較

1.6.1索式提取法準(zhǔn)確稱取絕干核桃楸青果皮樣品 1.0 g，置于500 mL索氏提取器燒瓶中，加入20 mL乙醇溶液，熱回流2次，水浴溫度為80 ℃，每次30 min；離心，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾；HPLC檢測。

1.6.2冷浸法準(zhǔn)確稱取絕干核桃楸青果皮樣品1.0 g，加入20 mL乙醇溶液，密封，置于避光處冷浸12 h；離心，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾；HPLC檢測。

1.6.3超聲輔助提取法準(zhǔn)確稱取絕干核桃楸青果皮樣品1.0 g，置于50 mL錐形瓶中，加入20 mL乙醇溶液，密封，超聲輔助提取30 min（超聲溫度30 ℃、功率250 W）；離心，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾；HPLC檢測。

1.7單因素試驗(yàn)

1.7.1乙醇濃度對(duì)胡桃醌提取率的影響準(zhǔn)確稱取絕干核桃楸青果皮樣品1.0 g，依次加入濃度為80%、85%、90%、95%、100%的乙醇溶液 20 mL，超聲提取30 min（超聲溫度 30 ℃、超聲功率250 W）；離心，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾；HPLC檢測。

1.7.2固液比對(duì)胡桃醌提取率的影響準(zhǔn)確稱取絕干核桃楸青果皮樣品1.0 g，以1 g ∶12 mL、1 g ∶14 mL、1 g ∶16 mL、1 g ∶18 mL、1 g ∶20 mL 的固液比加入90%乙醇溶液，超聲提取30 min（超聲溫度30 ℃、超聲功率250 W）；離心，取上清液，用 0.22 μm 濾膜過濾；HPLC檢測。

1.7.3超聲溫度對(duì)胡桃醌提取率的影響準(zhǔn)確稱取絕干核桃楸青果皮樣品1.0 g，以1 g ∶16 mL的固液比加入90%乙醇溶液，在超聲功率250 W條件下，依次以20、25、30、35、40 ℃ 的超聲溫度反應(yīng)30 min；離心，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾；HPLC檢測。

1.7.4超聲時(shí)間對(duì)胡桃醌提取率的影響準(zhǔn)確稱取絕干核桃楸青果皮樣品1.0 g，以1 g ∶16 mL的固液比加入90%乙醇溶液，在超聲功率250 W、超聲溫度30 ℃條件下，依次超聲反應(yīng)10、20、30、40、50 min；離心，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾；HPLC檢測。

1.7.5超聲功率對(duì)胡桃醌提取率的影響準(zhǔn)確稱取絕干核桃楸青果皮樣品1.0 g，以1 g ∶16 mL的固液比加入90%乙醇溶液，在30 ℃超聲溫度條件下，依次以超聲功率150、175、200、225、250 W反應(yīng)30 min；離心，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾；HPLC檢測。

1.8正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

運(yùn)用超聲法提取，以固液比（A）、超聲溫度（B）、超聲時(shí)間（C）、超聲功率（D）為考察因素，進(jìn)行4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)（表1） [12]。

2結(jié)果與分析

2.1提取方法的比較

游離的醌類化合物一般都具有升華性，而胡桃醌屬于小分子萘醌，具有揮發(fā)性，溫度過高時(shí)胡桃醌會(huì)隨溶劑揮發(fā)而損失，導(dǎo)致提取率最低。由圖2可知，索式提取法對(duì)胡桃醌的提取率相對(duì)最低；超聲提取法所用時(shí)間短、提取效率相對(duì)最高，優(yōu)于冷浸法。

2.2單因素對(duì)胡桃醌提取率的影響

2.2.1乙醇濃度對(duì)胡桃醌提取率的影響由圖3可見，隨乙醇濃度的增加，胡桃醌提取率逐漸增加，乙醇濃度為80%～90%時(shí)，胡桃醌提取率增加較快，這是由于有機(jī)溶劑的增加有助于胡桃醌的溶解；當(dāng)乙醇濃度進(jìn)一步增加時(shí)，胡桃醌提取率增長趨勢趨于平緩，基本持平。因此，90%乙醇溶劑是最為適宜用量。

