齦溝產(chǎn)線菌檢出率與牙周健康狀況的相關(guān)性分析

程遠(yuǎn) 吳冷 趙蕾

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院牙周病科（四川大學(xué)），成都 610041

?

齦溝產(chǎn)線菌檢出率與牙周健康狀況的相關(guān)性分析

程遠(yuǎn) 吳冷 趙蕾

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院牙周病科（四川大學(xué)），成都 610041

［摘要］目的 分析不同牙周健康狀況者齦下菌斑中齦溝產(chǎn)線菌的檢出率差異及其與牙周臨床指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系。方法 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)法分別檢測(cè)17例牙周健康者的68個(gè)牙周健康位點(diǎn)、19例菌斑性牙齦炎患者的64個(gè)牙周健康位點(diǎn)和76個(gè)病變位點(diǎn)、14例慢性牙周炎患者的36個(gè)牙周健康位點(diǎn)和56個(gè)病變位點(diǎn)的齦下菌斑中齦溝產(chǎn)線菌的檢出率，并分析檢出率與牙周臨床檢查指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果 齦溝產(chǎn)線菌的檢出率在不同人群的健康位點(diǎn)組及不同人群疾病位點(diǎn)組依次分別增高，其中牙周健康者齦下菌斑中齦溝產(chǎn)線菌檢出率最低，為30.88%（21/68），而慢性牙周炎患者病變位點(diǎn)組齦下菌斑中齦溝產(chǎn)線菌檢出率最高，為91.07%（51/56）。齦溝產(chǎn)線菌與位點(diǎn)發(fā)生牙周病變之間的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1），其檢出率與位點(diǎn)牙齦出血指數(shù)、臨床探診深度、臨床附著水平的比值比分別為5.26、8.85、11.65。結(jié)論 牙周炎患者口腔中攜帶齦溝產(chǎn)線菌的風(fēng)險(xiǎn)升高；局部攜帶齦溝產(chǎn)線菌增加了位點(diǎn)牙周臨床指標(biāo)（牙齦出血指數(shù)、臨床探診深度、臨床附著水平）異常的風(fēng)險(xiǎn)。

［關(guān)鍵詞］牙周健康狀況； 齦溝產(chǎn)線菌； 聚合酶鏈反應(yīng)； 檢出率

牙周炎是一種牙周組織感染性破壞性疾病，可導(dǎo)致牙周袋形成，進(jìn)行性附著喪失和牙槽骨吸收，是成人失牙的首要原因，而菌斑微生物是牙周炎的始動(dòng)因子。目前已明確的與牙周炎密切相關(guān)的重要牙周致病菌有11種［1］，主要有牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）、伴放線菌嗜血菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans，A. actinomycetemcomitans）、福賽斯坦納菌（Tannerella forsythia，T. forsythia）、中間普雷沃菌（Prevotella intermedia，P. intermedia）、齒垢密螺旋體（Treponema denticola，T. denticola）等［2］。隨著研究技術(shù)水平的提高，近年來(lái)陸續(xù)從牙周炎患者口腔中分離出一些新的菌屬和菌種，齦溝產(chǎn)線菌（Filifactor alocis，F(xiàn). alocis）即為其中之一。

