谷子EPSPS基因的分離、修飾及表達(dá)載體的構(gòu)建

段明

摘要：5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）是植物莽草酸合成途徑中的一個(gè)重要酶，與芳香族氨基酸及其次生代謝物的合成有關(guān)。利用RT-PCR方法，從谷子中分離到5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因SiEPSPS，全長1 573 bp，開放閱讀框1 536 bp，編碼511個(gè)氨基酸。同源序列比較發(fā)現(xiàn)，SiEPSPS氨基酸序列與小麥、短柄草、高粱的EPSPS序列高度同源。結(jié)構(gòu)同源性分析表明，SiEPSPS與其他植物一樣，均具有2個(gè)序列保守的結(jié)構(gòu)域。對其啟動子序列分析顯示，該片段富含ABRE、TC-rich repeats、TCA-element等響應(yīng)脅迫的順式作用元件。針對草甘膦結(jié)合位點(diǎn)，對SiEPSPS基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾。為研究其功能，構(gòu)建植物表達(dá)載體pWM101-EPSPS，并導(dǎo)入農(nóng)桿菌進(jìn)行檢測。測序結(jié)果比對表明，突變型EPSPS基因在173位的脯氨酸變?yōu)榻z氨酸，為后續(xù)EPSPS的真核表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：谷子；草甘膦；EPSPS基因；表達(dá)載體

中圖分類號： Q78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0051-05

谷子（Setaria italic）屬禾本科狗尾草屬，在我國有數(shù)千年的栽培歷史，全國各地均有種植，是我國北方的主要糧食作物之一。谷子具有營養(yǎng)豐富、耐旱耐瘠、糧草兼用等特點(diǎn)，深受人們的喜愛。然而，雜草已成為谷子生產(chǎn)中主要的障礙因素之一，影響農(nóng)作物對陽光和養(yǎng)分的吸收。目前，化學(xué)除草已成為主要的除草手段，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。草甘膦（Glyphosate）的學(xué)名為N-（膦羧甲基）甘氨酸，是全球使用最廣泛的一種除草劑[1]。起初，草甘膦因其非選擇性的特點(diǎn)而被用作非農(nóng)田區(qū)域的除草劑；20世紀(jì)90年代，抗草甘膦作物開始大面積種植，至2012年種植面積已達(dá)1.2億hm2?？共莞熟⑸锕こ滩粌H對全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大貢獻(xiàn)，并在一定程度上減輕了機(jī)械除草對環(huán)境的負(fù)面影響[2-4]。

5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS，EC2.5.1.19）是莽草酸途徑中的第6個(gè)酶，在芳香族氨基酸和次生代謝物的合成中發(fā)揮著重要作用[5]。草甘膦與EPSPS的底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）結(jié)構(gòu)相似，在莽草酸途徑中能與PEP發(fā)生競爭作用，特異性地結(jié)合到EPSPS的活性位點(diǎn)，而不與莽草酸-3-磷酸（S3P）發(fā)生競爭，生成EPSPS-S3P-草甘膦三元復(fù)合物，從而抑制EPSPS的活性[6]。目前，全世界80%的抗草甘膦作物品種均與EPSPS有關(guān)，EPSPS基因已被廣泛應(yīng)用于抗草甘膦農(nóng)業(yè)生物工程的研究，包括在野生型植株中過量表達(dá)EPSPS基因，以及對EPSPS基因進(jìn)行突變使其對草甘膦具有抗性[7-9]。

基于EPSPS在抗除草劑方面的重要性，學(xué)者針對EPSPS的酶學(xué)特性及草甘膦抑制機(jī)理進(jìn)行了大量研究，目前已從細(xì)菌、藻類、植物中分離到了EPSPS基因并應(yīng)用于生產(chǎn)[10-13]。對農(nóng)桿菌、大腸桿菌、分枝桿菌、肺炎鏈球菌中EPSPS的晶體結(jié)構(gòu)分析表明，它們均包括2個(gè)相似的結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域由3個(gè)亞單位組成，3個(gè)亞單位由4個(gè)β折疊、2個(gè)α螺旋組成。在沒有結(jié)合底物或配體時(shí)，EPSPS的2個(gè)結(jié)構(gòu)域是分開的；當(dāng)有配體存在時(shí)，2個(gè)結(jié)構(gòu)域會結(jié)合在一起形成活性中心，可能是因?yàn)榕潴w的結(jié)合促使EPSPS構(gòu)象發(fā)生改變[14]。

