麥芽蛋白溶解度與麥汁高分子蛋白的關(guān)系

李江陽，樊偉，董建軍，尹花，余俊紅，陸健，劉佳，胡淑敏，黃淑霞，孫軍勇

1(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)2(青島啤酒股份有限公司 啤酒生物發(fā)酵工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266061)3(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)4(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)　5(青島啤酒股份有限公司，山東 青島，266061)

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麥芽蛋白溶解度與麥汁高分子蛋白的關(guān)系

李江陽1,2,3,4，樊偉2,4,5*，董建軍2,4,5，尹花2,5，余俊紅2,5，陸健1,3,4*，劉佳2,5，胡淑敏2,5，黃淑霞2,5，孫軍勇1,3,4

1(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)2(青島啤酒股份有限公司 啤酒生物發(fā)酵工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266061)3(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)4(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)5(青島啤酒股份有限公司，山東 青島，266061)

摘要測定了40個不同麥芽樣品的蛋白質(zhì)含量、可溶性氮、庫值及高分子蛋白，并對結(jié)果進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，麥汁中高分子蛋白的含量與麥芽的蛋白質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)(r=0.659，P<0.01)，表明蛋白質(zhì)含量高的麥芽制得的麥汁中高分子蛋白的量也高。此外，建立了麥汁中高分子蛋白與庫值及蛋白質(zhì)含量的線性回歸方程，依據(jù)此方程可根據(jù)麥芽的庫值及蛋白質(zhì)含量預(yù)測麥汁中的高分子蛋白，為從源頭上預(yù)測和控制啤酒泡沫提供支持。

關(guān)鍵詞高分子蛋白；庫值；Bradford法

泡沫是消費(fèi)者判別啤酒質(zhì)量的第一感覺，直接影響消費(fèi)者對啤酒的評價[1]，同時啤酒國標(biāo)的感官要求中對泡沫也有明確要求[2]。因此，啤酒泡沫被視為評價啤酒質(zhì)量的一項(xiàng)十分重要的指標(biāo)。近年來，國內(nèi)啤酒市場競爭激烈，各啤酒廠商為了控制成本及增強(qiáng)自身競爭力，高輔料添加量及用糖漿代替輔料、高濃釀造啤酒、果味啤酒及純生啤酒等采用特殊工藝釀造的啤酒相繼面世，在給企業(yè)節(jié)約成本，拓展市場的同時，也使啤酒泡沫出現(xiàn)了如泡持降低、泡沫質(zhì)量變差等問題。因此，對啤酒泡沫的研究受到廣泛關(guān)注。

EVANS等使用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)定量分析麥芽與啤酒中的泡沫蛋白[3-4]，結(jié)果表明原料中的關(guān)鍵泡沫蛋白的量差異較大，并對啤酒泡沫的質(zhì)量有影響，因此通過該方法測定原料中關(guān)鍵泡沫蛋白的量，可以用來預(yù)測啤酒泡沫的質(zhì)量。但該法操作復(fù)雜、耗時長且大批量檢測成本高昂，應(yīng)用范圍有限。陳霞、孫俊等[5-6]采用Bradford法與SDS-PAGE法研究得到大麥蛋白質(zhì)含量同泡沫蛋白含量之間的關(guān)系及大麥與麥芽間泡沫蛋白含量與組成的差異，為從原料角度預(yù)測啤酒泡沫提供了參考。余俊紅等[7]提出一種啤酒泡沫控制方法，通過控制發(fā)酵之前麥汁的高分子蛋白的量即可得到符合要求的啤酒泡沫，表明在穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝下，麥汁中的高分子蛋白是影響啤酒泡沫的關(guān)鍵因素。由于不同品種麥芽及不同原料配比所釀造出的啤酒泡沫含量差異較大，會對啤酒泡沫的穩(wěn)定性及質(zhì)量有很大影響。因此，迫切需要一種能從原料角度預(yù)測評價啤酒泡沫的簡便快速，行之有效的方法。