F. alocis由Cato等［3］于1986年在牙齦炎和牙周炎患者的齦下微生境中分離獲得，是一種培養(yǎng)條件苛刻無(wú)芽孢革蘭陽(yáng)性專性厭氧桿型菌，以單個(gè)、成雙或鏈狀形式出現(xiàn)。菌細(xì)胞寬為0.4～0.7 μm，長(zhǎng)為1.4～7.0 μm，從頭部到尾部呈逐漸縮窄的圓錐形形態(tài)［4］。F. alocis常定植于牙周炎患者的病變位點(diǎn)，在牙周健康位點(diǎn)也可檢出；但F. alocis在慢性牙周炎患者中的檢出率明顯高于牙周健康者，在牙周炎患者病變位點(diǎn)的檢出率也高于其健康位點(diǎn)。Kumar等［5］在分析齦下菌群的細(xì)菌轉(zhuǎn)變與牙周狀況變化的相關(guān)關(guān)系中發(fā)現(xiàn)：牙周狀況持續(xù)穩(wěn)定者齦下菌群的組成相對(duì)保守和穩(wěn)定，牙周狀況改善或惡化者則出現(xiàn)明顯的變化；在其調(diào)查的136種齦下微生物中，F(xiàn). alocis的組成百分比變化最為明顯。該結(jié)果提示，F(xiàn). alocis可能是鑒別牙周炎活動(dòng)性的一項(xiàng)正相關(guān)指標(biāo)。2012年，Colombo等［6］的研究顯示：F. alocis在難治性牙周炎患者中檢出率明顯高于非難治性牙周炎患者，從而認(rèn)為F. alocis可能是導(dǎo)致牙周炎治療效果不佳的重要原因之一。綜合這些研究結(jié)果可以推測(cè)，F(xiàn). alocis可能是牙周炎的可疑致病菌。目前有關(guān)該菌的總體研究尚處于起步階段。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析我國(guó)成人牙周健康者，菌斑性牙齦炎和慢性牙周炎患者的健康和疾病位點(diǎn)的齦下菌斑中F. alocis的檢出率，以及F. alocis與不同牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系，初步探討F. alocis與我國(guó)人群牙周健康狀況之間存在的可能關(guān)系，為牙周炎微生物病因?qū)W的研究提供思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

P. gingivalis國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 33277和變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株UA159，由四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 研究對(duì)象的選擇

于四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院就診的患者及其家屬中篩選年齡為20～70歲的中國(guó)漢族人群，分別選取牙周健康者、菌斑性牙齦炎患者和慢性牙周炎患者。要求所有受試者全身健康，無(wú)系統(tǒng)性疾病；3個(gè)月內(nèi)無(wú)抗生素、非激素類抗炎藥物及免疫抑制劑服用史；婦女未在妊娠期和哺乳期；3個(gè)月內(nèi)無(wú)牙周治療史；口內(nèi)天然牙不少于20顆，且每個(gè)象限不少于5顆，其中至少有4顆磨牙；無(wú)咬合創(chuàng)傷；口內(nèi)無(wú)正畸裝置或/和義齒；口腔內(nèi)無(wú)黏膜病損；能夠配合調(diào)查和取樣。

本研究經(jīng)四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（項(xiàng)目編號(hào)WCHSIRB-D-2-13-133），所有受試者均告知實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮腿臃椒ǎ硎局橥獠⒃敢鈪⒓诱弑患{入。

不同人群的納入標(biāo)準(zhǔn)如下。1）牙周健康者：牙周健康人群的納入標(biāo)準(zhǔn)參照Stingu等［7］的研究，全口牙牙周探診深度（probing depth，PD）≤3 mm，無(wú)臨床附著喪失（clinical attachment loss，CAL），探診出血（bleeding on probing，BOP）陽(yáng)性位點(diǎn)＜10%，且出血位點(diǎn)牙齦出血指數(shù)（bleeding index，BI）≤1，無(wú)明顯牙齦紅腫或退縮。牙周健康牙納入標(biāo)準(zhǔn)參照馮向輝等［8］的研究，納入牙排除齲壞、牙髓治療、充填體懸突、食物嵌塞等干擾因素，要求牙齦無(wú)紅腫，PD≤3 mm，BI≤1，無(wú)臨床附著喪失。2）菌斑性牙齦炎患者：診斷標(biāo)準(zhǔn)采用Armitage（1999年）新分類方法［9］，同時(shí)還需滿足口內(nèi)4個(gè)象限中均需有牙齦炎患牙和牙周健康牙，其中牙周健康牙納入標(biāo)準(zhǔn)同上。3）慢性牙周炎患者：診斷標(biāo)準(zhǔn)采用Armitage（1999年）的新分類方法［9］，同時(shí)還需滿足炎癥位點(diǎn)超過(guò)30%，口內(nèi)4個(gè)象限中均需有牙周炎患牙和牙周健康牙的標(biāo)準(zhǔn)，其中牙周健康牙納入標(biāo)準(zhǔn)同上。

