核黃疸模型大鼠腦細(xì)胞損傷及行為學(xué)后遺癥的研究

劉祎，肖農(nóng)，毛振沙

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核黃疸模型大鼠腦細(xì)胞損傷及行為學(xué)后遺癥的研究

劉祎，肖農(nóng)，毛振沙

［摘要］目的探討核黃疸模型大鼠腦細(xì)胞損傷及行為學(xué)改變情況。方法25只5日齡Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=11）和模型組（n=14）。模型組予小腦延髓池內(nèi)注射膽紅素溶液10μg/g，對(duì)照組注射等量生理鹽水。觀察注射后大鼠的神經(jīng)行為變化，并記錄其體質(zhì)量；建模后第1天予TUNEL法觀察模型組（n=3）腦基底節(jié)紋狀體神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況；余下大鼠均在生后19d行步態(tài)分析及橫木行走測(cè)試，30d行水迷宮實(shí)驗(yàn)。結(jié)果模型組出現(xiàn)明顯神經(jīng)行為異常，如握拳、角弓反張，且體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組（F＞27.707，P＜0.001）。TUNEL染色示模型組基底節(jié)紋狀體神經(jīng)細(xì)胞凋亡。步態(tài)分析中，模型組左右后肢步長(zhǎng)均短于對(duì)照組（t＞4.129，P＜0.01），步長(zhǎng)差值顯著大于對(duì)照組（t=-4.415，P＜0.001），但步寬與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（t=0.462，P=0.649）。橫木行走測(cè)試中，模型組得分明顯低于對(duì)照組（t=-3.644，P=0.004）。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，模型組各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期均長(zhǎng)于對(duì)照組（F＞6.206，P＜0.05）；穿越平臺(tái)次數(shù)少于對(duì)照組（t=3.297，P=0.004）。結(jié)論核黃疸模型大鼠具有多項(xiàng)運(yùn)動(dòng)功能異常和學(xué)習(xí)記憶障礙，可分別使用步態(tài)分析、橫木行走測(cè)試及水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

［關(guān)鍵詞］核黃疸；步態(tài)分析；橫木行走測(cè)試；水迷宮實(shí)驗(yàn)；大鼠

［本文著錄格式］劉祎，肖農(nóng)，毛振沙.核黃疸模型大鼠腦細(xì)胞損傷及行為學(xué)后遺癥的研究［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22 （6）：640-644.

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新生兒高膽紅素血癥是全球性疾病，影響60%～80%的新生兒［1］。嚴(yán)重的高膽紅素血癥可導(dǎo)致核黃疸，即高膽紅素血癥時(shí)，游離膽紅素通過血腦屏障，沉積于基底節(jié)、腦干、小腦及海馬等部位造成的腦損傷［2］。核黃疸致死率高，存活率為30%～50%，其中有75%～90%患兒遺留永久神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［3］，如肌張力障礙的錐體束外運(yùn)動(dòng)失調(diào)、手足徐動(dòng)、聽力喪失、智力低下等［2，4］。嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥明顯影響患兒日常生活質(zhì)量，給患者、家庭及社會(huì)帶來巨大精神壓力及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，國(guó)內(nèi)外膽紅素腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究多集中于損傷機(jī)制、如何有效預(yù)防和減輕損傷程度方面，腦損傷神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥行為學(xué)方面的研究較少。

本實(shí)驗(yàn)采用5日齡新生大鼠小腦延髓池注射膽紅素溶液的方法構(gòu)建核黃疸模型［5］，探討該模型行為學(xué)改變情況，以期為今后膽紅素腦損傷神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥運(yùn)動(dòng)功能及學(xué)習(xí)記憶的損傷機(jī)制、康復(fù)治療療效及方案選擇的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

5日齡Sprague-Dawley大鼠25只，雌雄不限，體質(zhì)量9～14g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（渝）2012-0001。所有動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，自由進(jìn)水、進(jìn)食，24h晝夜交替（12h：12h），室溫（23±2）℃，濕度約60%。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為生理鹽水對(duì)照組（對(duì)照組，n=11）和核黃疸模型組（模型組，n=14）。

