湖南省柑橘潰瘍病菌gyrB和16S rRNA的擴(kuò)增和序列分析

摘要：為了解湖南省不同地區(qū)柑橘潰瘍病菌遺傳多樣性，從湖南省黔陽、祁陽、衡山、道縣、茶陵、永興、沅江、零陵8個柑橘主產(chǎn)區(qū)采集樣本，分離病原菌，PCR擴(kuò)增其gyrB基因和16S rRNA序列，陽性樣品送樣測序。利用生物信息學(xué)軟件，將測序結(jié)果與GenBank中柑橘潰瘍病菌相近的黃單胞桿菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，對比2個不同序列擴(kuò)增的分辨率。結(jié)果表明，gyrB基因比16S rRNA序列分辨率高；利用gyrB基因除了能分析親緣較近的外源菌株，還能對同屬但是生長地區(qū)有異的菌株進(jìn)行更深入的區(qū)分。

關(guān)鍵詞：柑橘潰瘍?。贿z傳多樣性；gyrB基因；16S rRNA

中圖分類號： S436.661.1+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0076-03

1912年首次在美國發(fā)現(xiàn)[1]，中國相關(guān)最早的報道出現(xiàn)在1918年[2]。至今全球已有30多個國家和地區(qū)報道發(fā)現(xiàn)了該病害，占世界柑橘種植國家和地區(qū)的50%以上[3-4]。柑橘潰瘍病對我國柑橘產(chǎn)業(yè)有較大影響，不僅降低了全國柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)，還制約了我國柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]；其中發(fā)病嚴(yán)重的地區(qū)包括湖南、福建、廣東、廣西等。柑橘潰瘍病是一種細(xì)菌性病害，病原菌為地毯草黃單胞柑橘致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. citri），病菌主要通過自然孔口和傷口感染健康植株。該病菌在葉、枝梢及果實的病斑中越冬，翌年春條件適宜時從病部溢出，借風(fēng)雨、昆蟲傳播，經(jīng)寄主的氣孔、皮孔和傷口侵入，使葉片、嫩梢和果實發(fā)病[6]。葉片受害，開始在葉背產(chǎn)生針頭大小的黃色、油漬狀小點，后逐漸擴(kuò)大。同時，在葉片正反兩面逐漸隆起成圓形病斑，病部表皮破裂，病斑木栓化如海綿狀，表面粗糙，灰褐色。其后中央凹陷并有細(xì)微輪紋，周圍有黃色暈圈，在暈圈的內(nèi)側(cè)常有褐色釉光邊緣，后期病斑中心開裂并且凹陷，呈火山口狀。柑橘潰瘍病自然條件下傳播距離較近，主要途徑是風(fēng)雨、蟲害和農(nóng)作時造成的傷口以及植株間摩擦等[7]。

rRNA是細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)研究中最常用的“分子鐘”，其種類少，含量大，可占到細(xì)菌RNA總量的80%[8]。由于其大小適中且保守性很好，所以廣泛應(yīng)用于物種間的遺傳分化距離和親緣關(guān)系的研究中。16S rRNA是一種常用核糖體RNA，其高度的保守性[9]使之成為分子生物學(xué)研究的一個熱點。

促旋酶（gyrase）B亞單位基因簡稱為gyrB，是一種細(xì)菌共有的蛋白質(zhì)編碼基因[10]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，gyrB基因序列擴(kuò)增技術(shù)在細(xì)菌親緣關(guān)系及系統(tǒng)發(fā)育研究中的作用越來越明顯[11]，可以用其作為分子標(biāo)記來研究細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育水平，還可區(qū)分近源種和菌株。已知的gyrB序列，包括其相關(guān)產(chǎn)物的gyrB數(shù)據(jù)被存放于由日本建立的ICB[12]數(shù)據(jù)庫中，用于細(xì)菌分類鑒定方面的研究和細(xì)菌親緣種的鑒定。Dauga等研究表明，比較腸桿菌科（Enterobacteriaceae）不同屬的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系時，gyrB基因比16S rRNA更加適用于種屬內(nèi)或種屬間的精確遺傳距離分析和發(fā)育關(guān)系比較[13] 。

中國柑橘潰瘍病研究表明，部分地區(qū)的菌種中仍然存在更細(xì)致的分化[14]，本研究采集湖南省主要柑橘產(chǎn)區(qū)的柑橘潰瘍病樣本，分離致病菌進(jìn)行純化培養(yǎng)及致病性檢測，提取病原菌DNA選取多種引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終選出自行設(shè)計的gyrB基因片段的特異性引物[15]和16S rRNA引物[16]來分析湖南柑橘潰瘍病的遺傳多樣性。