1.3 菌斑樣本的采集及記錄

菌斑樣本采集位點(diǎn)的選擇方法如下：1）牙周健康者分別選取16、26、36、46牙的近頰位點(diǎn)，若不符合條件（缺失、充填體懸突、齲壞、牙髓治療、食物嵌塞等），則依次選取其他牙（選取順序?yàn)槟パ馈澳パ馈把溃┑慕a位點(diǎn)，取樣位點(diǎn)不與患牙位點(diǎn)相毗鄰；2）菌斑性牙齦炎患者每個(gè)象限內(nèi)選取一個(gè)牙齦炎患牙位點(diǎn)（選取順序?yàn)槟パ馈澳パ馈把?；且排除充填體懸突、齲壞、牙髓治療等），每個(gè)象限內(nèi)選取不超過(guò)一個(gè)牙周健康位點(diǎn)；3）慢性牙周炎患者每個(gè)象限內(nèi)選取PD值最大的一個(gè)位點(diǎn)（患牙排除充填體懸突、齲壞、牙髓治療等），每個(gè)象限內(nèi)選取不超過(guò)一個(gè)牙周健康位點(diǎn)。

菌斑采集方法：用無(wú)菌刮匙去除受試牙待測(cè)位點(diǎn)的齦上菌斑，無(wú)菌棉球隔濕，干燥，待檢位點(diǎn)先后插入2根25號(hào)滅菌紙尖直至齦溝或牙周袋底，靜置15 s取齦下菌斑；取出后立即置于含有1 mL厭氧轉(zhuǎn)送液的無(wú)菌離心管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。?duì)每位受試者進(jìn)行全口牙周檢查并記錄取樣位點(diǎn)的齦溝或牙周袋的PD、CAL、BOP、BI。所有位點(diǎn)由同一位牙周?？漆t(yī)生進(jìn)行獨(dú)立測(cè)量。

1.4 DNA的提取及聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain

reaction，PCR）

參考細(xì)菌DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣本細(xì)菌的DNA提取。細(xì)菌16S rDNA通用引物序列及F. alocis特異性引物大小分別為434 bp和594 bp，引物序列設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)［10-11］，具體如下。16S rDNA上游5’-AACGCGAAGAACCTTAC-3’，下游5’-GCGTGTGTACAAGACCC-3’； F. alocis上游5’-CAGGTGGTTTAACAAGTTAGTGG-3’，下游5’-CTAAGTTGTCCTTAGCTGTCTCG-3’。參考Premix Taq R001AM試劑盒（大連TaKaRa公司）說(shuō)明進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR總反應(yīng)體系50 μL，包括：Takara Taq（5 U·μL-1）0.25 μL，10× PCR Buffer（不含Mg2+）5 μL，25 mmol·L-1MgCl23 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol·L-1）4 μL，上下游引物各1 μL，待測(cè)DNA模板10 μL，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至50 μL。參照文獻(xiàn)［12］設(shè)置循環(huán)參數(shù)。1）細(xì)菌16S rDNA通用引物：預(yù)變性94 ℃ 2 min；變性94 ℃1 min，退火55 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)；最后延伸72 ℃ 5 min。2）F. alocis特異性引物：預(yù)變性94 ℃ 2 min；變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 2 min，36個(gè)循環(huán)；最后延伸72 ℃ 10 min。

1.5 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳及鑒定分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后采用全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并記錄，100 bp Marker確定擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量。

因本實(shí)驗(yàn)中無(wú)法獲得F. alocis標(biāo)準(zhǔn)株作為陽(yáng)性對(duì)照，為證實(shí)F. alocis特異性引物PCR擴(kuò)增反應(yīng)的準(zhǔn)確性，對(duì)其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（594 bp）進(jìn)行純化及測(cè)序（由大連寶生物工程有限公司協(xié)助完成）。測(cè)序結(jié)果與GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ Blast.cgi）中F. alocis標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 35896T的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果經(jīng)BLAST測(cè)序分析相似度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件包SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。應(yīng)用方差分析進(jìn)行人口學(xué)特征分析，卡方檢驗(yàn)比較不同牙周狀況群體的待檢位點(diǎn)F. alocis的檢出率，與各臨床指標(biāo)相關(guān)的F. alocis的檢出率，雙向有序關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)分析各臨床指標(biāo)與F. alocis的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

