轉(zhuǎn)化生長因子-β1和白細(xì)胞介素-10單核苷酸多態(tài)性與復(fù)發(fā)性口腔潰瘍易感性的研究

張敬沙晶晶龔娟

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院口腔醫(yī)院牙體牙髓病科；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生院，銀川 750004

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轉(zhuǎn)化生長因子-β1和白細(xì)胞介素-10單核苷酸多態(tài)性與復(fù)發(fā)性口腔潰瘍易感性的研究

張敬1沙晶晶2龔娟1

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院口腔醫(yī)院牙體牙髓病科；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生院，銀川 750004

［摘要］目的 研究轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）-509T/C位點(diǎn)與白細(xì)胞介素-10（IL-10）-1082A/G位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與復(fù)發(fā)性口腔潰瘍（RAU）易感性的相關(guān)性。方法 采用限制性片段長度多態(tài)性-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RFLPPCR）法和序列特異性引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（SSP-PCR）法對138例RAU患者和124例健康對照者進(jìn)行TGF-β1-509位點(diǎn)與IL-10-1082位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的檢測分析，用比值比（OR）和95%可信區(qū)間（95%CI）估計相對危險度。結(jié)果 TGF-β1-509位點(diǎn)與IL-10-1082位點(diǎn)在基因型頻率與等位基因頻率的分布上，病例組與正常對照組之間均存在明顯差異（P＜0.05）。TGF-β1-509位點(diǎn)基因型CT（OR=1.231，95%CI=0.702～2.160）與TT（OR=2.482，95%CI= 1.250～4.927）為高風(fēng)險基因型，T等位基因為高風(fēng)險等位基因（OR=1.465，95%CI=1.036～2.074）。IL-10-1082位點(diǎn)基因型AG（OR=1.391，95%CI=0.808～2.396）與GG（OR=4.165，95%CI=1.944～8.924）為高風(fēng)險基因型，G等位基因為高風(fēng)險等位基因（OR=2.134，95%CI=1.474～3.089）。結(jié)論 TGF-β1-509位點(diǎn)與IL-10-1082位點(diǎn)是RAU患者的易感基因位點(diǎn)。TGF-β1-509位點(diǎn)攜帶T等位基因患RAU的風(fēng)險性是攜帶C等位基因者的1.465倍。IL-10-1082位點(diǎn)攜帶G等位基因患RAU的風(fēng)險性是攜帶A等位基因者的2.134倍。

［關(guān)鍵詞］轉(zhuǎn)化生長因子-β1； 白細(xì)胞介素-10； 單核苷酸多態(tài)性； 復(fù)發(fā)性口腔潰瘍

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍（recurrent aphthous ulcer，RAU）是常見的口腔黏膜疾病，患病率可高達(dá)20%。目前國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為RAU發(fā)病是遺傳、環(huán)境及免疫綜合作用，即遺傳背景加上適當(dāng)?shù)沫h(huán)境引發(fā)異常的免疫反應(yīng)而出現(xiàn)RAU特征性病損。研究［1］已表明：RAU患者出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)的下降，其中以CD4、CD4/CD8的水平均出現(xiàn)不同程度的降低。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）和白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）是由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生，可以抑制多種細(xì)胞因子的合成，對T細(xì)胞免疫有著負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。有研究表明，TGF-β1和IL-10的單核苷酸多態(tài)性與多種自身免疫性疾病密切相關(guān)，位于啟動子區(qū)的TGF-β1-509位點(diǎn)［2］與IL-10-1082位點(diǎn)［3］的基因多態(tài)性與這2個因子的轉(zhuǎn)錄水平和循環(huán)濃度有關(guān)。前期研究［4］發(fā)現(xiàn)RAU患者外周血中TGF-β1和IL-10處于高表達(dá)水平，提示TGF-β1和IL-10可能與RAU發(fā)病有一定的關(guān)系。本研究通過對RAU患者與健康對照組TGF-β1-509位點(diǎn)與IL-10-1082位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測，旨在探討這2個位點(diǎn)與RAU易感性的關(guān)系，為RAU發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2012年6月—2014年12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院口腔醫(yī)院口腔黏膜病科就診的138例RAU患者，其中男72例，女66例，年齡（43.45±31.34）歲，其診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合第4版的《口腔黏膜病學(xué)》。同時選取124例健康者為正常對照組，其中男60例，女64例，年齡（44.01±28.50）歲。2組年齡、性別、民族均衡可比（P性別＞0.540；P年齡＞0.781；P民＞0.415），且組間漢族與其他民族2個位點(diǎn)各個基因型構(gòu)成比比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。病例組及正常對照組均排除：各種全身系統(tǒng)性疾??；24 h內(nèi)使用過鎮(zhèn)痛藥，1個月內(nèi)使用過抗生素，3個月內(nèi)全身使用過免疫抑制劑、皮質(zhì)類固醇激素類藥物等。

