不同pH值對(duì)變異鏈球菌ffh基因表達(dá)的影響

陳澤文黎靜李愷得邱傳彬譙躍銀薛晶李雨慶

1.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)）；2.牙體牙髓病科，成都 610041

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不同pH值對(duì)變異鏈球菌ffh基因表達(dá)的影響

陳澤文1黎靜1李愷得1邱傳彬1譙躍銀1薛晶2李雨慶1

1.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)）；2.牙體牙髓病科，成都 610041

［摘要］目的 檢測(cè)變異鏈球菌（S. mutans）ffh基因在不同pH值條件下的表達(dá)水平，分析pH值對(duì)S. mutans ffh基因表達(dá)的影響，分析調(diào)控ffh表達(dá)的因素。方法 在不同培養(yǎng)時(shí)段（4 h和18 h）和不同pH值（pH值4.0～7.0）條件下培養(yǎng)S. mutans標(biāo)準(zhǔn)菌株UA159，提取樣本，用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法檢測(cè)樣本中目的基因ffh的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化情況，分析S. mutans ffh基因在不同培養(yǎng)時(shí)段和pH值條件下的表達(dá)變化趨勢(shì)。結(jié)果 培養(yǎng)4 h時(shí)，ffh基因相對(duì)表達(dá)量隨著pH值的降低而減少，培養(yǎng)18 h時(shí)，ffh基因相對(duì)表達(dá)量隨著pH值的降低而增加；相同pH值條件下，ffh基因相對(duì)表達(dá)量在培養(yǎng)4 h與18 h時(shí)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 S. mutans ffh基因的表達(dá)受細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)段和pH值的影響。

［關(guān)鍵詞］變異鏈球菌； ffh基因； 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）和齲病及繼發(fā)的牙髓炎密切相關(guān)［1］。研究［2］表明，S. mutans的致齲特性來自于較強(qiáng)的黏附能力，合成細(xì)胞外多糖的能力，產(chǎn)酸能力和耐酸能力。致齲菌均能產(chǎn)酸，但并非所有能產(chǎn)酸的細(xì)菌均能致齲，因?yàn)殡S著菌斑pH值的降低，一些細(xì)菌失去了產(chǎn)酸能力，在臨界pH值時(shí)，只有少數(shù)耐酸的細(xì)菌如S. mutans和乳桿菌能夠生長(zhǎng)［3］。S. mutans的產(chǎn)酸能力和耐酸能力是其主要的毒力因素，該菌的產(chǎn)酸能力很強(qiáng)，在菌斑pH值下降時(shí)能自適應(yīng)發(fā)生耐酸反應(yīng)（acid-tolerance response，ATR），能在低至pH值為3.0的酸性條件下生存［4-5］。目前，致齲菌的耐酸性是研究抗齲病機(jī)制的重要方向。有研究［4，6］發(fā)現(xiàn)，在S. mutans分泌和耐酸性相關(guān)區(qū)域sat中，有5個(gè)基因操縱子，分別為ffh、ylxM、satC、satD和satE，其中ffh基因可以明顯影響S. mutans的耐酸性，但目前為止對(duì)調(diào)控ffh基因表達(dá)的因素尚不清楚。

為進(jìn)一步了解ffh基因的調(diào)控因素，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（fluorescence quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）的方法定量檢測(cè)S. mutans的ffh基因在不同培養(yǎng)時(shí)段以及pH值環(huán)境的表達(dá)差異，分析調(diào)控S. mutans ffh基因表達(dá)的因素。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)菌株采用S. mutans標(biāo)準(zhǔn)株UA 159，培養(yǎng)基為7組不同pH值（分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）的TPY培養(yǎng)基。

1.2 細(xì)菌的培養(yǎng)取樣

將凍存的S. mutans標(biāo)準(zhǔn)株UA 159于室溫下解凍，復(fù)蘇，接種于TSB培養(yǎng)液中，37 ℃微需氧（95%N2，5%CO2）條件下活化培養(yǎng)24 h，顯微鏡下檢查排除雜菌污染。在BHI固體培養(yǎng)基上劃線接種，37 ℃微需氧條件下培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)典型菌落，于TPY培養(yǎng)液中37 ℃微需氧條件下培養(yǎng)24 h。