細(xì)菌16S rDNA通用引物和F. alocis特異性引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。細(xì)菌樣本經(jīng)通用引物擴(kuò)增后，可見(jiàn)434 bp大小的陽(yáng)性條帶；臨床樣本經(jīng)特異性引物擴(kuò)增后，可見(jiàn)594 bp的陽(yáng)性條帶；而P. gingivalis和S. mutans經(jīng)特異性引物擴(kuò)增后未見(jiàn)陽(yáng)性條帶，排除假陽(yáng)性的干擾。隨機(jī)選取電泳后出現(xiàn)594 bp大小條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行送檢測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中F. alocis國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 35896T的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果經(jīng)BLAST分析，相似度均達(dá)到99.9%以上。說(shuō)明本研究擴(kuò)增所得產(chǎn)物為目的基因片段。

圖 1 通用引物及F. alocis特異性引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig 1 PCR amplification electrophoretogram of universal primers and F. alocis specific primer

2.2 不同牙周狀況組的納入情況、牙周臨床指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果及F. alocis檢出率的比較

本研究共納入17例牙周健康者的68個(gè)牙周健康位點(diǎn)；19例菌斑性牙齦炎患者的64個(gè)牙周健康位點(diǎn)和76個(gè)牙齦炎病變位點(diǎn)；14例慢性牙周炎患者的36個(gè)牙周健康位點(diǎn)和56個(gè)牙周病變位點(diǎn)。17例牙周健康者男性10例，女性7例，年齡（36.00±6.80）歲；19例菌斑性牙齦炎患者男性14例，女性5例，年齡（31.42± 6.92）歲；14例慢性牙周炎患者男性8例，女性6例，年齡（46.00±11.96）歲。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，3組研究對(duì)象性別比例的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），牙周健康者和菌斑性牙齦炎患者的平均年齡與慢性牙周炎患者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

所有位點(diǎn)的取樣樣本共分為5組，牙周健康者健康位點(diǎn)組（H組）、菌斑性牙齦炎患者健康位點(diǎn)組（G-H組）、菌斑性牙齦炎患者疾病位點(diǎn)組（G-D組）、慢性牙周炎患者健康位點(diǎn)組（P-H組）、慢性牙周炎患者疾病位點(diǎn)組（P-D組）。5組的牙周臨床指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果及F. alocis檢出率結(jié)果如表1所示。從不同人群的健康位點(diǎn)組到疾病位點(diǎn)組，F(xiàn). alocis的檢出率依次增高。健康位點(diǎn)中，H組68個(gè)位點(diǎn)的F. alocis檢出率為30.88%（21/68），G-H組為35.94% （23/64），P-H組為55.56%（20/36），其中H組與P-H組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；病變位點(diǎn)中，G-D組的F. alocis檢出率為65.79%（50/76），PD組為91.07%（51/56），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。牙齦炎患者的健康位點(diǎn)（G-H組）與其病變位點(diǎn)（G-D組）的F. alocis檢出率兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；牙周炎患者的健康位點(diǎn)（P-H組）與其病變位點(diǎn)（P-D組）的F. alocis檢出率兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。牙周健康者的健康位點(diǎn)（H組）與牙齦炎患者的病變位點(diǎn)（G-D組）、牙周炎患者的病變位點(diǎn)（P-D組）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；牙齦炎患者的健康位點(diǎn)（G-H組）與牙齦炎患者的病變位點(diǎn)（G-D組）、牙周炎患者的病變位點(diǎn)（P-D組）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

表 1 不同牙周狀況組的臨床及微生物學(xué)檢查結(jié)果Tab 1 Clinical and microbiological parameters for different periodontal groups evaluated

