抑制ERK1/2通路對(duì)卡鉑誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響*

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科(齊齊哈爾161001)　李興媚　鄭立紅　劉　丹▲　李躍文　梅慶步　董　冰

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抑制ERK1/2通路對(duì)卡鉑誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響*

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科(齊齊哈爾161001)李興媚鄭立紅△劉丹△▲李躍文梅慶步△董冰

摘要目的：探討抑制ERK1/2通路對(duì)卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡作用的影響。方法：采用Hoechst 33258熒光染色法檢測(cè)抑制ERK1/2通路對(duì)卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌HO-8910細(xì)胞凋亡的影響；用分光光度法檢測(cè)卡鉑濃度的增加及抑制ERK1/2通路對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞Caspase-8和Caspase-9活化的影響。結(jié)果：CBP組、PD98059組及聯(lián)用組部分細(xì)胞核呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光的為凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核可見碎塊狀熒光信號(hào)，凋亡指數(shù)CBP組為20.35%，PD98059組為15.21%，聯(lián)用組為29.78%。隨著卡鉑濃度的增加，Caspase-8、Caspase-9活性的改變并不明顯(P>0.05)，而聯(lián)用組的Caspase-8、Caspase-9活性最高，抑制ERK1/2通路可促進(jìn)卡鉑增強(qiáng)Caspase-8、Caspase-9的活性(P<0.01)。結(jié)論：抑制ERK1/2通路可促進(jìn)卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡作用，并與Caspase-8、Caspase-9活化有關(guān)。

主題詞卵巢腫瘤/化學(xué)誘導(dǎo)卵巢腫瘤/預(yù)防和控制卡鉑/治療應(yīng)用有絲分裂素激活蛋白激酶類/代謝半胱氨酸內(nèi)肽酶類/代謝

卵巢癌是女性常見惡性腫瘤之一，因其發(fā)病隱匿，患病早期很難發(fā)現(xiàn)，所以預(yù)后不良。目前針對(duì)卵巢癌的治療手段主要是手術(shù)及以鉑類為基礎(chǔ)的化療相結(jié)合，然而卵巢癌的復(fù)發(fā)率和耐藥率較高，這嚴(yán)重制約患者的預(yù)后。卡鉑(Carboplatin, CBP)是第二代鉑類化合物，為廣譜抗腫瘤藥，在預(yù)防卵巢癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中顯示出良好的應(yīng)用前景。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal regulated protein kinase, ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase, MAPK)的重要成員之一[1]，它也是組成從細(xì)胞膜到細(xì)胞核的細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)之一，可以調(diào)控細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡[2]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)活化是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的中心事件，Caspase-8和Caspase-9作為凋亡始動(dòng)子，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，活化后可激活下游的Caspase，使細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的生化及形態(tài)學(xué)改變[3]。進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)卡鉑的研究，明確ERK1/2通路與腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系，探索其具潛能的腫瘤治療靶點(diǎn)。課題組前期研究結(jié)果顯示：卡鉑通過(guò)抑制ERK1/2激活，增強(qiáng)其抗卵巢癌細(xì)胞增殖作用[4]。本研究探討抑制ERK1/2通路對(duì)卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡作用的影響。

材料與方法

1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系為卵巢癌HO-8910細(xì)胞，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)遺傳學(xué)研究室提供。卡鉑注射液購(gòu)自齊魯制藥(海南)有限公司，規(guī)格10ml: 50mg；PD98059為美國(guó)Promega產(chǎn)品，規(guī)格5mg；優(yōu)級(jí)胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，規(guī)格100ml；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，規(guī)格25g；RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，規(guī)格10×11；Hoechst 33258細(xì)胞凋亡熒光試劑盒(規(guī)格100 assays)、分光光度法檢測(cè)Caspase-8及Caspase-9試劑盒(規(guī)格20assays)購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1卵巢癌HO-8910細(xì)胞的體外培養(yǎng)：細(xì)胞接種于含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2和90% 相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24h換液1次，待細(xì)胞鋪滿瓶底約80%～90%后，用胰蛋白酶消化，以1∶2的比例分瓶傳代，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2.2Hoechst 33258熒光染色法觀察卵巢癌細(xì)胞凋亡：設(shè)4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為空白對(duì)照組、20μmol/L CBP組、50μmol/L PD98059(ERK1/2抑制劑)組、50μmol/L PD98059和20μmol/L CBP的聯(lián)用組，聯(lián)用組先用50μmol/L PD98059作用1h后，再加入20μmol/L CBP。細(xì)胞以1×105個(gè)/孔濃度接種于24孔板，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)24h后，加入上述4組不同的培養(yǎng)液0.5ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用冷Buffer A洗滌細(xì)胞2次，加入1ml 的4%甲醛溶液，4℃固定細(xì)胞10min，再用Buffer A洗滌細(xì)胞2次，最后滴加Hoechst 33258工作液100μl，室溫下染色10min，以紫外光340nm波長(zhǎng)激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并計(jì)算凋亡指數(shù)AI(%)，即：隨機(jī)計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算具備顯著凋亡特征的細(xì)胞核數(shù)量所占的百分比。