本研究選取不同產(chǎn)地、品種及不同蛋白質(zhì)溶解度的麥芽按照統(tǒng)一糖化工藝制備麥汁，用Bradford法[8]測定高分子蛋白，并研究其與麥芽指標(biāo)的關(guān)系。以期研究麥芽蛋白溶解度與麥汁中高分子蛋白含量的關(guān)系，并能依據(jù)麥芽常規(guī)指標(biāo)快速預(yù)測麥汁中高分子蛋白含量，進(jìn)而能預(yù)測啤酒泡沫是否符合要求[7]，為啤酒上游生產(chǎn)過程實(shí)現(xiàn)對啤酒泡沫的調(diào)控提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用麥芽分別為加拿大麥芽Copeland、Bentley、Synergy及Metcalfe，國產(chǎn)麥芽甘啤、墾七、江蘇單二、甘4、甘6、墾十及內(nèi)蒙麥芽，澳大利亞麥芽Gairdner、Scope、Buloke及Bass，均為青島啤酒股份有限公司提供；碳酸鈉基準(zhǔn)試劑：優(yōu)級純，濃鹽酸：分析純，考馬斯亮藍(lán)G-250：生化試劑，國藥集團(tuán)試劑公司。磷酸、乙醇(95%)：分析純，南京化學(xué)試劑有限公司。硼酸、氯化鈉、氫氧化鈉：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。牛血清白蛋白、甲基紅、溴甲酚綠：生化試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2主要儀器與設(shè)備

LB-8型糖化儀，德國Lochner公司；2100Pro紫外分光光度計(jì)，美國GE公司；EBC粉碎儀，德國Buhler公司；凱氏定氮儀，F(xiàn)oss公司；消化爐，F(xiàn)oss公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1麥芽指標(biāo)的測定

麥芽蛋白質(zhì)含量、可溶性氮及庫爾巴哈值測定參照QB/T 1686—2008。

1.3.2麥汁制備方法

協(xié)定麥汁：按照QB/T 1686—2008制備協(xié)定麥汁。

1.3.3不同蛋白質(zhì)溶解度麥芽地制備

制備不同蛋白質(zhì)溶解度麥芽的制麥工藝如表1所示(浸麥采用浸斷結(jié)合的方式)，發(fā)芽結(jié)束后50 ℃排潮10 h，然后分別于60、65、72 ℃和78 ℃各烘3 h，83 ℃焙焦2 h。烘干結(jié)束后將得到的干麥芽除根，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　制麥工藝

1.3.4高分子蛋白的測定

染色液考馬斯亮藍(lán)G-250的配制：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL 95%乙醇中，玻璃棒攪拌5 min，轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，用蒸餾水沖洗干凈燒杯，加入100 mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，雙層濾紙過濾，常溫避光保存。

測定方法：取15 μL待測麥汁，加入85 μL 0.15 mol NaCl溶液與1 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染色液，振蕩混勻，靜置5 min左右，595 nm下測定吸光度?？瞻诪?00 μL 0.15 mol NacL溶液與1 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染色液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定與繪制：分別取10、30、50、70、90 μL、0.1 mg/mL牛血清白蛋白溶液，再分別加入90、70、50、30、10 μL，0.15 mol NaCl溶液與1 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染色液。振蕩混勻，靜置5 min，595 nm下測定吸光度。分別得到含量為0.001、0.003、0.005、0.007及0.009 mg的點(diǎn)的吸光度，用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2結(jié)果與分析