2.3 F. alocis檢出情況與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

本研究共納入300個(gè)研究位點(diǎn)，其中135個(gè)位點(diǎn)未檢出F. alocis，165個(gè)位點(diǎn)F. alocis檢出陽(yáng)性（表2）。在F. alocis檢出陰性的所有位點(diǎn)中，22.96% （31/135）的位點(diǎn)發(fā)生牙齦炎或牙周炎，而F. alocis檢出陽(yáng)性的所有位點(diǎn)中，61.21%（101/165）的位點(diǎn)發(fā)生牙齦炎或牙周炎，兩者間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。這提示攜帶F. alocis增加了位點(diǎn)發(fā)生牙周病變的可能性。進(jìn)一步分析F. alocis的檢出情況與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果如表3所示。F. alocis陽(yáng)性位點(diǎn)較F. alocis陰性位點(diǎn)的BI、PD、CAL發(fā)生異常的風(fēng)險(xiǎn)增加（P＜0.000 1），提示攜帶F. alocis增加了位點(diǎn)臨床指標(biāo)異常的風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，本研究中F. alocis與位點(diǎn)發(fā)生牙周病變之間的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，比值比（odds ratio，OR）為5.29（95%可信區(qū)間為3.18～8.01）。此外，F(xiàn). alocis 與BI、PD、CAL的OR值分別為5.26（95%可信區(qū)間3.14～8.77），8.85（95%可信區(qū)間4.05～19.23），11.65（95%可信區(qū)間4.49～30.15）；這提示F. alocis與位點(diǎn)臨床指標(biāo)（BI、PD、CAL）的異常具有明顯的相關(guān)性。

表 2 F. alocis檢出情況與位點(diǎn)牙周健康狀況的相關(guān)性分析Tab 2 The correlation analysis between occurrence of F. alocis and different periodontal sites

以牙齦炎患者、牙周炎患者的病變位點(diǎn)為研究對(duì)象，以各臨床指標(biāo)為研究單位，進(jìn)一步分析F. alocis檢出情況與牙周病變嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示：分別比較G-D組、P-D組內(nèi)BI為2～3的位點(diǎn)與BI為4～5的位點(diǎn)F. alocis檢出率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這提示在牙齦炎及牙周炎病變位點(diǎn)中，F(xiàn). alocis的檢出率不隨BI指數(shù)的增加而增加；P-D組內(nèi)比較PD為4～6 mm位點(diǎn)與PD≥7 mm的位點(diǎn)F. alocis檢出率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.558），提示在牙周炎病變位點(diǎn)中，F(xiàn). alocis的檢出率不隨PD指數(shù)的增加而增加；P-D組內(nèi)比較CAL≥5 mm的位點(diǎn)與2 mm≤CAL≤4 mm的位點(diǎn)F. alocis檢出率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.135），提示在牙周炎病變位點(diǎn)中，F(xiàn). alocis的檢出率不隨著CAL指數(shù)的增加而增加。

表 3 F. alocis檢出情況與位點(diǎn)牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab 3 The correlation analysis between occurrence of F. alocis and periodontal clinical indices

3 討論

菌斑微生物是牙周炎發(fā)生的始動(dòng)因子。近年來(lái)隨著研究技術(shù)水平的不斷提高，陸續(xù)從牙周炎患者的口腔中分離出一些新的菌屬和菌種，F(xiàn). alocis就是其中之一。通過(guò)分析牙周炎患者齦下細(xì)菌微生態(tài)組成，發(fā)現(xiàn)F. alocis可能是牙周炎的可疑致病菌之一。然而，目前有關(guān)該菌的總體研究尚處于起步階段，針對(duì)我國(guó)，甚至東亞人群的齦下微生境中F. alocis分布情況的調(diào)查尚少見(jiàn)報(bào)道?；谶@種情況，本研究擬對(duì)F. alocis與我國(guó)人群牙周健康狀況的相關(guān)關(guān)系作分析。

