肉牛宰后初期一磷酸腺苷活化蛋白激酶活性在不同部位肉中的差異表達及與牛肉品質關系

張一敏，朱立賢，曹麗，毛衍偉，梁榮蓉，牛樂寶，韓明山，羅欣*

1(山東農業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)　2(內蒙古科爾沁牛業(yè)有限公司， 內蒙古 通遼，028000)

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肉牛宰后初期一磷酸腺苷活化蛋白激酶活性在不同部位肉中的差異表達及與牛肉品質關系

張一敏1，朱立賢1，曹麗1，毛衍偉1，梁榮蓉1，牛樂寶1，韓明山2，羅欣1*

1(山東農業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)2(內蒙古科爾沁牛業(yè)有限公司， 內蒙古 通遼，028000)

摘要文中主要探討了一磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated proteinkinase，AMPK)在宰后早期(3、5.5、7和10 h)不同部位牛肉中的差異性表達以及對最終牛肉品質的影響。選取牛柳(psoas major, PM)與西冷(longissimus dorsi， LD)2個部位，分別測定pH值、AMPK活性、糖酵解指標和肉品質指標。研究結果表明：隨著宰后時間的延長， AMPK的活性顯著下降(P<0.05)，而且PM中的AMPK活性顯著高于LD(P<0.05)； AMPK活性與pH值與肌糖原含量呈顯著正相關，與乳酸含量及(AMP+IMP)/ATP[AMP：adenosine monophosphate,一磷酶腺苷；IMP：inosine monophosphate,肌苷酶；ATP：adehosine triphosphate,三磷酶腺苷)呈顯著負相關關系(P<0.05)，丙酮酸激酶隨宰后時間先升高后降低(P<0.05)，而且PM中丙酮酸激酶達到最大活性值的時間以及最大值要早于且高于LD(P<0.05)；同時，PM在成熟期間表現出較高的嫩度以及較低的蒸煮損失(P<0.05)。上述結果表明，AMPK能夠通過調節(jié)糖酵解進程而影響牛肉的品質。

關鍵詞一磷酸腺苷活化蛋白激酶；牛肉；糖酵解；丙酮酸激酶；品質

一磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated proteinkinase，AMPK)屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被稱為真核細胞的“代謝感受器”和調控細胞能量水平的“燃料開關”。該酶可以感知機體細胞能量代謝狀態(tài)的改變，根據細胞的需能狀況，通過影響物質代謝的多個環(huán)節(jié)，調節(jié)機體的產能和耗能代謝，維持細胞能量的供求平衡[1-4]。自1973年發(fā)現一磷酸腺苷(adehosine monophosphate，AMP)可以激活AMPK以來，對其研究從醫(yī)學領域的抑制腫瘤[5-6]、介導胰島素信號轉導[7-8]及調節(jié)脂類營養(yǎng)代謝[8-9]等逐步深入至動物宰后生理生化進程及肉品科學研究領域，如AMPK誘導豬肉及禽肉產生PSE(pale,soft,exudative;灰白，柔軟，汁液滲出)[10]及類PSE肉[11]，調控肌內脂肪沉積[9]，介導極限pH值[12]等方面。

肌肉轉化為食肉需要經過一系列生理生化變化，能量代謝特別是糖酵解是這些變化過程的重要環(huán)節(jié)[13]。因此，能夠調節(jié)宰后早期糖酵解進程并決定牛肉品質的AMPK無疑是一個有效的研究靶點。已有的研究表明，肌肉的收縮或缺氧條件能夠提高AMP/ATP(adenosine triphosphate,三磷酸腺苷)或AMP+IMP(inosine monophosphate,肌苷酸)/ATP(adenosine triphosphate,三磷酸腺苷)的比值從而導致AMPK的活化[14-15]，而AMPK活化后能通過磷酸化糖酵解的關鍵酶介導糖酵解[14-16]。因此，AMPK活性與不同極限pH值牛肉的產生密切相關[9]。此外，研究發(fā)現環(huán)境因素的改變如高溫，能夠誘導過高的AMPK活性而使火雞產生品質較差的類PSE肉[11]，還有研究表明不同物種、不同功能組織如心臟、肝臟及肌肉AMPK的活性有所不同[17-18]，但到目前為止對肉牛宰后初期AMPK活性與糖酵解關系的報導較少，不同部位牛肉在宰后初期這一品質形成的關鍵時期的AMPK活性的表達規(guī)律尚不明確。