自然界中的EPSPS主要分為2類，即Class Ⅰ和Class Ⅱ。Class Ⅰ存在于所有植物以及大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌等部分細(xì)菌中，對草甘膦敏感。在高等植物中，EPSPS主要定位在葉綠體，它含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（chloroplast transit peptide，CTP），可將外源蛋白定位到葉綠體中；因此，EPSPS只有在葉綠體中與其他莽草酸途徑的成員共同作用才能合成芳香族氨基酸。Class Ⅱ存在于假單胞菌PG2982、農(nóng)桿菌CP4等對草甘膦具有抗性的細(xì)菌中。序列比對發(fā)現(xiàn)，2類EPSPS的氨基酸同源性低于50%[15]。目前針對抗草甘膦基因的研究主要集中于雜草和細(xì)菌，關(guān)于農(nóng)田作物的研究較少，且原核生物與真核生物在基因表達(dá)調(diào)控方面存在顯著差異，真核生物的調(diào)控機(jī)制更為復(fù)雜。發(fā)掘和改良植物特別是農(nóng)作物中的抗草甘膦基因顯得尤為重要。

目前，使植物對草甘膦產(chǎn)生抗性的機(jī)制主要有以下3種。（1）在植物體內(nèi)引入過量表達(dá)載體，使植物體內(nèi)產(chǎn)生較多 EPSPS。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，在高選擇壓下，牛筋草R3株系中的EPSPS表達(dá)量提高了13.8倍，表現(xiàn)出對草甘膦的抗性[16]。（2）引入能夠降解草甘膦的酶，在除草劑產(chǎn)生作用前將其降解或解毒。如代謝基因GAT編碼草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（NAT），通過乙酰化使草甘膦失活[17]。（3）修飾EPSPS使其對草甘膦不敏感，該方法已成為商業(yè)化應(yīng)用的主要方法。已有研究表明，牛筋草EPSPS氨基酸序列中的脯氨酸位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，會在一定程度上表現(xiàn)出對草甘膦的抗性[18]。由突變而引起對草甘膦產(chǎn)生抗性的機(jī)制，在黑麥草、芒稗等植物中也被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[19]。

本研究利用RT-PCR方法分離谷子EPSPS基因，通過定點(diǎn)突變獲得了突變基因SiEPSPS，并將2個(gè)基因的編碼序列連入表達(dá)載體中，為真核表達(dá)及谷子抗草甘膦的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

選用“豫谷1號”為試驗(yàn)材料，種植于人工氣候室中。pLB零背景快速克隆試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、大腸桿菌DH5α均購自天根生化科技（北京）有限公司，植物表達(dá)載體pWM101、農(nóng)桿菌菌種均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。高保真PCR酶-KOD-Plus購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ、Xba Ⅰ以及T4DNA連接酶均購自NEB（北京）有限公司。PCR引物均由上海生工生物有限公司合成。

1.2方法

1.2.1SiEPSPS基因的克隆根據(jù)數(shù)據(jù)庫已公布的谷子EPSPS基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物序列如下：SiEPSPS-F：5′-GGTACCATGGCGGCCATGGCGTCC-3′；SiEPSPS-R：5′-TCTAGAATCACTTCAACATGGCCTGGT-3′。

PCR總體系為25 μL，包括10×PCR buffer 2.5 μL、dNTP 2.5 μL、cDNA模板2 μL、MgCL2 1 μL、引物F及引物R各 1.5 μL、Taq酶2 μL、ddH2O 12 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，68 ℃延伸1.5 min，68 ℃后延伸 10 min，35個(gè)循環(huán)。

1.2.2基因的定點(diǎn)突變以質(zhì)粒pLB-EPSPS為模板，采用重疊延伸PCR法突變SiEPSPS基因的第517位，由C突變?yōu)門，其蛋白序列第173位由Pro突變?yōu)镾er。重疊延伸PCR法所用引物如下：Siepsps-F：5′-TGGAACAGCGATGCGGTCGTTGACAGCAGCCGT-3′；Siepsps-R：5′-ACGGCTGCTGTCAACGACCGCATCGCTGTTCCA-3′。

1.2.3植物表達(dá)載體的構(gòu)建提取測序正確的pLB-EPSPS載體質(zhì)粒，用Kpn Ⅰ、Xba Ⅰ雙酶切質(zhì)粒pLB-EPSPS，回收EPSPS片段；同樣用Kpn Ⅰ、Xba Ⅰ雙酶切質(zhì)粒pWM-EPSPS，回收載體片段。采用T4DNA連接酶將目的基因與載體以體積比約2 ∶1進(jìn)行接連，并用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α。在含有50 μg/mL Kan 的LB培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化菌落，提取質(zhì)粒采用Kpn Ⅰ、Xba Ⅰ雙酶切鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1谷子EPSPS基因的分離及氨基酸序列分析