2.1高分子蛋白與麥芽相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系

2.1.1麥芽相關(guān)指標(biāo)與高分子蛋白分析

為研究高分子蛋白與麥芽指標(biāo)的關(guān)系，選擇加麥(Metcalfe、Copeland)、國麥(甘啤、墾七、江蘇單二、內(nèi)蒙麥芽M-3)、澳麥(Gairdner、Bass、Scope)9個品種共計(jì)40個麥芽樣品，按1.3.2麥汁制備方法制備協(xié)定麥汁，測定麥芽相關(guān)指標(biāo)，并建立麥芽相關(guān)指標(biāo)與高分子蛋白的關(guān)系。對與高分子蛋白相關(guān)的麥芽相關(guān)指標(biāo)(可溶性氮、蛋白質(zhì)含量及庫值)進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)溶解度即庫值是衡量麥芽的非常重要的指標(biāo)，只有庫值合理的麥芽才能釀造出品質(zhì)合格的啤酒[9]，因此，所選的麥芽庫值的基本集中分布于40%～45%，各品種之間的差異也比較小。從表2可知加麥的蛋白質(zhì)含量的分布范圍為10.2～11.8 g/100g，國麥的蛋白質(zhì)含量分布范圍為11.1～13.7 g/100g，澳麥的蛋白質(zhì)含量為9.2～10.4 g/100g。所選的澳麥其蛋白質(zhì)含量要低于加麥和國麥，而加麥和國麥的蛋白質(zhì)含量的分布比較接近。40個麥芽的可溶性氮含量分布范圍為0.60%～0.91%(m/m)，各品種間的差異比較大。通過將40個麥芽的高分子蛋白與蛋白質(zhì)含量做散點(diǎn)圖進(jìn)行進(jìn)一步分析，如圖1所示，在蛋白質(zhì)含量相近的情況下，加麥的高分子蛋白含量高于澳麥和國麥。這可能與不同品種麥芽本身蛋白酶酶活及制麥過程中蛋白酶作用時間長短存在差異有關(guān)。為了得到合適的蛋白溶解度且適合用于釀造高品質(zhì)啤酒的麥芽，制麥者會根據(jù)不同品種的大麥制定不同的制麥工藝，而制麥工藝的不同會影響制麥過程中蛋白酶的酶活及酶的作用時間長短等[9-10]，而蛋白酶在制麥過程中的作用是將不可溶的貯存蛋白水解為可溶的蛋白、多肽及氨基酸[11]，因此不同制麥工藝及本身所含蛋白酶的差異可能導(dǎo)致最終得到的高分子蛋白含量的不同。

表2　高分子蛋白與麥芽相關(guān)指標(biāo)含量

圖1　高分子蛋白與蛋白質(zhì)含量散點(diǎn)圖Fig.1　Scatter graph of high molecular weight protein and protein content

2.1.2麥芽相關(guān)指標(biāo)與高分子蛋白相關(guān)性分析

將高分子蛋白與庫值、可溶性氮及蛋白質(zhì)含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。40個麥芽的庫值與高分子蛋白有弱的顯著負(fù)相關(guān)性(r=-0.336，P<0.05)，國麥的庫值與高分子蛋白有強(qiáng)的極顯著負(fù)相關(guān)性(r=-0.704，P<0.01)。這可能是由于所選的麥芽品種有限，或者是由于除庫值外，還有其他因素能影響高分子蛋白質(zhì)的含量。庫值與高分子蛋白呈負(fù)相關(guān)性，可能是由于在制麥過程中，隨著蛋白質(zhì)溶解程度的增加，麥芽中的蛋白酶將更多的大分子蛋白質(zhì)(>5 000 Da)水解為小分子蛋白質(zhì)。40個麥芽的高分子蛋白與可溶性氮有弱的正相關(guān)性(r=0.359，P<0.05)，加麥的高分子蛋白與可溶性氮的存在較強(qiáng)的顯著正相關(guān)(r=0.592，P<0.05)。這可能是因?yàn)榭扇苄缘谐撕懈叻肿拥鞍?，還含有小分子多肽及氨基酸。40個麥芽的高分子蛋白與蛋白質(zhì)含量有較強(qiáng)的極顯著正相關(guān)性(r=0.659，P<0.01)，其中國麥、加麥及澳麥的高分子蛋白與蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)性，相關(guān)性分別為0.954(P<0.01)、0.904(P<0.01)與0.789(P<0.01)。目前所熟知的關(guān)鍵泡沫蛋白有LTP1、蛋白質(zhì)Z及醇溶蛋白碎片，這些蛋白均來自于麥芽[12-16]。結(jié)合高分子蛋白與蛋白質(zhì)含量的相關(guān)性可看出，高分子蛋白含量與麥芽蛋白質(zhì)含量的高低有關(guān)，因此，可以建立蛋白質(zhì)含量與高分子蛋白的關(guān)系，依據(jù)蛋白質(zhì)含量粗略預(yù)測高分子蛋白含量。