本研究選擇了牛柳(psoasmajor, PM)與西冷(longissimusdorsi， LD)2個部位肉作為研究對象，探討不同部位牛肉中AMPK活性在宰后初期差異性表達及其與肉質之間的關系，初步揭示AMPK調節(jié)牛肉品質的機理。

1材料與方法

1.1材料

選用24月齡體重相近、性別相同的雜交牛6頭(魯西黃牛×西門塔爾，屠宰后胴體重(286.3±41.2) kg，屠宰方式為清真屠宰。在宰后3、5.5、7、10 h 分別從左側胴體取PM和LD，分成小塊，迅速置液氮中，再轉入-80 ℃超低溫冰箱保存。右半胴體在0～4 ℃排酸間成熟至宰后24 h后，取PM和LD，放置于0～4 ℃恒溫箱至宰后14 d，進行剪切力和保水性指標的測定。

1.2儀器與設備

MP-120便攜式pH計，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；DM 6801A便攜式數字溫度計，深圳勝利高電子科技有限公司；UT-1901紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；LC-2030高效液相色譜儀，日本島津公司；SpectraMax-M5酶標儀，美國MD公司；TA-XT2i質構儀，英國Stable Micro System公司；GL-20G-2冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；SPX-400智能型生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠。

1.3實驗方法

1.3.1溫度、pH值測定

在相應的取樣時間點，使用便攜式溫度計和pH計測定兩部位肉的中心溫度與pH值，探頭深度為2 cm，測定3次以上，取平均值。

1.3.2AMPK活性測定

參照ZHU等[11]的方法，采用免疫印跡手段，通過p-AMPK活性表征AMPK活性。取冷凍樣品(100 mg)剔除肉眼可見的脂肪和結締組織，在液氮中研磨，取40 mg樣品粉末，加入混入1 mmol/L酶抑制劑的裂解液(50 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris)，pH 7.4)，150 mol/L NaCl，1% 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，1% 苯甲基磺酰氟) 400 μL，渦旋裂解(4 ℃)，15 000 g離心5 min。取上清，采用BCA法測定蛋白含量，加入生理鹽水定量至5 μg/μL。采用不連續(xù)SDS-PAGE電泳方法，根據蛋白質分子質量的不同進行蛋白分離。采用5% 濃縮膠，恒流10 mA；12%分離膠，恒流20 mA。將電泳后的凝膠置于轉移緩沖液中(20 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸，15%甲醇)，采用濕法將電泳凝膠中的蛋白轉印到0.45 μm PVDF膜上。轉印之前，PVDF膜先用甲醇潤濕。轉印條件為恒壓60 V，2 h。轉印后的PVDF膜用封閉液室溫封閉2 h，用TTBS清洗，加一抗(anti phospho-AMPK-α (Thr 172)、AMPK-α-antibody、Anti-β-Actin Antibody)，抗體按照產品要求進行稀釋，在4 ℃培養(yǎng)箱，于搖床上緩慢搖動孵育過夜。孵育結束，在TTBS中浸洗3次，每次15 min，加入二抗(HRP-labeled goat anti-rabbit IgG)室溫孵育反應2 h，孵育結束后用TTBS 浸洗3次，每次15 min。采用ECL方法進行熒光顯影，將A液與B液按照體積比1∶1進行混合，使其均勻地分布在膜轉印蛋白附著面，于發(fā)光成像儀中進行拍照顯影。

1.3.3糖原和乳酸含量測定

糖原和乳酸含量采用試劑盒(南京建成)進行測定，試驗具體操作和結果計算參照各試劑盒的說明進行。測定波長分別為620 nm和530 nm。

1.3.4ATP、ADP(adenosine diphosphate,二磷酸腺苷)、AMP、IMP的含量測定

參照VECIANANOGUES等[19]的方法采用高效液相色譜儀測定ATP、ADP、AMP和IMP的含量。取冷凍肌肉(已剔除可見脂肪和結締組織)，加入3倍體積的冷卻0.9 mol/L的HClO4，在冰浴中提取30 min，然后在4℃冷凍離心機中13 000 g離心10 min。上清液用2 mol/L的NaOH 溶液中和至pH值中性，然后在同等條件下離心去除多余的高氯酸，并且用0.2 μm的濾膜過濾。取10μL的肌肉提取液用進樣針注入到Diamonsil C18色譜柱中(4.6 mm×250 mm，5μm)。流動相A為磷酸鹽緩沖溶液(0.04 mol/L KH2PO4和0.06 mol/L K2HPO4，pH 7.0)，流動相B為乙腈，流速為1.0 mL/min。洗脫程序參照SHEN等[15]的方法，具體為0 min，100%A和0%B；8min，95%A和5%B；20 min，75%A和25%B；26 min，70%A和30%B；30 min，100%A和0%B。檢測器波長為254 nm，ATP、ADP、AMP和IMP的含量通過外標的保留時間和峰 面積來進行計算。