建模1d后取模型組大鼠3只腦組織行石蠟切片，TUNEL染色，其余大鼠均放回母鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)至19d行步態(tài)分析、橫木行走測(cè)試，30d行水迷宮實(shí)驗(yàn)。每項(xiàng)測(cè)驗(yàn)兩組均為11只大鼠，若實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)大鼠死亡，則補(bǔ)充至每組11只。

1.2造模

1.2.1膽紅素溶液配置

避光稱取膽紅素（SIGMA）10mg溶于0.5mol/L氫氧化鈉0.1ml中，加入雙蒸水0.9ml，用0.5mol/L鹽酸調(diào)至pH 8.5，避光，-20℃放置［6］。

1.2.2模型制作

模型組新生鼠乙醚麻醉，用微量注射器經(jīng)小腦延髓池處釋放適量腦脊液后注入膽紅素溶液10μg/g；對(duì)照組同樣方法注射等量生理鹽水［5］。

1.3觀察神經(jīng)行為學(xué)改變及體質(zhì)量

根據(jù)Rose等［7］及Song等［5］對(duì)大鼠膽紅素腦損傷神經(jīng)行為學(xué)改變的描述，觀察兩組大鼠分別在注射膽紅素溶液和生理鹽水后是否出現(xiàn)活動(dòng)減少、握拳、肌張力障礙、轉(zhuǎn)圈、俯伏、角弓反張、吃奶困難等神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)。注射后連續(xù)3d按時(shí)記錄兩組的體質(zhì)量。

1.4TUNEL染色

模型組于6日齡（建模后1d，n=3）斷頭取腦，常規(guī)固定，脫水包埋，切片，獲取基底節(jié)紋狀體石蠟切片后行TUNEL染色（德國(guó)ROCHE公司），細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.5步態(tài)分析

參考Chaniary等的步態(tài)分析方法［8］評(píng)價(jià)大鼠的步態(tài)參數(shù)。有機(jī)玻璃盒（100×6×12cm）架高90cm，一側(cè)放置一個(gè)盒子。透明坐標(biāo)紙粘附于有機(jī)玻璃盒底面。數(shù)碼相機(jī)（NIKON）放置于有機(jī)玻璃盒下方，調(diào)節(jié)鏡頭使其包含實(shí)驗(yàn)所需的有機(jī)玻璃盒底面像。用紅色標(biāo)記筆在大鼠腹面畫一條矢狀線作為行走方向的參照線，并在雙后足中間指骨處點(diǎn)下標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)前訓(xùn)練大鼠至可不停頓地通過有機(jī)玻璃盒到達(dá)另一側(cè)的盒子內(nèi)。錄制每只大鼠至少有3步不停頓的行走視頻，使用Adobe Premiere Pro CS6處理后備用。步態(tài)參數(shù)如下。①步寬：經(jīng)過雙后肢中間指骨所作的與行走方向參照線平行的兩線之間的距離。②步長(zhǎng)：行走中一側(cè)后肢著地時(shí)的中間指骨到緊接著的對(duì)側(cè)后肢著地時(shí)的中間指骨之間在參照線方向的距離。③步長(zhǎng)差異值：行走中右后肢到左后肢步長(zhǎng)（左步長(zhǎng)）減去左后肢到右后肢步長(zhǎng)（右步長(zhǎng)）之差的絕對(duì)值。