1.2 方法

1.2.1 全血基因組DNA提取 采集所有病例組與正常對照組人員的外周靜脈血2 mL，使用DNA提取試劑盒（北京天根有限公司）提取DNA，具體操作按照試劑盒說明。

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性的檢測 通過限制性片段長度多態(tài)性-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction，RFLP-PCR）法及序列特異性引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（sequence specific primer-polymerase chain reaction，SSP-PCR）法檢測TGF-β1-509T/C位點(diǎn)與IL-10-1082A/G位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性，利用特異性的引物擴(kuò)增目的基因片段。將一個樣本配制25 μL聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系，其配比為：12.5 μL的2×Reaction Mix、0.5 U的Taq聚合酶、300 ng的待測樣本模板DNA。TGF-β1-509位點(diǎn)再加入1 μL上游引物、1 μL下游引物（表1），剩余用ddH2O補(bǔ)足體系。IL-10-1082位點(diǎn)再加入1 μL內(nèi)參照正向引物、1 μL內(nèi)參照反向引物、1 μL通用反向引物、1 μL特異正向引物（A管中加入引物A，G管中加入引物G）（表1），剩余用ddH2O補(bǔ)足體系。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，30個循環(huán)（94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃終末延伸5 min。然后對TGF-β1-509位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，25 μL酶切體系（5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、5 U限制性內(nèi)切酶Bsu36Ⅰ，2.5 μL 10×Buffer，剩余用ddH2O補(bǔ)足體系）在37 ℃下孵育1 h，然后對TGF-β1-509位點(diǎn)的酶切PCR產(chǎn)物及IL-10-1082位點(diǎn)的直接擴(kuò)增PCR產(chǎn)物在3%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行120 V、20 min的電泳，在多色熒光成像系統(tǒng)下拍攝照片。

表 1 各基因位點(diǎn)引物序列及退火溫度Tab 1 Each sequence primers of gene site and annealing temperature

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Hardy-Weinberg平衡檢驗群體代表性。采用SPSS 17.0軟件對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，運(yùn)用χ2檢驗計算各位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，用比值比（odds ratio，OR）和95%可信區(qū)間（95% confidence interval，95%CI）估計相對危險度。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1-509T/C位點(diǎn)與IL-10-1082A/G位點(diǎn)的基因型檢測分析

TGF-β1-509T/C位點(diǎn)基因型電泳結(jié)果見圖1。由圖1可見，TGF-β1-509位點(diǎn)的目的基因為419 bp的一條帶，經(jīng)Bsu36Ⅰ限制性內(nèi)切酶消化，可將等位基因C酶切，因此TT基因型為419 bp的條帶，CT基因型為419、229、190 bp的條帶，CC基因型為229、190 bp的條帶。

圖 1 TGF-β1-509T/C位點(diǎn)基因型電泳圖Fig 1 The genotype electrophoregram of TGF-β1-509T/C site

IL-10-1082位點(diǎn)的目的基因為161 bp的一條帶，人生長激素內(nèi)參基因為429 bp的一條帶。將一個樣本分為A管與G管，所有的樣本中均含人生長激素內(nèi)參基因。AA基因型：A管中有161 bp的條帶，G管中沒有161 bp的條帶；GG基因型結(jié)果與之相反；AG基因型：A、G兩管中均有161 bp的條帶，具體見圖2。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗

對正常對照組124人進(jìn)行了Hardy-Weinberg平衡檢驗群體代表性，結(jié)果顯示：TGF-β1-509位點(diǎn)的χ2= 0.057 3，P＞0.05；IL-10-1082位點(diǎn)的χ2=1.328，P＞ 0.05，符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。

圖 2 IL-10-1082A/G位點(diǎn)基因型電泳圖Fig 2 The genotype electrophoregram of IL-10-1082A/G site

2.3 TGF-β1-509T/C位點(diǎn)與IL-10-1082A/G位點(diǎn)的基因檢測結(jié)果分析

TGF-β1-509位點(diǎn)與IL-10-1082位點(diǎn)的各等位基因及基因型統(tǒng)計結(jié)果見表2、3。本研究共完成138 例RAU患者及124例健康對照者的TGF-β1-509位點(diǎn)與IL-10-1082位點(diǎn)的檢測，結(jié)果表明：病例組與正常對照組在基因型頻率與等位基因頻率的分布上，均存在明顯差異（P＜0.05）。2組TGF-β1-509位點(diǎn)的CC、CT、TT基因型頻率相比較，χ2=7.273，P= 0.026；C、T的等位基因頻率相比較，χ2=4.671，P= 0.031。與基因型CC相比較，基因型CT的OR=1.231 （95%CI=0.702～2.160），基因型TT的OR=2.482 （95%CI=1.250～4.927）。以C等位基因作為標(biāo)準(zhǔn)，T等位基因OR=1.465（95%CI=1.036～2.074）。2組IL-10-1082位點(diǎn)的AA、AG、GG的基因型頻率相比較，χ2=14.569，P=0.001；A、G的等位基因頻率：χ2=16.387，P=0.000。與基因型AA相比較，基因型AG的OR=1.391（95%CI=0.808～2.396），基因型GG 的OR=4.165（95%CI=1.944～8.924）。以A等位基因作為標(biāo)準(zhǔn)，G等位基因OR=2.134（95%CI=1.474～3.089）。