1.3.5丙酮酸激酶含量測定

丙酮酸激酶含量采用試劑盒(南京建成)進行測定，試驗具體操作和結果計算參照各試劑盒的說明進行。測定波長分別為340 nm。

1.3.6剪切力測定

參考LUO等[20]的方法測定牛肉的剪切力。在宰后1、3、7、14 d打開包裝袋取出肉塊，80 ℃水浴到肉塊中心溫度70℃，室溫冷卻后在放入0～4 ℃冰箱內過夜。用直徑為1.27 cm的空心取樣器沿肌纖維方向取肉柱(注意避開筋鍵)，采用TA-XT2i型質構分析儀的HDP/BSW探頭測定肉柱的剪切力值，并通過Texture Expert V 1.0軟件分析。測定時各控制參數為：測前速 2.0 mm/s，測中速 1.0 mm/s，測后速 10.0 mm/s，下壓距離23.0 mm，負載類型 Auto-40 g。每個肉塊測定6次以上，各肉柱剪切力值的平均值為肉塊的剪切力值。

1.3.7蒸煮損失測定

在宰后1、3、7、14 d打開包裝袋取出肉塊，用濾紙吸干肉塊表面汁液，稱重(m1)后，然后重新裝袋封口，在80 ℃水浴中加熱至肉塊中心溫度達到70 ℃，維持20 min，將袋中蒸煮產生的汁液倒出，冷卻至室溫，然后放于0～4 ℃過夜，用濾紙吸干肉塊表面汁液，稱量(m2)；蒸煮損失率的計算公式為。

(1)

1.3.8數據統(tǒng)計與分析

采用gel-pro analysis 6.0圖譜分析軟件進行蛋白免疫印跡圖譜分析，采用Simaplot 12.0軟件進行作圖。應用SSPS 18.0進行數據分析，采用LSD等方法進行方差分析，差異顯著水平α為0.05。每個試驗重復3次，結果表示為(平均數±標準差)。

2結果與討論

2.1溫度與pH值的變化

圖1　宰后初期牛柳(PM)與西冷(LD)的溫度與pH值變化Fig.1　The temperature and pH values of PM and LD during early post-mortem time

如圖1所示，PM和LD溫度降低的速率無顯著差異(見圖1-a)。而二者的pH值在宰后3～10 h差異較顯著(P<0.05)(見圖1-b)，宰后3h PM的pH值已降至6.0左右，顯著低于LD(pH 6.5)。隨著宰后時間的延長兩部位肉的pH值逐漸降低，至宰后10 h，兩部位肉的pH值已接近牛肉的極限pH值。不同部位肉因肌纖維類型及糖原含量等的不同，初始pH值及pH值下降速率有一定差異。KIM等[21]也發(fā)現,PM的初始pH值低于LD，且PM的pH值下降速率較大。宰后初期肌肉的溫度和pH值，對于后續(xù)的糖酵解進程以及最終形成的肉的品質具有重要影響。

2.2AMPK活性

以p-AMPK(α)蘇氨酸172位點(Thr 172)的磷酸化所表征的AMPK活性如圖2所示。兩部位肉的AMPK活性隨宰后時間的延長逐漸降低，且宰后10 h內PM中AMPK的活性均顯著高于LD(P<0.05)。宰后3 h兩部位肉中AMPK活性差異最大，PM中該酶的活性約為LD的3倍，宰后10 h PM中AMPK活性由最初的0.60降為0.30，而LD中該酶的活性一直保持較低水平。對PM中AMPK活性與后續(xù)糖代謝指標進行相關性分析得出，AMPK活性與糖原含量、乳酸含量及AMP/ATP均顯著相關(P<0.05)，這與活體小鼠[23-24]、火雞肉[11]、豬肉[28]中AMPK活性與糖代謝關系研究結果相一致。

圖2　宰后早期牛柳(PM)與西冷(LD)的AMPK活性Fig.2　The AMPK activity of PM and LD during early post-mortem time by western blotting