1.6橫木行走測(cè)試

參考Puurunen等的方法［9］，測(cè)試裝置由橫木（100×2.5cm，高50cm）及與其一端連接的一個(gè)盒子組成。采用0～6分法進(jìn)行評(píng)價(jià)。0分：鼠不能站立在平衡木上，掉下。1分：鼠能站立在平衡木上，但不能移動(dòng)。2分：鼠試圖穿過平衡木，但掉下。3分：鼠能穿過平衡木，受影響后肢腳滑或失足大于50%的步數(shù)。4分：鼠能穿過平衡木，受影響后肢腳滑或失足次數(shù)大于1次但小于50%的步數(shù)。5分：鼠穿過平衡木，后肢腳滑或失足僅出現(xiàn)1次。6分：鼠穿過平衡木無(wú)腳滑或失足。

1.7Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

參考Morris的方法［10］，圓形水池分為4個(gè)象限，其中1個(gè)象限內(nèi)放置平臺(tái)。水池內(nèi)放水，水平面高于平臺(tái)1cm，倒入墨汁使平臺(tái)隱藏，水溫維持在（25±1）℃。實(shí)驗(yàn)共7d，第1天為適應(yīng)期，撤去平臺(tái)讓大鼠自由游泳60s以適應(yīng)環(huán)境。第2～6天將平臺(tái)重新放置到水池中，記錄大鼠的逃避潛伏期，若大鼠找平臺(tái)時(shí)間超過60s，引導(dǎo)大鼠游至平臺(tái)并停留10s，逃避潛伏期記錄為60s，以上潛伏期數(shù)據(jù)用于評(píng)價(jià)定位導(dǎo)航能力。第7天再次撤去平臺(tái)，記錄大鼠在迷宮內(nèi)自由游泳60s過程中穿越平臺(tái)位置的次數(shù)，以評(píng)價(jià)空間探索能力。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。水迷宮逃避潛伏期采用重復(fù)測(cè)量方差分析和多因素方差分析；體質(zhì)量及體質(zhì)量增長(zhǎng)值采用簡(jiǎn)單效應(yīng)分析；其余數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1神經(jīng)行為學(xué)改變及體質(zhì)量情況

2.1.1神經(jīng)行為學(xué)改變

模型組建模后0.5～1h內(nèi)出現(xiàn)活動(dòng)減弱、握拳、角弓反張，部分出現(xiàn)俯伏、側(cè)臥、轉(zhuǎn)圈、對(duì)外界刺激無(wú)反應(yīng)，4只死亡，予重新建模補(bǔ)充。對(duì)照組沒有出現(xiàn)明顯異常的神經(jīng)行為學(xué)改變。

2.1.2體質(zhì)量

建模后第1天模型組體質(zhì)量負(fù)增長(zhǎng)，而對(duì)照組體質(zhì)量顯著增加（F=145.876，P＜0.001），建模后第2天（F=31.779，P＜0.001）及第3天（F=33.594，P＜0.001）模型組體質(zhì)量逐漸增加，但仍顯著低于對(duì)照組。見表1。

表1　兩組大鼠造模前及造模后連續(xù)3d體質(zhì)量情況（kg）

2.2細(xì)胞病理變化

模型組斷頭取腦后可見不同程度黃染，無(wú)明顯損傷出血；TUNEL染色后光鏡下可見凋亡現(xiàn)象。見圖1。

圖1　模型組基底節(jié)紋狀體神經(jīng)細(xì)胞凋亡（光學(xué)顯微鏡，400×）

2.3步態(tài)分析

模型組左后肢步長(zhǎng)和右后肢步長(zhǎng)均明顯小于對(duì)照組（P＜0.01），左右后肢步長(zhǎng)差值顯著大于對(duì)照組（P＜0.001），兩組步寬無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見表2。

表2　兩組大鼠步態(tài)參數(shù)（cm）

2.4橫木行走測(cè)試

與對(duì)照組相比，模型組在通過橫木時(shí)，躊躇猶豫，探索行為較多，雙后肢滑落次數(shù)明顯增多，部分大鼠在通過途中掉下，有的則不能在橫木上行走甚至站立，測(cè)試評(píng)分明顯偏低（P＜0.01）。見表3。