本研究共納入17例牙周健康者，19例菌斑性牙齦炎患者，14例慢性牙周炎患者。人口分布學(xué)特征分析顯示：3組人群間性別分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但年齡分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中慢性牙周炎人群的平均年齡偏高。導(dǎo)致這一差異主要有以下兩個(gè)方面的原因。1）我國(guó)人民口腔衛(wèi)生保健意識(shí)較薄弱，35歲以上人群的牙周炎患病率明顯上升。2005年第三次全國(guó)口腔流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，牙周炎患病率高達(dá)90%以上；因此，在我國(guó)成年人中篩選和納入牙周健康者和慢性牙齦炎患者相對(duì)困難，導(dǎo)致本研究出現(xiàn)年齡分布的差異性。2）本實(shí)驗(yàn)各組納入的樣本人數(shù)較少，進(jìn)一步研究需擴(kuò)大樣本量以減少各組之間的差異。

本研究在3組人群中篩選牙周健康者的健康位點(diǎn)、牙齦炎患者健康位點(diǎn)、牙齦炎患者病變位點(diǎn)、牙周炎患者健康位點(diǎn)、牙周炎患者病變位點(diǎn)并進(jìn)行分組，分析不同牙周狀況位點(diǎn)組的齦下菌斑中F. alocis的檢出情況。結(jié)果顯示：F. alocis的檢出率在不同人群的健康位點(diǎn)組及不同人群疾病位點(diǎn)組依次分別增高，且組間兩兩比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示牙周炎患者口腔中攜帶F. alocis的風(fēng)險(xiǎn)升高。這一研究結(jié)果與國(guó)外研究［13-15］相似。Schlafer等［13］分析了F. alocis與牙周炎的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn). alocis在慢性牙周炎組檢出率（76.7%）明顯高于牙周健康者（15.8%）。Dahlén等［14］的研究顯示，50例牙周炎患者病變位點(diǎn)的F. alocis檢出率顯著高于其健康位點(diǎn)。2012年，Griffen等［15］應(yīng)用454超高通量測(cè)序技術(shù)再次證實(shí)，F(xiàn). alocis的檢出率在牙周健康者、慢性牙周炎患者的健康位點(diǎn)和病變位點(diǎn)中依次升高。本研究中牙周健康者的健康位點(diǎn)組及牙周炎疾病位點(diǎn)組檢出率略高于國(guó)外的研究結(jié)果，這可能與樣本量大小、檢測(cè)方法、種族和基因背景等諸多因素有關(guān)。本研究納入的不同人群的健康位點(diǎn)組中也可檢出F. alocis，提示牙周炎的發(fā)生發(fā)展不僅與細(xì)菌的存在與否相關(guān)，還與宿主易感性、致病菌毒力、細(xì)菌間相互作用、細(xì)菌的定植數(shù)量等諸多因素有關(guān)。

本研究隨后分析了F. alocis檢出情況與牙周健康狀況的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果顯示，F(xiàn). alocis檢出陽(yáng)性的位點(diǎn)發(fā)生牙周病變的可能性增加（P＜0.000 1），OR值為5.29。此外，待測(cè)位點(diǎn)攜帶F. alocis增加了位點(diǎn)牙周臨床指標(biāo)（BI、PD、CAL）異常的風(fēng)險(xiǎn)；提示攜帶F. alocis可增加牙齦出血、牙周袋形成、附著喪失的風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致牙周狀況的改變，F(xiàn). alocis與牙周炎的發(fā)生發(fā)展可能存在著相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步分析F. alocis檢出率與牙周病變嚴(yán)重程度的關(guān)系，結(jié)果顯示，F(xiàn). alocis檢出率與BI、PD、CAL指數(shù)的變化不具有相關(guān)性，盡管F. alocis增加了位點(diǎn)臨床指標(biāo)異常的風(fēng)險(xiǎn)，但與位點(diǎn)病變的嚴(yán)重程度不存在明顯相關(guān)性。這一結(jié)果與Schlafer等［13］的研究結(jié)果類似。Schlafer等［13］采用點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)F. alocis在牙周袋各部位的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD為4～6 mm的牙周袋與PD為7～9 mm的牙周袋中F. alocis的檢出率雖高于對(duì)照組健康位點(diǎn)，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