2.3檢測(cè)Caspase-8、Caspase-9活性：設(shè)6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為空白對(duì)照組、10μmol/L 的CBP組、20μmol/L 的CBP組、40μmol/L 的CBP組、50μmol/L的PD98059組、50μmol/L PD98059和20μmol/LCBP的聯(lián)用組。①抽提蛋白，細(xì)胞以3×105個(gè)/孔濃度接種在6孔板中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)24h后，加入上述不同濃度梯度的CBP培養(yǎng)液2ml，培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，PBS液洗滌兩次，冰上加入蛋白抽提試劑200μl，小心吹打均勻，裂解40min，4℃ 10,000 rpm 離心2min，小心轉(zhuǎn)移上清液，并記錄各實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)移上清液的體積。②蛋白定量，先將BSA標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白樣品稀釋10倍，各取25μl加入96孔板，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行孔，然后加入BCA工作液200μl混勻，再于37℃避光孵育30min，待冷卻至室溫時(shí)，在自動(dòng)酶標(biāo)儀中檢測(cè)570nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的蛋白濃度，用裂解液調(diào)整樣品蛋白濃度一致為2μg/μl。③檢測(cè)Caspase-8、Caspase-9活性，取50μl (100μg)的細(xì)胞裂解上清，加入50μl 2×Reaction Buffer(使用前每50μl 2×Reaction Buffer加入5μl DTT)，再加入5μl Caspase-8或Caspase-9 Substrate，于37℃避光孵育4h，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)405nm的吸光度值，用藥物組與對(duì)照組的吸光度比值來(lái)表示各藥物組Caspase-8、Caspase-9的活化程度。

結(jié)果

1Caspase-8、Caspase-9活性檢測(cè)結(jié)果所有實(shí)驗(yàn)組之間的Caspase-8、Caspase-9活性變化有顯著性差異(Caspase-8P<0.05；Caspase-9F=17.778，P<0.01)，但隨著卡鉑濃度的增加Caspase-8、Caspase-9活性改變并不明顯(P>0.05)，而聯(lián)用組的Caspase-8、Caspase-9活性最高，抑制ERK1/2通路可促進(jìn)卡鉑增加Caspase-8、Caspase-9活性(P<0.01)，詳見附表。

附表　24h CBP、PD98059單用及聯(lián)用對(duì)Caspase-8、Caspase-9活性的影響

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01；與聯(lián)用組比較, #P<0.05, ##P<0.01

2Hoechst 33258熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡情況CBP組、PD98059組及聯(lián)用組部分細(xì)胞核呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光的為凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核可見碎塊狀熒光信號(hào)，而對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的暗藍(lán)色熒光(見附圖)；凋亡指數(shù)結(jié)果，CBP組為20.35%，PD98059組為15.21%，聯(lián)用組為29.78%。

附圖熒光顯微鏡下CBP、PD98059單用及聯(lián)用誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化(×200；A：對(duì)照組； B：CBP組； C：PD98059組； D：PD98059+CBP組)

