四唑染色法測定茄子種子生活力

余振宙++陶鴻++占夢丹

摘要：根據(jù)四唑（2，3，5-Triphenyl Tetrazolium Chloride，縮寫TTC）染色法測定種子生活力的原理，研究不同濃度四唑溶液，不同染色溫度和不同染色時間對京茄218茄子種子生活力測定的影響，摸索出測定茄子種子生活力的最佳條件。結(jié)果表明，四唑溶液濃度，染色溫度，染色時間三者之間存在一定的相關(guān)性，通過改變?nèi)咧械囊徽呋騼烧呖梢赃_(dá)到改變其他兩者或一者的目的，因此，可根據(jù)實際需要來確定測定條件。比較四唑染色法測定京茄218茄子種子生活力的不同條件，本研究提出處理組合11（浸種溫度20 ℃、浸種時間18 h、染色液濃度1%、染色溫度35 ℃、染色時間18 h）和處理組合23（浸種溫度30 ℃、浸種時間4 h、染色液濃度1%、染色溫度35 ℃、染色時間18 h）為最理想的2組處理組合，為TTC法快速測定京茄218茄子種子生活力的適宜方法。

關(guān)鍵詞：四唑染色；茄子種子；生活力

中圖分類號： S641.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0206-03

收稿日期：2015-04-09

基金項目：北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科研基金（編號：QNJJ201211）；國家科技支撐計劃（編號：2012BAK26B03）；北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項（編號：KJCX201202001、KJCX20140111）；北京市科委重大科研項目（編號：D131100000413001）。

作者簡介：：余振宙（1989—），男，安徽潛山人，碩士。E-mail：291765585@qq.com。

通信作者：孟淑春，副研究員，主要從事蔬菜種質(zhì)資源和種子技術(shù)研究。E-mail：mengshuchun@nercv.org。種子生活力是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，是種用價值的主要組成部分，與種子田間出苗率密切相關(guān)，是反映種子生命過程中十分重要的特性之一[1]。由于采用常規(guī)的發(fā)芽試驗測定發(fā)芽力需要的時間較長，而種子壽命長短各異，為了確定種子是否能用于播種及確定播種量，有必要進(jìn)行種子生活力的快速高效率測定。目前種子生活力的快速測定法主要有四唑（2，3，5-氯化三苯基四氮唑；2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）染色法，溴麝香草酚蘭（BTB）法和紫外熒光法等。其中種子生活力TTC測定法現(xiàn)已被世界各國廣泛使用，其原理為有生活力的種子胚細(xì)胞含有脫氫酶，具有脫氫還原作用，被種子吸收的無色TTC接受活種子呼吸過程中脫氫酶產(chǎn)生的氫，而變成還原態(tài)的紅色穩(wěn)定不擴(kuò)散物質(zhì)[2]，即不溶于水的三苯基甲腙（TTF），而無生活力的種子則無此反應(yīng)，故無染色出現(xiàn)，由此可按胚組織的染色情況區(qū)分是否有生活力的種子[3]。

茄子（Solanum melongena L.） 為茄科（Solanaceae）茄屬（Solanum）中以漿果為產(chǎn)品的一年或多年生草本植物，起源于亞洲南部熱帶地區(qū)，古印度為其最早馴化地[4]，中國栽培茄子歷史悠久，是茄子第二起源地，擁有豐富的茄子種質(zhì)資源[5]。茄子是世界上第四大蔬菜作物，我國是世界上最大的茄子生產(chǎn)國，占世界總面積的49.16%[6]。茄子種植區(qū)域廣，種子用量大，但是休眠現(xiàn)象比較普遍[7]。如何快速測定茄子種子生活力，確定茄子種子最大發(fā)芽潛力，評定種子質(zhì)量，成為當(dāng)前休眠茄子種急需解決的主要問題。《國際種子檢驗規(guī)程》（international rules for seed testing）已列入農(nóng)業(yè)、園藝和林木的部分種子種類和應(yīng)用范圍內(nèi)各類種子的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[3]，但迄今為止工作比較集中于木本植物及大田作物種子，如水稻[8]、小麥[9]、玉米[10]等。蔬菜種子生活力測定方法的研究極少，僅在番茄[11]、苦瓜[12]、冬瓜[13]等方面有報道。目前，除番茄屬作物外，其他蔬菜種子尚未列入《國際種子檢驗規(guī)程》。我國《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》和《國際種子檢驗規(guī)程》中均未對茄子種子的TTC染色進(jìn)行詳細(xì)描述，茄子種子生活力的具體鑒定標(biāo)準(zhǔn)和茄子種子四唑染色圖譜尚未見報道。試驗以京茄218茄子種子為材料，研究比較TTC法快速測定茄子種子生活力的適宜條件，快速預(yù)測茄子種子最大發(fā)芽潛力，以解決茄子種子質(zhì)量的快速評價和設(shè)定田間播種量等生產(chǎn)實際問題，為茄子種子生產(chǎn)和銷售提供參考依據(jù)，為茄子種子生活力TTC測定法早日列入我國的《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》和《國際種子檢驗規(guī)程》奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1種子材料試驗所用種子為京茄218茄子種子，2014年9月新采收，由北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心提供。