上述研究結(jié)果均提示，F(xiàn). alocis可能與牙周組織的破壞具有相關(guān)性，體外研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。Moffatt等［16］研究F. alocis作用于牙齦上皮細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，F(xiàn). alocis可黏附于牙齦上皮細(xì)胞表面并侵入細(xì)胞中，與細(xì)菌共培養(yǎng)的細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α的量較對(duì)照組明顯升高，而白細(xì)胞介素-8無(wú)明顯變化。研究者認(rèn)為F. alocis在促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子的同時(shí)，可能與P. gingivalis類似，能夠抑制局部白細(xì)胞介素-8水平達(dá)到“免疫麻痹效應(yīng)”，從而有利于自身躲避宿主免疫防御攻擊。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)：F. alocis可能通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen activated protein kinase kinase，MEK）的活性來(lái)激活caspase-3，引起細(xì)胞發(fā)生外源性細(xì)胞凋亡途徑，這一方式又與T. denticola引起上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制相似。

PCR電泳只能定性反映不同牙周狀況下齦下菌斑中F. alocis的檢出率，無(wú)法準(zhǔn)確地定量分析不同實(shí)驗(yàn)組間F. alocis數(shù)量是否存在差異，以及位點(diǎn)中F. alocis的數(shù)量水平與牙周病變程度的可能關(guān)系。有趣的是，在本研究的PCR產(chǎn)物電泳分析實(shí)驗(yàn)中，不同組的PCR產(chǎn)物電泳條帶的亮度存在差異性趨勢(shì)。因此，后續(xù)研究將擴(kuò)大樣本量，并采用定量PCR的方法進(jìn)一步分析F. alocis攜帶數(shù)量與牙周臨床狀況之間的相關(guān)關(guān)系。

［參考文獻(xiàn)］

［1］孟煥新. 牙周病學(xué)［M］. 北京: 人民衛(wèi)生出版社， 2008:95. Meng HX. Periodontology［M］. Beijing: People’s Medical Publishing House， 2008:95.

［2］周婷， 徐屹， 丁一， 等. 慢性牙周炎齦下菌斑中五種牙周可疑致病微生物的分布［J］. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2007， 25 （5）:470-473. Zhou T， Xu Y， Ding Y， et al. Distribution of five periodontal pathogens in subgingival plaque in chronic periodontitis［J］. West China J Stomatol， 2007， 25（5）:470-473.

［3］Cato EP， Moore LVH， Moore WEC. Fusobacterium alocis sp. nov. and Fusobacterium sulci sp. nov. from the human gingival sulcus［J］. Int J Syst Bacteriol， 1986， 36（4）:475-477.

［4］Haffajee AD， Socransky SS. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases［J］. Periodontol 2000， 1994，5:78-111.

［5］Kumar PS， Leys EJ， Bryk JM， et al. Changes in periodontal health status are associated with bacterial community shifts as assessed by quantitative 16S cloning and sequencing［J］. J Clin Microbiol， 2006， 44（10）:3665-3673.

［6］Colombo AP， Bennet S， Cotton SL， et al. Impact of periodontal therapy on the subgingival microbiota of severe periodontitis: comparison between good responders and individuals with refractory periodontitis using the human oral microbe identification microarray［J］. J Periodontol，2012， 83（10）:1279-1287.

［7］Stingu CS， Jentsch H， Eick S， et al. Microbial profile of patients with periodontitis compared with healthy subjects ［J］. Quintessence Int， 2012， 43（2）:e23-e31.

［8］馮向輝， 張立， 孟煥新， 等. 侵襲性牙周炎病原微生物的檢測(cè)［J］. 中華口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2006， 41（6）:344-347. Feng XH， Zhang L， Meng HX， et al. Prevalence of putative periodontal microorganisms in Chinese patients with aggressive periodontitis［J］. Chin J Stomatol， 2006， 41（6）:344-347.