1材料與方法

1.1材料

供試材料取自于湖南省黔陽、祁陽、衡山、道縣、茶陵、永興、沅江、零陵等地的柑橘主要種植區(qū)，大部分為葉片，少部分為發(fā)病果實。采用的致病菌標(biāo)準(zhǔn)菌由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家柑橘改良中心長沙分中心提供。

1.2方法

1.2.1柑橘潰瘍病菌分離、鑒定按稀釋分離法對采集的柑橘潰瘍病樣本進(jìn)行病原菌分離[17]，得到的病原物經(jīng)JYF5/JYR5引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、驗證。JYF5/JYR5引物序列為：JYF5：5′-TTCGGCGTCAACAACCTG-3′，JYR5：5′-AACTCCAGCACATACGGGTC-3′，目標(biāo)片段長度在410左右，基本都擴(kuò)增到了目標(biāo)條帶，從 8個地區(qū)的樣品中經(jīng)過分離和鑒定共獲得了22個病原菌的菌株。

1.2.2gyrB引物gyrB序列引物是通過Primer Premier 5.0軟件[18]設(shè)計的引物GGS1F/GGS2R，其序列為GGS1F：5′-CCCTGCTGCTGACCTTCTTCT-3′和GGS2R：5′-GGTTGACCGTGG TTTCCCATA-3′。反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃ 4 min；變性95 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；延伸72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

1.2.316S rRNA序列16S rRNA序列的引物為27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1492R：′-TACGGHTACCTT ACGACTT-3′。 反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃ 4 min；變性 95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；延伸72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

1.2.4序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建gyrB及16S rRNA序列引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工測序，測序結(jié)果用軟件MEGA 4.0的非加權(quán)平均數(shù)聚類法（Unweighted Pair Group Method with Arithmatic mean，UPGMA）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1gyrB引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果

通過GGS1F/GGS2R引物對22個已經(jīng)鑒定的柑橘潰瘍病病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目標(biāo)片段的大小約為760 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果見圖1。

2.216S rRNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

16S rRNA序列引物PCR擴(kuò)增22個經(jīng)過鑒定的菌株，目標(biāo)片段的大小約為1.5 ku，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果見圖2。

2.3構(gòu)建gyrB和16SrRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3.1gyrB序列系統(tǒng)發(fā)育樹gyrB序列引物擴(kuò)增產(chǎn)物序列建樹結(jié)果（圖3）表明，不同地區(qū)的病原菌樣品間的遺傳距離比較明顯。在遺傳距離大于0.18時22個供試菌株為同一簇，當(dāng)遺傳距離為0.055時，所有的菌株可以分成7個不同的簇，其分布情況基本與菌株采樣地點在湖南省的地理位置相關(guān)。

2.3.216S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹16S rRNA 引物擴(kuò)增產(chǎn)物序列建樹結(jié)果（圖4）表明，所采用的菌株樣品之間的遺傳距離非常小。遺傳距離為0.0046左右時，所有的菌株一共可以分為3個不同的簇，其分布規(guī)律基本與地域的差距有很大關(guān)系。

3討論

通過16S rRNA及gyrB序列引物PCR擴(kuò)增結(jié)果建樹可以明顯看到湖南省中部、東部及北部部分樣品，西部和部分北部樣品，南部、部分西部樣品分成了3個遺傳距離相對大一點的3部分。其分布與病原菌來源地的位置有著較大聯(lián)系，而且寄主植物差異也是造成遺傳差距的主要因素之一，且gyrB基因序列分辨率要明顯高于16S rRNA序列。16S rRNA序列分析僅能在屬的水平區(qū)分這些菌株，gyrB序列分析還可將區(qū)分程度擴(kuò)展到屬內(nèi)小種。

16S rRNA序列在目前使用比較廣泛，但其不足之處也逐漸顯露。16S rRNA基因序列相比gyrB基因序列所攜帶的信息量多，長度適中，但其分辨率較低。gyrB引物擴(kuò)增序列在菌株分類程度上有了進(jìn)一步的提高，在湖南省柑橘潰瘍病的小種分析中g(shù)yrB基因序列的分辨率較前者高，效果比較好；但是由于gyrB基因的序列較短，鑒定細(xì)菌的準(zhǔn)確度依然不夠。目前，gyrB基因序列在分子生物學(xué)中應(yīng)用不多，還需要進(jìn)一步開發(fā)利用。

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