1.1.2試驗儀器和藥品試驗儀器有發(fā)芽箱、發(fā)芽盒（透光）、恒溫箱（20、30、35 ℃）、培養(yǎng)皿、鑷子、解剖刀、解剖針、標(biāo)簽紙、濾紙、量筒、燒杯、容量瓶（100 mL）、棕色瓶、體式顯微鏡（Leica Microsystems Ltd.）等。試驗藥品有四唑（2，3，5-tripheny tetrazolium chloride）粉劑，由日本東京化成工業(yè)株式會社（Tokyo Chemical Industry，TCI）生產(chǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1發(fā)芽試驗對供試京茄218茄子種子經(jīng)凈度分析后，隨機(jī)選取每重復(fù)100粒種子，4次重復(fù)，在發(fā)芽箱內(nèi)（20 ℃、16 h 黑暗；30 ℃、8 h光照）進(jìn)行紙上發(fā)芽試驗，7 d初數(shù)，14 d終數(shù)，統(tǒng)計發(fā)芽率。

1.2.2適宜浸種溫度、時間的探究對供試種子經(jīng)凈度分析后，每次隨機(jī)數(shù)取100粒種子在20 ℃浸種18 h；30 ℃浸種4 h，取出各組種子同一操作者相同方法人工剝皮，分別計時，最終找出最適宜剝皮的一組，其溫度、時間即為適宜的浸種溫度、時間（以單位時間內(nèi)剝皮的種子數(shù)或剝皮一定的種子數(shù)所用的時間為標(biāo)準(zhǔn)來判別和找出最適宜剝皮的那組），試驗設(shè)4次重復(fù)。

1.2.3TTC溶液配制磷酸緩沖液配制[14]：母液Ⅰ，稱取9.078 g KH2PO4溶于1 000 mL蒸餾水中；母液Ⅱ，稱取9.472 g Na2HPO4或11.876 g Na2HPO4·2H2O溶于1 000 mL蒸餾水中。然后取母液Ⅰ2份和母液Ⅱ3份混合均勻，測pH值介于6.5～7.5之間，即成緩沖液。在該緩沖液中溶解準(zhǔn)確數(shù)量的四唑鹽類，以獲得準(zhǔn)確的濃度。

不同濃度TTC溶液配制[14]：1%濃度的TTC溶液，稱取1 g 四唑粉劑溶解于100 mL磷酸緩沖液中即可。0.2%濃度的TTC溶液：量取1份配好的1%濃度的TTC溶液加入4份磷酸緩沖液混合均勻可得。

四唑溶液必須完全淹沒種子，溶液須貯存在黑暗處或棕色瓶里，不能直接露光，因為光線可能使四唑鹽類還原而降低其濃度，影響染色效果。

1.2.4TTC染色和觀察鑒定在“1.2.2”節(jié)得出最適宜浸種溫度、時間的條件下，對供試種子進(jìn)行預(yù)濕處理。每次隨機(jī)選取100粒預(yù)濕種子迅速剝皮后，分別選用0.2%、1%2種濃度的四唑染色液，在30、35 ℃恒溫條件下染色不同時間（1、18、36 h），4次重復(fù)。