討論

在觸發(fā)細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑中，Caspase家族蛋白酶發(fā)揮重要作用。一般情況下，Caspase以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞中，在受到內(nèi)外因素的作用下，產(chǎn)生凋亡信號(hào)，傳至Caspase，引起其活化，Caspase-2、8、9、10等位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，活化后激活下游的Caspase-3、6、7，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，其中Caspase-3起關(guān)鍵作用[5]。而ERK1/2通路與Caspase家族之間的關(guān)系又是怎樣的呢?？Х人岜揭阴?天然藥物)能降低人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞ERK的mRNA和蛋白表達(dá)，增加Caspase-3的mRNA表達(dá)[6]。凝血因子Ⅶa依賴組織因子活化蛋白酶激活受體2，通過(guò)ERK1/2途徑，下調(diào)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞Caspase-3表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[7]。抑制ERK1/2通路活化在抗卵巢癌研究中，取得了一定的成果。抑制ERK1/2可提高卵巢癌HO-8910細(xì)胞的對(duì)化療藥物的敏感性[8]。作者在研究ERK1/2通路對(duì)卡鉑誘導(dǎo)人卵巢癌HO-8910細(xì)胞周期阻滯的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)卡鉑抑制卵巢癌HO-8910細(xì)胞生長(zhǎng)，阻滯其細(xì)胞周期進(jìn)程與過(guò)度活化ERK1/2有關(guān)，應(yīng)用MEK1/2特異性抑制劑PD98059抑制ERK1/2活化，卡鉑的抗增殖作用增強(qiáng)，誘導(dǎo)人卵巢癌HO-8910細(xì)胞S期和G1期阻滯[1]。本研究結(jié)果顯示：抑制ERK1/2通路可促進(jìn)卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡作用，并與Caspase-8、Caspase-9活化有關(guān)?？ㄣK還可增加卵巢癌HO-8910和OVCAR3細(xì)胞凋亡率，并與EphA2蛋白表達(dá)降低有關(guān)[9]?？ㄣK可通過(guò)激活ERK1/2通路而誘導(dǎo)卵巢癌OVCA429細(xì)胞凋亡[10]。抑制ERK1/2信號(hào)通路的激活可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)[11]。PD98059作為ERK1/2通路抑制劑，可以下調(diào)磷酸化ERK1/2的表達(dá)，從而抗卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖；PD98059與順鉑聯(lián)用可使SKOV3細(xì)胞的凋亡率明顯增加，增強(qiáng)順鉑的抗癌作用，提示抑制ERK1/2通路可提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[12]。

值得注意的是：在本研究結(jié)果中隨著卡鉑濃度的增加，Caspase-8、Caspase-9活性改變并不明顯，與卡鉑抗細(xì)胞卵巢癌增殖作用隨其濃度的增加而增強(qiáng)[4]并不一致；聯(lián)用組的Caspase-8、Caspase-9活性最高，抑制ERK1/2通路可明顯促進(jìn)卡鉑增加Caspase-8、Caspase-9活性，提示卡鉑通過(guò)活化Caspase-8和Caspase-9調(diào)控細(xì)胞凋亡與ERK1/2通路關(guān)系密切。另外，熒光染色法顯示卡鉑(20μmol/l)能誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，但其Caspase-8、Caspase-9活性未同步增強(qiáng)，提示卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌HO-8910細(xì)胞凋亡可能與激活Caspase家族中其他凋亡始動(dòng)子有關(guān)，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

鉑類化療藥物通過(guò)激活或抑制ERK1/2通路而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，抑制ERK1/2激活又可進(jìn)一步增強(qiáng)鉑類化療藥物的抗腫瘤作用，臨床上防治卵巢癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移可以考慮聯(lián)合應(yīng)用ERK1/2通路特異性抑制劑，提高腫瘤對(duì)鉑類化療藥物的敏感性，減少其劑量，降低其毒副作用及耐藥性的發(fā)生。

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(收稿：2015-12-10)

通訊作者▲

【中圖分類號(hào)】R737.31

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.05.004

Effects of carboplatin inducing apoptosis in human ovarian cancer cells through inhibiting ERK1/2 pathway

Department of Obstetrics and Gynecology, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University (Qiqihar 161001)Li XingmeiZheng LihongLiu Dan et al

ABSTRACTObjective：To explore the impacts of cell apoptosis treated by carboplatin in ovarian cancer cells through inhibiting ERK1/2 pathway. Methods： Hoechst 33258 assay was used to detect the effects of carboplatin inducing apoptosis in human ovarian cancer HO-8910 Cells through inhibiting ERK1/2 pathway. Spectrophotometry was used to detect the impacts of activation of Caspase-8 and Caspase-9 through increasing the concentration of carboplatin and inhibiting ERK1/2 pathway. Results： The nucleus of all drug groups appeared bright blue fluorescence, they were apoptotic cells. Some nuclei had fragmental fluorescence. Apoptosis index, CBP group was 20.35%, PD98059 group was 15.21%, combined group was 29.78%. The activities of Caspase-8 and Caspase-9 changed were not obvious, with increasing concentrations of carboplatin (P>0.05). And combined group's activities were the highest. Inhibition of ERK1/2 pathway could help carboplatin increasing Caspase-8 and Caspase-9 (P<0.01). Conclusion： Inhibition of ERK1/2 pathway can promote carboplatin inducing cell apoptosis in human ovarian cancer cells, and it relates to caspase-8 and caspase-9 activations.

KEY WORDSOvarian neoplasms/chemically induced Ovarian neoplasms/prevention and control Carboplatin/therapeutic use Mitogen-activated protein kinase kinases/metabolism Cysteine endopeptidases/metabolism

*黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2013173)

△齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物遺傳教研室