表 2 TGF-β1-509位點(diǎn)與IL-10-1082位點(diǎn)的基因型統(tǒng)計分析表Tab 2 Genotype statistical analysis tables of TGF-β1-509 site and IL-10-1082 site

表 3 TGF-β1-509位點(diǎn)與IL-10-1082位點(diǎn)的等位基因統(tǒng)計分析表Tab 3 Allele statistical analysis tables of TGF-β1-509 site and IL-10-1082 site

3 討論

TGF-β1是體內(nèi)主要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，能抑制T細(xì)胞的增殖與分化，引起免疫抑制。它的基因定位于染色體19q13.1～q13.3，含有7個外顯子，該基因5’端序列包含5個明顯的調(diào)控區(qū)：1個類增強(qiáng)子活性區(qū)，2個負(fù)調(diào)控區(qū)和2個啟動子區(qū)。研究［2］發(fā)現(xiàn)TGF-β1基因的轉(zhuǎn)錄水平和循環(huán)濃度與-509T/C位點(diǎn)、-869C/T位點(diǎn)和-915C/G位點(diǎn)的多態(tài)性相關(guān)，-509T/C位點(diǎn)的T等位基因與TGF-β1高表達(dá)相關(guān)。TGF-β1-509T/C位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與多種疾病的易感性相關(guān)，其中包括：IgA腎病［5］、慢性牙周炎［6］等。本課題組前期對RAU患者及正常對照組進(jìn)行TGF-β1的血清酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)RAU患者血清中TGF-β1的含量較正常對照組高［4］。本研究通過對RAU患者與正常對照組TGF-β1-509位點(diǎn)與IL-10-1082位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，病例組與正常對照組TGF-β1-509T/C位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率之間均存在著明顯的差異（P＜0.05）。T等位基因?qū)е聜€體患RAU的風(fēng)險是C等位基因的1.465倍，提示T等位基因為易感基因，可能與RAU的發(fā)病有一定的聯(lián)系。

Babyatsky等［7］報道潰瘍性結(jié)腸炎的結(jié)腸黏膜中發(fā)現(xiàn)TGF-β1及TGF-β1 mRNA表達(dá)增高，且主要在靠近腔面的固有層炎細(xì)胞中表達(dá)，提示TGF-β1可能在抑制上皮細(xì)胞增殖與促進(jìn)潰瘍愈合均發(fā)揮重要作用?？谇火つづc結(jié)腸黏膜同屬消化道黏膜，口腔潰瘍患者的TGF-β1水平升高可能會與口腔黏膜損傷及修復(fù)有關(guān)。口腔黏膜中上皮層次的穩(wěn)定性取決于基底細(xì)胞層增殖分化的速度與角化細(xì)胞層脫落的速度相等，當(dāng)前者變慢和/或后者變快時都會導(dǎo)致口腔黏膜上皮變薄，抵抗力降低，易于發(fā)生潰瘍［8］。TGF-β1的高表達(dá)能夠趨化炎癥細(xì)胞及組織修復(fù)細(xì)胞向潰瘍面聚集，可靠直接作用成纖維細(xì)胞促進(jìn)膠原合成、肉芽組織生長及修復(fù)期的組織改建。TGF-β1-509T/ C位點(diǎn)的T等位基因可能與相應(yīng)的核蛋白轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合譜改變相關(guān)［9］，從而使血清中的TGF-β1循環(huán)水平增加，這與本研究發(fā)現(xiàn)的CT與TT為高風(fēng)險基因型及T為高風(fēng)險等位基因的結(jié)果相一致。