表3　兩組大鼠橫木行走實(shí)驗(yàn)得分

2.5Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.5.1定位航行能力

兩組大鼠逃避潛伏期隨著訓(xùn)練時(shí)間增加均出現(xiàn)逐漸縮短趨勢(shì)?？傮w上兩組間的逃避潛伏期存在非常高度顯著性差異（P＜0.001）。與對(duì)照組相比，模型組各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期均延長(zhǎng)（P＜0.05）。見表4。

表4　兩組大鼠逃避潛伏期（s）

2.5.2空間探索能力

與對(duì)照組比較，模型組穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P＜0.01）。見表5。

表5　兩組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)（n）

3　討論

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)核黃疸模型鼠出現(xiàn)步態(tài)異常，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)及整合能力下降，學(xué)習(xí)記憶障礙。注射膽紅素溶液后模型組出現(xiàn)自主活動(dòng)減少、握拳、角弓反張、體質(zhì)量不增甚至下降，與急性膽紅素腦病模型鼠的癥狀［5-7，11］及新生兒急性膽紅素腦病的臨床表現(xiàn)［12-13］相符，且基底節(jié)紋狀體細(xì)胞凋亡，提示出現(xiàn)膽紅素腦損傷。

研究顯示，膽紅素入腦后主要選擇性沉積于基底節(jié)（主要為蒼白球）、丘腦底核、腦干神經(jīng)核、小腦及海馬［14-16］。蒼白球及丘腦底核是錐體外系系統(tǒng)的主要組成部分，膽紅素?fù)p傷后可造成錐體外系病變［16］，導(dǎo)致肌張力障礙、姿勢(shì)異常、平衡協(xié)調(diào)不能、運(yùn)動(dòng)異常、手足徐動(dòng)等表現(xiàn)［17-18］。海馬受損則導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙。故本實(shí)驗(yàn)采用步態(tài)分析、橫木行走測(cè)試及水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)核黃疸鼠的運(yùn)動(dòng)功能及學(xué)習(xí)記憶情況。

步態(tài)分析廣泛用于量化評(píng)價(jià)嚙齒動(dòng)物模型的運(yùn)動(dòng)障礙，如帕金森?。?9］、坐骨神經(jīng)損傷［20］，是一種客觀、精細(xì)的評(píng)價(jià)方法。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組雙后肢步長(zhǎng)變短且左右步長(zhǎng)差值變大。提示模型組因膽紅素神經(jīng)毒性導(dǎo)致肌張力障礙，后肢運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)不能，以致步態(tài)異常。以上結(jié)果與Chaniary等的研究結(jié)果［8］相符。有學(xué)者提出步寬增加是機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)為了維持平衡與穩(wěn)定的補(bǔ)償形式［19］，但本實(shí)驗(yàn)中模型組與對(duì)照組的步寬無(wú)顯著性差異，分析可能是本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒r(shí)間為大鼠生后第5天，注入膽紅素可明顯影響生長(zhǎng)發(fā)育而不能顯示出步寬變長(zhǎng)的代償模式。因此5日齡大鼠核黃疸模型可出現(xiàn)步態(tài)異常，其中步長(zhǎng)差異值為評(píng)價(jià)該模型步態(tài)的敏感參數(shù)。

橫木行走測(cè)試是評(píng)價(jià)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)及整合能力的客觀方法［21］。與對(duì)照組相比，模型組在行走時(shí)出現(xiàn)躊躇、后肢滑步，甚至不能行走或站立，提示膽紅素神經(jīng)毒性導(dǎo)致模型組運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)及整合能力受損，該測(cè)試結(jié)果與步態(tài)分析結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)嚙齒動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶能力的常用方法［22-24］。實(shí)驗(yàn)中，模型組逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，且找平臺(tái)能力也低于對(duì)照組，提示模型組學(xué)習(xí)能力下降，空間記憶能力受損。