表3　高分子蛋白與麥芽各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

注：“**”在0.01水平上存在顯著相關(guān)；“*”在0.05水平上存在顯著相關(guān)。

為了進(jìn)一步揭示高分子蛋白與麥芽指標(biāo)之間的關(guān)系，將高分子蛋白與庫值及蛋白質(zhì)含量做線性回歸分析，得到如表4所示的線性關(guān)系式。4條線性關(guān)系式的顯著性均小于0.01，說明這4條線性關(guān)系式是成立的。在這4條線性關(guān)系式中，國麥、加麥和澳麥的擬合優(yōu)度分別為0.966、0.817及0.612，說明預(yù)測高分子蛋白含量時，應(yīng)按照麥芽的品種選用對應(yīng)的線性關(guān)系式，使結(jié)果更為準(zhǔn)確。

表4　高分子蛋白與庫值和蛋白質(zhì)含量之間的

注：G代表高分子蛋白。

為了驗(yàn)證線性回歸方程的有效性，選取3個澳麥(Gairdner、Buloke)，4個加麥(Copeland、Bentley和Synergy)與4個國麥(墾七、墾十、甘4及甘6)，按照1.3.2麥汁制備方法制備協(xié)定麥汁，測定其庫值、蛋白質(zhì)含量及高分子蛋白含量(見表5)。將實(shí)際測得的高分子蛋白含量與預(yù)測值進(jìn)行比較，除Copeland-2與Buloke高分子蛋白質(zhì)含量預(yù)測值偏離測定值較大(見圖2)，其余的預(yù)測值與測定值符合的很好，說明表4中的線性關(guān)系式可以用于粗略預(yù)測高分子蛋白含量。

表5　高分子蛋白與麥芽相關(guān)指標(biāo)含量

圖2　高分子蛋白含量測定值與預(yù)測值散點(diǎn)圖Fig.2　Scattergraph of measured value and predicted valueof high molecular weight protein

2.1.3不同蛋白質(zhì)溶解度與高分子蛋白關(guān)系分析

從2.1.2中可知，麥芽的高分子蛋白含量與庫值存在弱的負(fù)相關(guān)性，而與蛋白質(zhì)含量存在強(qiáng)的正相關(guān)性。這說明在一定的蛋白質(zhì)含量的條件下，想要提高高分子蛋白含量，需要對蛋白質(zhì)溶解度進(jìn)行調(diào)整，進(jìn)一步研究溶解度與高分子蛋白的關(guān)系。選擇Copeland與Gairdner按照1.2.3中的工藝進(jìn)行小試制麥，制備不同溶解度的麥芽，將制備好的不同溶解度的麥芽按1.3.2中麥汁制備方法制備協(xié)定麥汁，測定麥汁的高分子蛋白。從圖2與圖3中，可看出隨著蛋白質(zhì)溶解度的增大，高分子蛋白含量不斷下降。但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶解到一定程度時，繼續(xù)增大蛋白質(zhì)溶解度，高分子蛋白含量下降的量明顯減少。有研究表明蛋白質(zhì)溶解過度時會使泡沫穩(wěn)定性降低[1]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蛋白質(zhì)溶解到一定程度之后，高分子蛋白質(zhì)的含量下降的量并不大，最可能是由于過度溶解導(dǎo)致蛋白質(zhì)Z、LTP1與醇溶蛋白碎片這些關(guān)鍵泡沫蛋白質(zhì)的過度損失造成[3-4]。因此，在蛋白質(zhì)含量一定的情況下，要獲得較好的啤酒泡沫，可以通過選用低庫值及蛋白質(zhì)Z、LTP1等關(guān)鍵泡沫蛋白質(zhì)合適的麥芽。但是，庫值過高過低對都會對啤酒品質(zhì)產(chǎn)生不良影響[13]，因此，合適的蛋白質(zhì)溶解度對啤酒泡沫及其品質(zhì)有著極其重要的影響。