IL-10是一種Th2細(xì)胞產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，作為主要的抗炎因子、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)，它具有較強(qiáng)的免疫抑制作用和抗炎作用，在許多自身免疫性疾病起到至關(guān)重要的作用［10］。IL-10基因定位于第1號染色體q31～32，包括5個外顯子和4個內(nèi)含子，它的基因多態(tài)性在啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始部位上游-1082（A/G）、-819（C/T）和-592（C/ A）處有3個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)［11］。這3處位點(diǎn)的基因多態(tài)性與IL-10表達(dá)水平有密切聯(lián)系，-1082G相對于-1082A為高表達(dá)等位基因，以-1082A/G的多態(tài)性對表達(dá)水平的影響最顯著。本課題組前期對RAU患者及正常對照組進(jìn)行IL-10的血清酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)RAU患者血清中IL-10的含量較正常對照組高［4］。本研究對IL-10-1082A/G位點(diǎn)的基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：2組IL-10-1082A/G位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率均存在著明顯的差異（P＜0.001）。G等位基因?qū)е聜€體患RAU的風(fēng)險是A等位基因的2.134倍，GG、AG基因型的發(fā)病機(jī)率明顯高于基因型AA，提示G等位基因可能與RAU的易感性相關(guān)。

向曉明等［12］指出，RAU患者存在長期的細(xì)胞免疫功能低下（發(fā)病期及間隙期均低下），某些因素啟動并加重口腔黏膜局部的免疫損傷，形成潰瘍，并使RAU反復(fù)發(fā)作。IL-10-1082位點(diǎn)的G等位基因的表達(dá)使血清IL-10水平升高，可能造成口腔黏膜局部細(xì)胞免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，破壞口腔黏膜部分上皮的完整性，從而形成潰瘍。這說明IL-10-1082位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性所致的表達(dá)水平的改變，很有可能導(dǎo)致RAU的發(fā)生與發(fā)展。

總之，本研究證明TGF-β1-509T/C位點(diǎn)與IL-10-1082A/G位點(diǎn)是RAU患病的易感基因位點(diǎn)，攜帶T等位基因與G等位基因者分別患RAU的風(fēng)險比正常對照組高出1.465倍與2.134倍。RAU是多種病因共同導(dǎo)致的疾病，尤其是免疫方面的病因復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞因子的協(xié)同作用，單個細(xì)胞因子的作用也僅能體現(xiàn)單方面病因。RAU的單核苷酸多態(tài)性研究還處于起步階段，要想深刻闡述RAU遺傳與免疫的關(guān)系，還需要對多種細(xì)胞因子的多個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行更深入研究。

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（本文編輯 杜冰）

［中圖分類號］R 781.5

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A ［doi］ 10.7518/hxkq.2016.01.006

［收稿日期］2015-04-26； ［修回日期］ 2015-11-10

［基金項目］寧夏自然科學(xué)基金（NZ201322）

［作者簡介］張敬，主任醫(yī)師，碩士，E-mail：zhj20045@163.com

［通信作者］張敬，主任醫(yī)師，碩士，E-mail：zhj20045@163.com

Relationship between transforming growth factor-β1 and interleukin-10 single nucleotide polymorphism and suscep-tibility of recurrent aphthous ulcer

Zhang Jing1， Sha Jingjing2， Gong Juan1.
（1. Dept. of Endodontic Disease， Stomatological Hospital of Ningxia Medical University General Hospital， Yinchuan 750004， China； 2. Graduate School of Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China）

Supported by: National Natural Science Foundation of Ningxia（NZ201322）. Correspondence: Zhang Jing， E-mail: zhj20045 @163.com.

［Abstract］Objective To explore the possible relationship between recurrent aphthous ulcer （RAU） and single nucleotide polymorphism （SNP） of transforming growth factor-β1 （TGF-β1） -509T/C and interleukin-10 （IL-10） -1082A/G sites. Methods A total of 138 RAU patients were recruited for this study. The control group consisted of 124 subjects. TGF-β1-509T/C and IL-10-1082A/G sites were detected by restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction （RFLP-PCR）and sequence specific primer-polymerase chain reaction （SSP-PCR）. Relative risk ratios were estimated by odds ratios （OR）and 95% confidence interval （95%CI）. Results Significant differences were found in the genotype frequencies or allele frequencies of TGF-β1-509T/C and IL-10-1082A/G sites between the RAU patients and controls （P＜0.05）. CT genotype （OR=1.231， 95%CI=0.702-2.160）， TT genotype （OR=2.482， 95%CI=1.250-4.927）， and T allele （OR=1.465， 95%CI=1.036-2.074） at the TGF-β1-509 site exhibited high risks. AG genotype （OR=1.391， 95%CI=0.808-2.396）， GG genotype （OR=4.165，95%CI=1.944-8.924）， and G allele （OR=2.134， 95%CI=1.474-3.089） at the IL-10-1082A/G site also showed high risks. Conclusion TGF-β1-509T/C and IL-10-1082A/G sites are associated with the risk of RAU. The TGF-β1 gene-509T allele and IL-10 gene-1082G allele may serve as genetic determinants for RAU.

［Key words］transforming growth factor-β1； interleukin-10；single nucleotide polymorphism； recurrent aphthous ulcer