染色結(jié)束后，觀察種子染色情況并記錄著色種子數(shù)目，對染色種子數(shù)超過50%的處理組合的著色種子進(jìn)行縱切，在體視顯微鏡下觀察種子切面的染色效果，區(qū)分種子胚各部分的著色情況，并采集圖片，統(tǒng)計生活力指標(biāo)。種子經(jīng)染色和處理后，進(jìn)行正確的觀察鑒定十分重要。一般鑒定原則是，凡是胚的主要構(gòu)造及有關(guān)活營養(yǎng)組織染成有光澤的鮮紅色，且組織狀態(tài)正常的，為有生活力種子；凡是胚的主要構(gòu)造局部不染色或染成異常的顏色和光澤，并且活營養(yǎng)組織不染色部分已超過1/2，或超過容許范圍，以及組織軟化的，完全不染色或染成無光澤的淡紅色或灰白色，且組織已軟化腐爛或異常、蟲蛀、損傷的均為無生活力種子[14]。

2結(jié)果與分析

2.1計算發(fā)芽率

發(fā)芽試驗結(jié)束后，觀察統(tǒng)計4次重復(fù)種子發(fā)芽的數(shù)目分別為94、96、93、95粒，計算發(fā)芽率，

發(fā)芽率=（94+96+93+95）/400×100%=95%。

2.2適宜浸種溫度、時間的確定

在不同浸種溫度、不同浸種時間條件下，剝皮100粒種子所需時間如表1所示。

由表1可以看出，當(dāng)溫度一定時，浸種時間越長，剝皮所用的時間越短，說明種皮越容易剝?nèi)?；?dāng)浸種時間相同時，30 ℃ 浸種剝?nèi)シN皮所需時間明顯少于20 ℃；當(dāng)浸種溫度為30 ℃時，浸種4、11、18 h剝?nèi)シN皮所需時間相差不大，說明浸種溫度對種皮的影響要大于浸種時間對種皮的影響。考慮到試驗周期等因素的影響，選擇20 ℃、18 h和 30 ℃、4 h為適宜的浸種溫度和時間組合。

2.3TTC法測定京茄218茄子種子生活力

不同浸種溫度、時間組合，不同的染色液濃度、染色溫度、染色時間條件下，京茄218茄子種子染色情況如表2所示。

從表2中各處理組合著色種子數(shù)目及方差分析結(jié)果可以看出，當(dāng)染色時間為1 h（見處理組合1、4、7、10、13、16、19、22），京茄218茄子種子的染色效果很差，多數(shù)種子都沒有著色，只有少數(shù)種子有輕微的著色。

當(dāng)浸種溫度為20 ℃、浸種時間為18 h，染色溫度相同（30 ℃）時，隨染色時間延長，種子染色效果增強(qiáng)，著色種子數(shù)目增多，且在染色液濃度較低（0.2%）時，達(dá)到了極顯著性差異；而在染色溫度（35 ℃）較高時卻發(fā)現(xiàn)，在較高染色液（1%）濃度下，染色時間為36 h的處理組合12染色效果不及染色時間為18 h的處理組合11，著色種子數(shù)目反而減少，但沒有出現(xiàn)極顯著性差異 。對應(yīng)比較處理組合5、6和處理組合2、3以及處理組合11、12和處理組合8、9可以發(fā)現(xiàn)，在染色溫度相同時，染色液濃度（1%）較高，種子染色效果增強(qiáng)，著色種子數(shù)目增多且達(dá)到了極顯著性差異（處理組合12例外，同處理組合9相比，處理組合12著色種子數(shù)目減少但沒有出現(xiàn)極顯著性差異）。對應(yīng)比較處理組合8、9和處理組合2、3以及處理組合11、12和處理組合5、6可以發(fā)現(xiàn)，在染色液濃度相同時，染色溫度（35 ℃）較高有利于種子著色，著色種子數(shù)目增多（處理組合12和處理組合6著色種子數(shù)目相同），其中在染色液濃度較低（0.2%）時，達(dá)到了極顯著性差異。

當(dāng)浸種溫度為30 ℃、浸種時間為4 h，染色溫度（30 ℃）較低時，隨染色時間延長，種子染色效果增強(qiáng)，著色種子數(shù)目增多，其中在染色液濃度較低（0.2%）時，達(dá)到極顯著性差異；而在染色溫度（35 ℃）較高時卻發(fā)現(xiàn)，在較高染色液（1%）濃度時，染色時間為36 h的處理組合24染色效果不及染色時間為18 h的處理組合23，著色種子數(shù)目減少，且達(dá)到了極顯著性差異。對應(yīng)比較處理組合17、18和處理組合14、15以及處理組合23、24和處理組合20、21可以發(fā)現(xiàn)，在染色溫度相同時，染色液濃度（1%）較高，種子染色效果增強(qiáng)，著色種子數(shù)目增多且達(dá)到極顯著性差異（處理組合24例外，同處理組合21相比，處理組合24著色種子數(shù)目減少但沒有出現(xiàn)極顯著性差異）；對應(yīng)比較處理組合20、21和處理組合14、15以及處理組合23、24和處理組合17、18可以發(fā)現(xiàn)，在染色液濃度相同時，染色溫度（35 ℃）較高有利于種子著色，著色種子數(shù)目增多且達(dá)到了極顯著性差異（處理組合24 例外，同處理組合18相比，處理組合24著色種子數(shù)目減少但沒有出現(xiàn)極顯著性差異）。說明在染色液濃度（1%）較高、染色溫度（35 ℃）也較高時，染色時間（36 h）過長反而不利于種子著色，著色種子數(shù)目有減少的趨勢，染色效果有所下降。