取7組不同pH值的TPY培養(yǎng)基，每組設(shè)3只離心管，分別加入10 mL已培養(yǎng)好的菌液，4 000 r·min-1離心10 min。倒掉上清液，留下細(xì)菌沉淀物，每組分別加入不同pH值的TPY培養(yǎng)基，均勻混合后取適量不同組菌液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在自動(dòng)酶標(biāo)儀下檢測(cè)S. mutans 24 h生長(zhǎng)曲線。剩余樣本置入培養(yǎng)箱中37 ℃兼性厭氧培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)4 h和18 h時(shí)取樣，7組菌液樣本分別標(biāo)號(hào)，加入RNA保存液后放入-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 qRT-PCR檢測(cè)

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 結(jié)合GenBank的基因序列和引物設(shè)計(jì)原則，采用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)ffh基因引物，而16S rRNA引物序列參照參考文獻(xiàn)［7］設(shè)計(jì)，委托北京賽爾星生物科技有限公司合成，引物序列如下。S. mutans ffh：上游引物5’-CGACAGGTAAGGCGACATC-3’，下游引物5’-GCGGCAAACGCAAACT-3’；S. mutans 16S rRNA：上游引物5’-AGCGTTGTCCGGATTTATTG-3’，下游引物5’-CTACGCATTTCACCGCTACA-3’。

1.3.2 qRT-PCR檢測(cè) 使用超純RNA提取試劑盒TRI-zol?Reagent提取組織樣本中的總RNA，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。用M-MLV Reverse Transcriptase cDNA第一鏈合成試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行；用UltraSYBR Mixture（with Rox）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。制成qRT-PCR反應(yīng)體系（10 μL UltraSYBR Mixture，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，2 μL模板，加滅菌蒸餾水至20 μL）；擴(kuò)增程序?yàn)樽冃?5 ℃10 min，95 ℃10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。樣品qRT-PCR分析：將各樣品cDNA 10倍稀釋后取2 μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在60～95 ℃進(jìn)行溶解曲線分析。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 用Bio-Rad CFX96 qRT-PCR儀，采用2-ΔΔCT法對(duì)ffh基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在培養(yǎng)4 h和18 h不同pH值條件下的ΔCt計(jì)算公式如下：ΔCt=ffh基因Ct值-16S rRNA Ct值。以4 h且pH=4.0實(shí)驗(yàn)樣本為對(duì)照組，ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt對(duì)照組，計(jì)算得出ffh基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，相同pH值下不同培養(yǎng)時(shí)段比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，相同培養(yǎng)時(shí)段不同pH值組間比較采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 S. mutans生長(zhǎng)曲線

測(cè)定7組不同pH值下細(xì)菌在設(shè)定溫度為37 ℃、OD600的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖1所示。4 h位于平臺(tái)期開始，18 h位于平臺(tái)期末。在pH=4.0條件下生長(zhǎng)曲線變化最小，指數(shù)期略有下降，平臺(tái)期細(xì)菌量最少；pH值為5.5、6.0、6.5、7.0條件下生長(zhǎng)曲線變化大致相等，指數(shù)期增長(zhǎng)最快，平臺(tái)期細(xì)菌量最多；pH值為4.5和5.0條件下細(xì)菌生長(zhǎng)曲線變化及平臺(tái)期細(xì)胞量居兩者之間。由此可知，pH＜5.5時(shí)S. mutans的生長(zhǎng)受到抑制。

圖 1 TPY培養(yǎng)基中S. mutans的生長(zhǎng)曲線Fig 1 The growth curves of S. mutans in TPY culture medium

2.2 RNA電泳和溶解曲線

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2，各組細(xì)菌提取的總RNA完整無降解，總RNA純度達(dá)到提純要求，可將樣本RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。引物篩選結(jié)果得到ffh與16S rRNA基因溶解曲線都為單峰，均一性好（圖3、4），實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。

圖 2 RNA電泳結(jié)果Fig 2 The results of RNA electrophoresis

圖 3 ffh基因溶解曲線Fig 3 The curves of ffh gene dissolution

圖 4 16S rRNA基因溶解曲線Fig 4 The curves of 16S rRNA gene dissolution

2.3 ffh基因mRNA相對(duì)表達(dá)量

不同pH值條件下ffh基因在培養(yǎng)4 h和18 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量見圖5。