采用RNA提取試劑盒從谷子葉片中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中已公布的序列設(shè)計(jì)特異性引物SiEPSPS-F和SiEPSPS-R，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，電泳檢測擴(kuò)增出1條長度約為1 573 bp的條帶（圖1-a）。

將擴(kuò)增得到的目的基因與克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，得到與PCR產(chǎn)物大小相同的目的條帶（圖1-b）。送樣測序并對序列進(jìn)行Blast分析，證明分離得到的片段是SiEPSPS基因全長（GenBank注冊號：XM_004964389.1）。

由SiEPSPS的序列分析可知，基因全長為1 573 bp，開放

閱讀框1 536 bp，3′端非編碼區(qū)37 bp，編碼1個(gè)含511個(gè)氨基酸的蛋白。將該基因編碼的氨基酸序列與GenBank中所有氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，谷子的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶與黑麥草、小麥、短柄草、高粱等植物的EPSPS高度同源（圖2），表明成功克隆到了谷子5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因的序列。

系統(tǒng)發(fā)育樹由MEGA 5分析軟件完成，5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶的來源如下。谷子：SiEPSPS（XM_004964389.1），Setaria italica；多花黑麥草：LmEPSPS（AAZ79230.2），Lolium multiflorum；短柄草：BdEPSPS（XP_003557242.1），Brachypodium distachyon；野生稻：ObEPSPS（XP_006656606.1），Oryza brachyantha；小麥：TaEPSPS（ACH72672.1），Triticum aestivum；高粱：SbEPSPS（XP_002436424.1），Sorghum bicolor；牛筋草：EiEPSPS（CAD01096.1），Eleusine indica；玉米：ZmEPSPS（CAA44974.1），Zea mays；石茅：ShEPSPS（AEP26124.1），Sorghum halepense；芭蕉：MaEPSPS（CAA44974.1），Musa acuminata AAA Group；芭蕉：ZmEPSPS（XP_009418331.1），Musa acuminata AAA Group。

與其他植物中EPSPS所編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)SiEPSPS基因所編碼的氨基酸與其他已知EPSPS所編碼的氨基酸序列同源性較高，且有2個(gè)序列保守區(qū)域（conserved site Ⅰ、conserved site Ⅱ）。其中，conserved site Ⅰ是該酶的激活位點(diǎn)，同時(shí)是該酶與除草劑草甘膦的結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。

2.2谷子EPSPS基因的定點(diǎn)突變

將擴(kuò)增得到的基因片段連接到pLB載體，測序正確后將質(zhì)粒命名為pLB-SiEPSPS（圖1-b）。根據(jù)序列比對找到谷子中EPSPS的保守位點(diǎn)。谷子EPSPS（SiEPSPS）第162～174位之間的氨基酸序列是草甘膦的結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)相關(guān)研究推測第173位脯氨酸（Pro）是重要位點(diǎn)之一，設(shè)計(jì)引物將此位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行突變。以質(zhì)粒pLB-SiEPSPS為模板，采用重疊延伸PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，以前2次的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第3次PCR，獲得突變后的目的DNA片段。送樣測序，獲得重組突變質(zhì)粒pLB-Siepsps（圖4）。突變后的Siepsps基因編碼的蛋白有1個(gè)氨基酸發(fā)生變化，即173位脯氨酸（Pro）變?yōu)榻z氨酸（Ser）（圖5）。

2.3谷子EPSPS基因啟動子的生物信息學(xué)分析

由表1可知，SiEPSPS啟動子中含有多個(gè)參與響應(yīng)激素和逆境脅迫的應(yīng)答元件，如參與干旱脅迫的MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（MYB binding site，MBS）、ABA響應(yīng)元件（ABA-responsive element，ABRE）、赤霉素響應(yīng)元件（gibberellin-responsive element，P-box）、生長素響應(yīng)元件（auxin-responsive element，TGA）、生理節(jié)奏控制元件（involved in circadian control，circadian）等。

2.4植物表達(dá)載體pWM-EPSPS的構(gòu)建

為轉(zhuǎn)化植物構(gòu)建真核表達(dá)載體。將EPSPS、epsps與克隆載體相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒。分別采用限制性內(nèi)切酶將克隆載體和表達(dá)載體雙酶切，回收后將含有EPSPS、epsps基因編碼區(qū)插入表達(dá)載體pWM，構(gòu)成過表達(dá)、定點(diǎn)突變表達(dá)載體，分別命名為pWM-EPSPS、pWM-epsps（圖3）。酶切鑒定表明，2種表達(dá)載體已構(gòu)建成功（圖6）。