本研究仍存在著一些不足：①樣本量不大，為了達(dá)到更小的抽樣誤差在今后實(shí)驗(yàn)中可加大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的樣本量；②當(dāng)前應(yīng)用于嚙齒動(dòng)物行為學(xué)缺陷評(píng)價(jià)的方法繁多，各有利弊，本研究?jī)H選取其中3種常見的評(píng)價(jià)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)；③模型組大鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能受損，但步態(tài)分析中的一項(xiàng)參數(shù)，即步寬，與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。因此下一步的實(shí)驗(yàn)研究可增加其他評(píng)價(jià)方法以獲得更多核黃疸動(dòng)物模型的行為學(xué)數(shù)據(jù)，為相關(guān)的研究提供更多選擇。

綜上所述，5日齡Sprague-Dawley大鼠核黃疸模型出現(xiàn)步態(tài)異常，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)及整合能力下降和學(xué)習(xí)記憶障礙，符合新生兒核黃疸的特征，且可使用步態(tài)分析、衡木行走測(cè)試及水迷宮實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此該模型可能為今后膽紅素腦損傷神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥運(yùn)動(dòng)功能、學(xué)習(xí)記憶方面的損傷機(jī)制及康復(fù)治療方法研究奠定基礎(chǔ)。

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Brain Cell Injuries and Behavioral Changes in Rats with Kernicterus

LIU Yi，XIAO Nong，MAO Zhen-sha

1.Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders，Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing，Chongqing International Science and Technology Cooperation Center for Child Development with Disorders，Children's Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China；2.Department of Rehabilitation in Children's Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China

Correspondence to XIAO Nong.E-mail：xiaonongwl@163.com

Abstract：Objective To study the brain cell injuries and behavioral changes of newborn rats with kernicterus.Methods Twenty-five 5-day-old Sprague-Dawley rats were divided into control group（n=11）and model group（n=14）radomly.The model group was injected with bilirubin solution 10μg/g in the cisterna magna，while the control group was injected with equal volume of normal saline.The neurobehavioral changes were observed and the body mass were recorded.TUNEL staining was used to check the apoptosis of striatal nerve cells of basal ganglia in the model group（n=3）on the first day after modeling.The remaining rats were assessed by gait analysis and beam-walking test 19 days after birth，and Morris water maze test was performed 30 days after birth.Results The model group showed apparently abnormal neurobehavioral changes，such as clenched fists，opisthotonos and the body mass were significantly lower in the model group than in the control group（F＞27.707，P＜0.001）.TUNEL staining showed striatal nerve cells apoptosis in the model group.For the gait analysis，the step lengths of both hind legs were shorter（t＞4.129，P＜0.01），and the difference of step length was longer（t=-4.415，P＜0.001）in the model group than in the control group，however，there was no significantly difference in the step width between two groups（t=0.462，P=0.649）.For the beam-walking test，the score was lower in the model group than in the control group（t=-3.644，P=0.004）.For the Morris water maze test，the escape latency was longer（F＞6.206，P＜0.05），and the number of crossing platform was less（t=3.297，P=0.004）in the model group than in the control group.Conclusion The newborn rats' model of kernicterus showed deficits in multiple motor functions and learning and memory ability，which could be assessed by gait analysis，beam-walk test and Morris water maze test，respectively.

Key words：kernicterus；gait analysis；beam-walking test；Morris water maze test；rats

［中圖分類號(hào)］R722.1

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1006-9771（2016）06-0640-05

DOI：10.3969/j.issn.1006-9771.2016.06.004

基金項(xiàng)目：2014年重慶市研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（No.CYS14126）。

作者單位：1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國(guó)際科技合作基地，重慶市400014；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院康復(fù)科，重慶市400014。

作者簡(jiǎn)介：劉祎（1991-），女，漢族，河南駐馬店市人，碩士研究生，主要研究方向：兒科神經(jīng)康復(fù)。通訊作者：肖農(nóng)（1961-），男，漢族，四川內(nèi)江市人，碩士，教授，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)。E-mail：xiaonongwl@163.com。

收稿日期：（2015-11-03修回日期：2016-01-25）