［9］Armitage GC. Development of a classification system for periodontal diseases and conditions［J］. Ann Periodontol，1999， 4（1）:1-6.

［10］Dahlén G， Konradsson K， Eriksson S， et al. A microbiological study in relation to the presence of caries and calculus ［J］. Acta Odontol Scand， 2010， 68（4）:199-206.

［11］Siqueira JF， R??as IN. Detection of Filifactor alocis in endodontic infections associated with different forms of periradicular diseases［J］. Oral Microbiol Immunol， 2003， 18 （4）:263-265.

［12］Siqueira JF， R??as IN. Simultaneous detection of Dialister pneumosintes and Filifactor alocis in endodontic infections by 16S rDNA-directed multiplex PCR［J］. J Endod， 2004，30（12）:851-854.

［13］Schlafer S， Riep B， Griffen AL， et al. Filifactor alocis—involvement in periodontal biofilms［J］. BMC Microbiol，2010， 10:66.

［14］Dahlén G， Leonhardt A. A new checker board panel for testing bacterial markers in periodontal disease［J］. Oral Microbiol Immunol， 2006， 21（1）:6-11.

［15］Griffen AL， Beall CJ， Campbell JH， et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing［J］. ISME J， 2012， 6（6）: 1176-1185.

［16］Moffatt CE， Whitmore SE， Griffen AL， et al. Filifactor alocis interactions with gingival epithelial cells［J］. Mol Oral Microbiol， 2011， 26（6）:365-373.

（本文編輯 吳愛(ài)華）

［中圖分類號(hào)］R 783

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A ［doi］ 10.7518/hxkq.2016.01.009

［收稿日期］2015-09-15； ［修回日期］ 2015-11-02

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金（81371150）；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金（2013-693-11-11）

［作者簡(jiǎn)介］程遠(yuǎn)，住院醫(yī)師，碩士，E-mail：yuan_a1989@163.com

［通信作者］趙蕾，副教授，博士，E-mail：jollyzldoc@163.com

Correlation analysis of Filifactor alocis detection with periodontal status

Cheng Yuan ， Wu Leng， Zhao Lei.
（State Key Laboratory of Oral Diseases， Dept. of Periodontics， West China Hospital of Stomatology， Sichuan University， Chengdu 610041， China）

Supported by: Natural Science Foundation of China （81371150 ）； State Education Ministry Scientific Research Foundation for The Returned Overseas Chinese Scholars （2013-693-11-11）. Correspondence: Zhao Lei， E-mail: jollyzldoc@163.com.

［Abstract］Objective The study investigated the epidemiology of Filifactor alocis （F. alocis） in subgingival plaque samples from subjects with different periodontal statuses. The relationship between the prevalence of F. alocis and clinical periodontal parameters was also analyzed. Methods Subgingival plaque samples and periodontal data were collected from 68 healthy sites （H groups） in 17 healthy subjects， 64 healthy （G-H group） and 76 diseased sites （G-D group） in 19 patients with chronic gingivitis， and 36 healthy （P-H group） and 56 diseased sites （P-D group） in 14 patients with chronic periodontitis. The plaque samples were analyzed by polymerase chain reaction， and possible correlations between the F. alocis detection rate and the bleeding index， probing depth， or clinical attachment level were determined. Results The detection levels of F. alocis increased in both healthy and diseased groups. The lowest level at 30.88% （21/68） was noted in the H group， whereas the highest level at 91.07% （51/56） was obtained from the P-D group. A significant correlation was found between the F. alocis detection levels and periodontal disease condition （P＜0.000 1）. Further analyses showed that a significant correlation also existed between the detection level of F. alocis and the abnormal clinical periodontal parameters， namely， bleeding index， probing depth， and clinical attachment loss. The odds ratios were 5.26， 8.85， and 11.65， respectively. Conclusion F. alocis was found at increasedlevels in subjects with periodontal disease. The presence of F. alocis increases the risk of sites with abnormal clinical periodontal parameters.

［Key words］periodontal state； Filifactor alocis； polymerase chain reaction； detection rate