圖 5 ffh基因在不同pH值培養(yǎng)基中的相對(duì)表達(dá)量Fig 5 The relative expression levels of ffh gene under different pH conditions

培養(yǎng)4 h時(shí)，ffh基因的相對(duì)表達(dá)量在pH＜5.5低于pH＞5.5（P＜0.05），培養(yǎng)18 h時(shí)ffh基因的相對(duì)表達(dá)量在pH＜6.0高于pH＞6.0（P＜0.05）。pH=4.0、pH= 4.5培養(yǎng)條件下，ffh基因的相對(duì)表達(dá)量在18 h時(shí)較4 h時(shí)更高（P＜0.05），pH=6.0、pH=6.5、pH=7.0培養(yǎng)條件下ffh基因的相對(duì)表達(dá)量在18 h時(shí)較4 h時(shí)更低（P＜0.05），pH=5.0、pH=5.5時(shí)ffh基因的相對(duì)表達(dá)量無明顯差異（P＞0.05）。

3 討論

S. mutans是齲病的主要致齲菌［8］，耐酸性在其致齲性中具有重要作用。當(dāng)pH值下降到臨界值（5.5）以下時(shí)，可造成羥磷灰石中鈣丟失，釉質(zhì)脫礦。一些在中性環(huán)境中本來可以抵抗的有益菌，如格氏鏈球菌［9］，在臨界值以下會(huì)處于弱勢(shì)，對(duì)S. mutans的拮抗作用降低。有效抑制S. mutans的耐酸性是齲病研究的重點(diǎn)，而ffh基因能夠影響致齲菌的耐酸性并參與ATR［3］，若ffh基因失去活性會(huì)導(dǎo)致S. mutans失去耐酸性［6］。ffh基因是真核細(xì)胞信號(hào)識(shí)別顆粒（相對(duì)分子質(zhì)量5.4×104）的同系物［10］。有研究［11］表明，ffh基因通過編碼信號(hào)識(shí)別顆粒（signal recognition particle，SRP）的重要組成成分Ffh蛋白來參與其耐酸性。Williams等［12］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)fh蛋白具有鳥苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase，GTPase）活性且與7S或4.5S小細(xì)胞質(zhì)RNA（small cytosol RNA，scRNA）形式穩(wěn)定絡(luò)合物SRP。S. mutans在不具有SRP通路的情況下仍可存活，但對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力減弱。Ffh蛋白和scRNA是細(xì)菌進(jìn)行翻譯時(shí)蛋白質(zhì)運(yùn)輸途徑中SRP的核心要素［13］。SRP通路在細(xì)菌中參與膜生物合成和分泌蛋白質(zhì)等活動(dòng)，而且在細(xì)胞內(nèi)能引導(dǎo)蛋白質(zhì)大分子到其相應(yīng)的位點(diǎn)［8］。這表明SRP通路主要參與S. mutans的應(yīng)激反應(yīng)過程。

研究［14］表明，ffh基因突變會(huì)對(duì)酸性環(huán)境更加敏感，然而并不會(huì)使S. mutans失去生存能力，但是ffh基因的異?；蛉笔?huì)極大地改變包括耐酸性在內(nèi)的生理功能。ffh基因表達(dá)上調(diào)時(shí)會(huì)參與蛋白質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞膜應(yīng)激反應(yīng)，耐酸反應(yīng)和DNA修復(fù)等。Xu等［7］通過實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，ffh基因有影響膜質(zhì)子泵功能的質(zhì)子移位膜ATP酶（translocating ATPase，F(xiàn)-ATPase）活性，改建幾個(gè)涉及重要代謝過程中pH穩(wěn)態(tài)、丙酮酸異化和糖運(yùn)輸?shù)墓δ堋?/p>