2.4著色種子縱切，顯微鏡下觀察種子切面染色效果

試驗過程中因為處理組合1、4、7、10、13、16、19、22著色種子數(shù)目沒有超過50粒，故沒有進(jìn)行著色種子縱切在體式顯微鏡下觀察種子切面的染色效果，其余各處理組合均進(jìn)行了著色種子縱切在體式顯微鏡下觀察種子切面的染色效果并采集圖像（圖1為有代表性且較為清晰的部分采集圖片）。

處理組合9、11、12、15、23、24所采集的圖片較為清晰。再結(jié)合“2.3”表2中各處理組合著色種子數(shù)目及方差分析結(jié)果，處理組合15、24著色種子數(shù)目分別為（84±4）、（89±1）粒，均沒有反映出供試材料的實際生活力情況（見“2.1”節(jié)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗結(jié)果芽率為95%），故處理組合15、24均不適于京茄218茄子種子的生活力測定。處理組合9、11、12、23，著色種子數(shù)目分別為（95±1）、（97±2）、（94±2）、（97±1）粒，沒有出現(xiàn)極顯著性差異且均能反映出供試材料的實際生活力情況?？紤]到染色時間對試驗周期的影響，處理組合9、12染色時間均為36 h，處理組合11、23染色時間均為18 h，故選擇處理組合11、23作為測定京茄218茄子種子生活力的理想處理組合。

3結(jié)論與討論

由標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗發(fā)芽率計算結(jié)果可得供試京茄218茄子種子的發(fā)芽率為95%。染色時間1 h過短，不適于京茄218茄子種子的生活力測定。這很可能是由于染色時間過短，活種子呼吸過程中脫氫酶產(chǎn)生的[H]非常有限，來不及與四唑染色液充分反應(yīng)造成的。染色液濃度（1%）較高、染色溫度（35 ℃）較高、染色時間延長，均有利于京茄218茄子種子的生活力測定。但在較高的染色液濃度（1%）時，染色溫度（35 ℃）較高，同時染色時間（36 h）過長，京茄218茄子種子的染色效果反而出現(xiàn)下降，這可能是因為種子長時間處于較高的染色溫度條件下，內(nèi)部某些物質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到了破壞，導(dǎo)致種子生活力下降而引起的。通過“2.4”節(jié)部分的綜合分析，可見處理組合11（浸種溫度20 ℃、浸種時間18 h、染色液濃度1%、染色溫度35 ℃、染色時間18 h）和處理組合23（浸種溫度30 ℃、浸種時間4 h、染色液濃度1%、染色溫度35 ℃、染色時間18 h）為較理想的處理組合，為TTC法快速測定京茄218茄子種子生活力的適宜方法。試驗中普遍存在的問題是種子著色深淺程度不均勻，有些種子著色太淺，不能清晰地觀察種子胚各部分的染色情況；有些種子著色又太深，種子部分甚至全部染成深褐色，也無法準(zhǔn)確判斷種子胚各部分的生活力情況。這可能與種子本身的生活力強(qiáng)弱程度、染色液濃度及染色時間等因素有關(guān)。

本試驗為探究性試驗，得出的結(jié)論是在試驗設(shè)計的各種不同處理組合條件下最為理想的處理組合， 有較強(qiáng)的說服力和科學(xué)性。但若想獲得TTC法快速測定茄子種子生活力更加適宜的方法，需要設(shè)計更多的不同影響因素之間的處理組合，如增加不同浸種溫度、時間組合；設(shè)計更多的染色液濃度梯度；增加更多的不同染色時間及染色溫度的處理組合，并選用不同的茄子品種等。

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