2.2.2固液比對(duì)胡桃醌提取率的影響由圖4可見，固液比在1 g ∶（12～16） mL時(shí)，胡桃醌提取率隨提取溶劑用量的增加而增加，這說明溶劑量增大，會(huì)直接影響胡桃醌從原料內(nèi)部向外部擴(kuò)散；固液比在1 g ∶（16～20） mL時(shí)，胡桃醌提取率基本持平?？紤]到提取溶劑用量增加時(shí)，不僅會(huì)增加生產(chǎn)成本，還會(huì)增加分離純化難度，所以固液比以1 g ∶16 mL為宜。

2.2.3超聲溫度對(duì)胡桃醌提取率的影響由圖5可見，超聲溫度為20～30 ℃時(shí)，胡桃醌提取率隨溫度上升而增加，這是由于溫度升高，胡桃醌擴(kuò)散系數(shù)增大，有效成分浸出速度加快，從而提取率增加較快；當(dāng)超聲溫度為30～40 ℃時(shí)，胡桃醌提取率下降，這是由于溫度過高，胡桃醌結(jié)構(gòu)遭到破壞。所以，超聲溫度以30 ℃為宜。

2.2.4超聲時(shí)間對(duì)胡桃醌提取率的影響由圖6可見，超聲時(shí)間為10～30 min時(shí)，胡桃醌提取率隨提取時(shí)間延長而逐漸增加，這是由于隨著超聲時(shí)間的延長，超聲波對(duì)底物產(chǎn)生的攪拌和空化作用增強(qiáng)，進(jìn)而使溶出物質(zhì)增多；超過30 min時(shí)，超聲波會(huì)破壞提取物中部分胡桃醌的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致提取率降低。因此，為保證有效成分結(jié)構(gòu)完好且提取盡可能完全，超聲時(shí)間以30 min為宜。

2.2.5超聲功率對(duì)胡桃醌提取率的影響超聲波作用的效果取決于單位面積輸出的超聲功率和所提取物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，不同的提取物有不同的適宜超聲功率范圍，超過此范圍，超聲作用可能對(duì)提取物結(jié)構(gòu)造成損害，從而影響其提取量。由圖7可見，胡桃醌提取率隨超聲功率的增加而增加；當(dāng)超聲功率超過200 W，胡桃醌提取量隨超聲功率的增加而下降，這可能是由于高超聲功率可使胡桃醌分解。所以，胡桃醌提取超聲功率以200 W為宜。

2.3正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳工藝組合

由表2、表3可見，影響核桃楸青果皮中胡桃醌提取率的因素從大到小依次為固液比>超聲功率>超聲時(shí)間>超聲溫度，核桃楸青果皮中胡桃醌的最佳提取工藝為A3B2C2D2，即固液比1 g ∶18 mL、超聲溫度30 ℃、超聲時(shí)間30 min、超聲功率200 W。按正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證，測得核桃楸青果皮中胡桃醌的平均提取率為1.72 mg/g。

3結(jié)論

胡桃醌為小分子萘醌，45 ℃左右易升華，所以索式提取法胡桃醌提取率相對(duì)最低。超聲提取法由于直接作用于分子內(nèi)部，提取效率高，提取率高于索氏提取法、冷浸法。本試驗(yàn)對(duì)核桃楸青果皮中胡桃醌提取工藝的影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，最終確定超聲波輔助提取的最佳工藝條件：90%乙醇溶液為溶劑、固液比為1 g ∶18 mL、超聲溫度為30 ℃、超聲時(shí)間為30 min、超聲功率為200 W，此條件下胡桃醌的提取率為1.72 mg/g，這為核桃楸青果皮中有效成分胡桃醌的開發(fā)利用提供了一個(gè)較為科學(xué)合理的理論依據(jù)。

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