2.5重組表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌

將植物表達(dá)載體pWM-EPSPS、pWM-epsps轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑選克隆并進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，獲得1.5 kb的預(yù)期片段（圖7），表明表達(dá)載體已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。

3結(jié)論與討論

草甘膦是一種環(huán)境友好、無污染、高效的除草劑，對雜草具有極強(qiáng)的清除能力，自問世以來已在中國使用了30余年[20-21]。然而，長期施用草甘膦必將導(dǎo)致一些抗性雜草的產(chǎn)生。EPSPS 保守區(qū)中脯氨酸（Pro）位點(diǎn)的突變是雜草獲得抗性的一個(gè)重要機(jī)制。迄今為止，抗草甘膦雜草中EPSPS基因的突變主要涉及到106位脯氨酸突變?yōu)楸彼?、亮氨酸，以及親水性氨基酸絲氨酸、蘇氨酸。此外，有學(xué)者通過定向誘變技術(shù)改造EPSPS，產(chǎn)生雙位點(diǎn)突變的EPSPS，使玉米和油菜獲得抗性[22-24]。Yu等研究發(fā)現(xiàn)，在具有草甘膦抗性的牛筋草中，其體內(nèi)EPSPS的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔彼嵬蛔優(yōu)榻z氨酸[25]。與單一位點(diǎn)突變相比，EPSPS雙位點(diǎn)突變能夠賦予植物對草甘膦更強(qiáng)的抗性。Pro單個(gè)位點(diǎn)的突變僅輕微影響了EPSPS對草甘膦/烯醇式丙酮酸的結(jié)合能力，賦予植物草甘膦抗性的同時(shí)又不影響EPSPS正常的生物學(xué)功能。與此相比，雙位點(diǎn)突變在獲得較高抗性的同時(shí)，導(dǎo)致EPSPS對草甘膦/烯醇式丙酮酸的結(jié)合能力較大程度降低，使莽草酸途徑受阻，最終抑制植物體內(nèi)芳香族氨基酸的合成，對植物的生長發(fā)育等代謝過程產(chǎn)生影響。綜合考慮，單一位點(diǎn)突變在抗草甘膦的研究與應(yīng)用中更具優(yōu)勢。

本研究采用RT-PCR和定點(diǎn)突變技術(shù)分別獲得全長1 573 bp 的EPSPS和epsps基因，該序列開放閱讀框1 536 bp，編碼511個(gè)EPSPS前體多肽。經(jīng)ChloroP 1.1 Server軟件在線預(yù)測，前體多肽中含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，可將EPSPS蛋白定位到葉綠體中行使功能。啟動子元件分析表明，EPSPS含有多個(gè)與光響應(yīng)的元件，這與EPSPS的定位相符合。而對草甘膦具有抗性的EPSPS基因大多來源于不具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的細(xì)菌，在植物中應(yīng)用須整合外源葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。經(jīng)ProtParam tool軟件預(yù)測，該基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為 51.3 ku，等電點(diǎn)（pI）為8.05。在谷子基因組序列中，SiEPSPS具有8個(gè)外顯子、7個(gè)內(nèi)含子，位于第4號染色體上。進(jìn)化樹分析表明，SiEPSPS與黑麥草、小麥、短柄草、高粱等植物的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶高度同源。SiEPSPS基因具有與其他植物中5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因相同的2個(gè)序列保守區(qū)域，即conserved site Ⅰ、conserved site Ⅱ，分別位于162～174、423～442 bp。conserved site Ⅰ是EPSPS的活性位點(diǎn)，也是草甘膦的作用位點(diǎn)，保守序列為LFLGNAGTAMRPL，該區(qū)域某些位點(diǎn)發(fā)生突變將導(dǎo)致對草甘膦具有抗性；conserved site Ⅱ保守序列為RVKETERMVAIRTELTKLGA，位于EPSPS的C端，含有保守的賴氨酸，對EPSPS的活性具有重要作用。

本研究利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了由CaMV35S啟動子調(diào)控的植物表達(dá)載體pWM-EPSPS、pWM-epsps，并將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，為該基因功能的研究、進(jìn)一步轉(zhuǎn)化谷子、培育抗除草劑谷子新品種提供依據(jù)。

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