圖3　Gairdner庫值與高分子蛋白質(zhì)含量曲線圖Fig.3　Curve graph of high molecular weight protein and protein content of Gairdner

圖4　Copeland庫值與高分子蛋白質(zhì)含量曲線圖Fig.4　Curve graph of high molecular weight protein and protein content of Copeland

3結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，采用相同的糖化工藝，不同產(chǎn)地及品種的麥芽，其高分子蛋白含量與蛋白質(zhì)含量有極顯著的強(qiáng)正相關(guān)性，與庫值呈顯著弱的負(fù)相關(guān)，而對同品種不同庫值的麥芽的研究表明，隨著庫值的增大，高分子蛋白質(zhì)含量明顯下降。對高分子蛋白與庫值及蛋白質(zhì)含量進(jìn)行回歸分析，得到擬合優(yōu)度尚可的線性方程，可以用庫值及蛋白質(zhì)含量這兩個指標(biāo)初步預(yù)測高分子蛋白質(zhì)的含量。進(jìn)而可以有針對性的對麥芽進(jìn)行搭配使用，從而使麥汁中高分子蛋白處于一個合理的水平。

啤酒泡沫的組成比較復(fù)雜，因此有大量的研究集中于探究啤酒泡沫的組成，及各種物質(zhì)對啤酒泡沫的影響等，對于從原料角度研究啤酒泡沫問題的研究相對較少。而啤酒泡沫的組分主要來源于麥芽，因此從源頭管控尤為重要。

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Studies on relationship between Kolbach index of malt and high molecular weight protein in wort

LI Jiang-yang1,2,3,4, FAN Wei2,4,5*, DONG Jian-jun2,4,5,YIN Hua2,5, YU Jun-hong2,5, LU Jian1,3,4*, LIU Jia2,5, HU Shu-min2,5,HUANG Shu-xia2,5, SUN Jun-yong1,3,4

1(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(State Key Laboratory of Biological Fermentation Engineering of Beer, Tsingtao Brewery Co., Ltd, Qingdao 266100, China)3(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)4(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)5(Tsingtao Brewery Co., Ltd,Qingdao 266100, China)

ABSTRACTThe protein content，soluble nitrogen，Kolbach index and high molecular weight protein of 40 malts were determined. The results showed that the content of high molecular weight protein in wort was significantly positively correlated with protein content of malt (r=0.659，P<0.01). Furthermore, a linear regression equation of high molecular weight protein in wort and Kolbach index and protein content of malts was established. According to the equation, we could predict the high molecular weight protein in wort based on Kolbach index and protein content of malts, and provide foundation for controlling of the foam protein content in beer from the source.

Key wordshigh molecular weight protein; Kolbach index; coomassie brilliant blue method

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606005

基金項(xiàng)目：國家高技術(shù)研究發(fā)展(863)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013AA102109)；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃(111計(jì)劃)資助項(xiàng)目(111-2-06)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；青島市民生科技計(jì)劃項(xiàng)目(14-2-3-49-NSH)

收稿日期：2015-12-02，改回日期：2016-02-26

第一作者：碩士研究生(樊偉，陸健為通訊作者，E-mail：fanw@tsingtao.com.cn，jlu@jiangnan.edu.cn)。