2.3能量代謝相關指標

宰后初期兩部位肉的糖原含量、乳酸含量及AMP、IMP、ATP含量如圖3和表1所示?？傮w來看，糖原在兩部位肉中的含量隨宰后時間的延長呈降低趨勢，且PM中糖原含量顯著低于LD中的含量(P<0.05)(圖3-a)。宰后3 h時PM中糖原含量為3.11 mg/g，而LD中的含量為5.87 mg/g，宰后5.5 h兩部位肉中糖原的含量均發(fā)生顯著降低，而之后一直到宰后10 h糖原的含量幾乎未發(fā)生顯著變化。

乳酸因宰后牛體血液循環(huán)的停止無法排出體外，因此隨糖酵解的進行逐漸累積。宰后3～10 h，兩部位肉的乳酸含量差異顯著，但是隨宰后時間的延長兩部位中乳酸的增加量不顯著，宰后3 h時PM中含量為117μmol/g，至10 h僅增至124 μmol/g，LD中乳酸的含量因糖原消耗量較大其增幅高于PM，由89 μmol/g增到116 μmol/g。PM中持續(xù)較高的乳酸含量導致其較低的pH值。

圖3　宰后早期牛柳(PM)與西冷(LD)的能量代謝相關指標的變化Fig.3　Glycogen, lactate and ratio of AMP+IMP and ATP of PM and LD during early postmortem time

ATP在肌肉中的含量較少，當肌肉由有氧呼吸轉為無氧酵解時，其生成量進一步減少。當ATP耗盡時，ADP會進一步釋放能量，產生AMP及IMP。因此AMP和IMP會逐漸累積，AMP+IMP與ATP的比值表征了ATP的消耗速率。由表1可知，兩部位肉的ATP含量差異顯著，宰后3～10 h，PM中ATP的含量一直保持在較低水平(0.2 μmol/g)，顯著低于LD，而(AMP+IMP)/ATP的數值顯著較高。肌肉的糖酵解進程在宰后前幾個小時反應較為劇烈，糖原消耗較快。本研究中PM的初始能量水平(ATP含量)顯著低于LD，其能量緩沖能力較差，糖酵解在前3 h可能已經進行。

2.4丙酮酸激酶活性

AMPK能感知機體細胞能量代謝狀態(tài)的改變，ATP濃度下降，AMP濃度上升時，即AMP/ATP比值提高時，AMPK可被激活[15, 26-27]，AMPK一旦被激活，可以磷酸化下游底物，如果糖磷酸激酶和丙酮酸激酶等，加速宰后糖酵解。因此本研究對相應的丙酮酸激酶的活性進行了測定，結果如圖4所示。宰后3～10 h，丙酮酸激酶在兩部位肉中的活性呈現先升高后降低的趨勢，第5.5 h PM中該酶的活性達到最高為5 880個酶活單位，顯著高于LD中的活性，之后隨著宰后時間的延長活性逐漸降低，第7 h與10 h兩部位肉中該酶的活性無顯著差異。丙酮酸激酶作為糖酵解途徑的3個限速酶之一，其活性的提高能夠提高糖酵解速率。有研究發(fā)現在高溫環(huán)境下雞肉中AMPK可能會誘導丙酮酸激酶的磷酸化，加速宰后糖酵解，導致pH值降低過快，產生PSE肉[11]。SHEN等人以小白鼠為研究對象發(fā)現，通過敲除AMPK基因和注射AMPK抑制劑，均能夠顯著降低丙酮酸激酶的活性[24]。本研究中AMPK活性較高的PM中丙酮酸激酶達到最大活性的時間早于LD，說明在牛肉中AMPK能夠介導丙酮酸激酶的活性而調節(jié)糖酵解進程。

表1　宰后早期西冷(LD)與里脊(PM)中ATP,

ATP: 三磷酸腺苷; AMP: 磷酸腺苷; IMP: 肌苷酸

*不同部位肉在同一宰后時間點差異顯著(P< 0.05)。

圖4　宰后早期牛柳(PM)與西冷(LD)的丙酮酸激酶活性Fig.4　Thepyrugvate kinase activity of PM and LD during early post-mortem time