基于ffh基因在S. mutans耐酸中表現(xiàn)的突出作用，本文從酸對(duì)ffh基因表達(dá)的影響進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用qRT-PCR方法研究培養(yǎng)4 h和18 h時(shí)S. mutans在不同pH值條件下ffh基因的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，S.mutans在pH值為4.0～7.0培養(yǎng)4 h與18 h時(shí)的ffh基因相對(duì)表達(dá)量有明顯差異。S. mutans在培養(yǎng)4 h時(shí)，在pH值為4.0和4.5環(huán)境中，ffh基因表達(dá)水平小于在pH值為6.0、6.5、7.0中，而在18 h時(shí)則相反，提示pH≤4.5時(shí)S. mutans ffh基因表達(dá)增加而pH＞6.0時(shí)S. mutans ffh基因表達(dá)受到抑制。S. mutans在pH值為5.0和5.5 時(shí)ffh基因表達(dá)水平在培養(yǎng)4 h和18 h時(shí)無明顯變化（P＞0.05），提示這種酸性條件對(duì)ffh基因的表達(dá)無明顯影響。進(jìn)一步分析pH值和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)ffh基因的表達(dá)影響，S. mutans在剛開始接觸酸性環(huán)境時(shí)，因?yàn)橛泻Υ碳な辜?xì)菌處于應(yīng)激狀態(tài)，生長(zhǎng)代謝受限甚至導(dǎo)致部分細(xì)菌死亡，同時(shí)也抑制ffh基因表達(dá)，但隨著其ATR機(jī)制的產(chǎn)生，細(xì)菌逐漸適應(yīng)酸性環(huán)境，ffh基因表達(dá)也逐漸增加，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)菌適應(yīng)酸性環(huán)境。酸性環(huán)境初期會(huì)抑制S. mutans ffh基因的表達(dá)，但隨著ffh基因表達(dá)的增加，可促進(jìn)細(xì)菌對(duì)酸的耐受能力，使其適應(yīng)酸性環(huán)境并穩(wěn)定生存。

本研究結(jié)果顯示，pH值和培養(yǎng)時(shí)間是影響S. mutans ffh基因表達(dá)的重要因素，ffh基因在不同pH值條件下和培養(yǎng)時(shí)段的表達(dá)不同。本實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)選取偏少，也只選取了pH值為4.0～7.0的范圍，下一步需排除各種因素間的相互干擾，篩選調(diào)控ffh表達(dá)的主要因素并明確其作用機(jī)制。

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（本文編輯 吳愛華）

［中圖分類號(hào)］R 780.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A ［doi］ 10.7518/hxkq.2016.01.005

［收稿日期］2015-06-05； ［修回日期］ 2015-10-02

［基金項(xiàng)目］四川大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃省級(jí)項(xiàng)目（20140282）

［作者簡(jiǎn)介］陳澤文，學(xué)士，E-mail：1214150709@qq.com

［通信作者］李雨慶，副教授，博士，E-mail：liyuqing@scu.edu.cn

Effects of different pH conditions on ffh gene expression in Streptococcus mutans

Chen Zewen1， Li Jing1， Li Kaide1， Qiu Chuanbin1， Qiao Yueyin1， Xue Jing2， Li Yuqing1.
（1. State Key Laboratory of Oral Diseases， West China Hospital of Stomatology， Sichuan University， Chengdu 610041， China； 2. State Key Laboratory of Oral Diseases， Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics， West China Hospital of Stomatology， Sichuan University， Chengdu 610041， China）

Supported by: Provincial Fundation for Innovative and Entrepreneurial Training Program for College Students in Sichuan University （20140282）. Correspondence: Li Yuqing， E-mail: liyuqing@scu.edu.cn.

［Abstract］Objective This research aimed to detect the expression levels of ffh gene in Streptococcus mutans （S. mutans）UA159 under different pH conditions， analyze the effect of pH on the expression of ffh gene in S. mutans， and identify the factors regulating the ffh gene expression. Methods Samples of S. mutans were collected at different growth stages （4 h，18 h） and pH values （pH 4.0-7.0）. Fluorescence quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR） was used to measure the relative mRNA expression and trend of the target gene ffh in S. mutans at different growth stages and pH values. Results qRT-PCR results showed that the ffh gene expression decreased along with pH at 4 h， but the expression increased with decreasing pH at 18 h. Under the same pH conditions， the ffh gene expression was significantly different between 4 h and 18 h （P＜0.05）. Conclusion Growth stage and pH value influenced the ffh gene expression in S. mutans.

［Key words］Streptococcus mutans； ffh gene； fluorescence quantitative real-time polymerase chain reaction