2.5成熟期間嫩度及保水性

嫩度和保水性是評價牛肉品質最關鍵的指標，較低的剪切力表示較好的嫩度，較少的蒸煮損失在一定程度上表征肉的保水性較好。目前牛肉嫩度的測定，一般采用質構儀測定直徑為1.27 cm肉柱所用的力(WBSFV-Warner-Bratzler shear force value)來表示，肉樣一般經過水浴加熱至中心溫度達70 ℃，與消費者食用熟制肉的主觀評價相對應[20-21]。該方法已在肉品科學研究領域得到廣泛應用，也是我國最新農業(yè)部行業(yè)標準NY/T 2793-2015規(guī)定的牛肉剪切力的測定方法[22]。如表2所示，與LD相比較，PM的嫩度在牛肉成熟期間均顯著較高(P<0.05)，而蒸煮損失則顯著較低(P<0.05)。這一結果與KIM等人的研究結果一致，PM為牛體上品質最好的部位肉，具有較好的嫩度，較好的保水性和多汁性[21]。

表2　宰后不同成熟時間不同部位肉的剪切力值與蒸煮損失

不同部位肉由于肌纖維組成、結締組織含量及宰后糖酵解速率和程度的不同，形成的肉的品質不同。PM與LD的肌纖維組成僅有略微差異，因此宰后糖酵解速率對兩部位肉品質的形成具有關鍵作用。PM在宰后初期具有較高的糖酵解速率，pH值降低速率較快，糖原含量及ATP在宰后一段時間均處于較低水平，且丙酮酸激酶較早達到最高活性，與PM具有較高的AMPK活性相互對應。ZHU等發(fā)現，過高的AMPK活性能夠加快糖酵解速率的進行而影響火雞的肉質[11]。關于不同部位肉中AMPK活性的研究較少，目前僅有李澤等研究發(fā)現羊肉的股二頭肌與頸肉中AMPK 的酶活大于背最長肌與腹肉的活性，所對應的剪切力值顯示腹肉大于其他3個部位肉[28]，但是由于該研究未采用免疫印跡的方法測定AMPK活性，且研究對象為羊肉，因此與本研究的結果表現出不一致性。AMPK活性與肉品質之間的關系還需要通過AMPK抑制劑或激活劑的介導來進一步確定[23-24]。

3結論

宰后初期牛肉中糖酵解速率受到AMPK 活性大小的影響。與LD相比，由于PM中AMPK含量相對較高，導致其具有較高的糖酵解速率，而且PM中丙酮酸激酶的活性較早達到最大活性，說明AMPK可能通過介導丙酮酸激酶加快糖酵解進程。另外，PM在成熟期間表現出較高的嫩度以及較低的蒸煮損失，說明AMPK的活性在不同部位肉中表現出的差異性對牛肉的品質產生一定影響。通過調節(jié)AMPK的活性來實現其對牛肉品質的調控是下一步研究的主要目標。

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The differential expression of AMPK in different beef muscles during early-postmortem

ZHANG Yi-min1, ZHU Li-xian1, CAO Li1, MAO Yan-wei1,LIANG Rong-rong1, NIU Le-bao1, HAN Ming-shan2, LUO Xin1*

1(Shandong Agricultural University, College of Food Science and Engineering, Tai’an 271008,China)2(Inner Mongolia khorchin industry co., LTD. Inner Mongolia, Tongliao 028000,China)

ABSTRACTThe objective of this study was to evaluate the activities of AMP-activated proteinkinase (AMPK) in different beef cattle muscles during early- postmortem time (3h, 5.5h, 7h and 10h). Beef samples from psoas major (PM) and longissimus dorsi (LD) parts were used in the study and their pH value, AMPK activity, glycolysis characters were tested. Results showed that AMPK activity was higher (P<0.05) in PM than that in LD, and this proteinkinas activity decreased (P<0.05) with the increase of postmortem time. The correlation analysis indicated that activation of AMPK was positively related to pH value and glycogen content, negatively related to lactate content, and negatively related with the ratio of AMP+IMP to ATP. The pyruvate kinase activity reached the highest activity value was earlier in PM than that of in LD. Furthermore, compared with LD, the tenderness in PM was better and cooking loss was lower (P<0.05). Those results indicated that the activity of AMPK has a potential effect on beef quality through regulating the glycolysis pathway.

Key wordsAMP-activated proteinkinase; beef; glcolysis; pyruvate kinase; beef quality

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606013

基金項目：國家自然科學基金項目(No.31271901); 農業(yè)部產業(yè)技術體系(No. CARS-38); 山東省現代農業(yè)產業(yè)技術體系 (No. SDAIT-09-09)資助

收稿日期：2015-09-29，改回日期：2015-12-01

第一作者：博士，講師(羅欣教授為通訊作者，E-mail:luoxin@sdau.edu.cn)。