酶法產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺重組大腸桿菌pepD/pepN基因的敲除及其發(fā)酵優(yōu)化

劉沛沛，張震宇，孫付保，周豪

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

?

酶法產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺重組大腸桿菌pepD/pepN基因的敲除及其發(fā)酵優(yōu)化

劉沛沛，張震宇，孫付保，周豪

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

摘要L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine, L-Ala-L-Gln)，是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的L-谷氨酰胺載體，在臨床醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。為了減少丙谷二肽在生物酶法生產(chǎn)過(guò)程中菌體對(duì)其降解，利用λ Red同源重組系統(tǒng)，敲除大腸桿菌中肽酶D和氨肽酶對(duì)應(yīng)的編碼基因。與野生型菌株相比，雙敲除突變菌株的全細(xì)胞酶活提高了0.29倍。對(duì)該菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵優(yōu)化，得到最優(yōu)培養(yǎng)基為(g/L)：葡萄糖 12、酵母提取物 10、胰蛋白胨 10、(NH4)2SO4 1、KH2PO4 3、K2HPO4 1、MgSO4 0.2；最優(yōu)發(fā)酵溫度為27 ℃ ；最佳反應(yīng)條件為：Gln 200 mmol/L 、Ala-Ome·HCl 200 mmol/L，反應(yīng)pH 8.5，反應(yīng)溫度25 ℃。在最優(yōu)條件下發(fā)酵36 h，丙谷二肽產(chǎn)量達(dá)到了14.51 g/L 反應(yīng)液，是優(yōu)化前的4.74倍。

關(guān)鍵詞L-丙氨酰-L-谷氨酰胺；大腸桿菌；生物酶法；基因敲除；λ Red同源重組；發(fā)酵優(yōu)化

L-谷氨酰胺(L-Glutmine,L-Gln)是一種條件必需氨基酸[1]，通?？捎杉∪獾冉M織大量合成，當(dāng)人體處于外傷、手術(shù)或感染等應(yīng)激或病理狀態(tài)時(shí)，Gln的代謝加快，內(nèi)源合成的Gln不能滿(mǎn)足機(jī)體的需要，此時(shí)必須外源補(bǔ)充[2-3]。Gln具有維持胃腸黏膜正常組織結(jié)構(gòu)[4]、提高機(jī)體抗氧化能力、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤及抗抑郁性等重要生理功能[2]；在畜禽生產(chǎn)方面，適量的Gln可顯著改善斷奶仔豬腹瀉[5-6]，減緩肉仔雞老化速度并減少疫苗免疫對(duì)其的傷害[7]。由于Gln單獨(dú)存在時(shí)，水溶性差(35 g/L, 20 ℃ )，性質(zhì)不穩(wěn)定，高溫易產(chǎn)生有毒的焦谷氨酸和氨[8]，限制了其在臨床上的廣泛使用。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,L-Ala-L-Gln)簡(jiǎn)稱(chēng)丙谷二肽，是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的L-Gln載體，因其具有水溶性好(586 g/L, 20 ℃ )、穩(wěn)定性強(qiáng)、在體內(nèi)能被很快酶解吸收等優(yōu)點(diǎn)，使得采用丙谷二肽進(jìn)行靜脈注射可以安全、有效、定量地提供Gln[3]。

目前丙谷二肽的生產(chǎn)方法主要為化學(xué)合成法[9]，普遍存在成本高、合成過(guò)程復(fù)雜、合成條件苛刻、所用試劑有毒、易生成副產(chǎn)物等缺陷，不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。然而，生物酶法生產(chǎn)丙谷二肽因其具有成本低、污染少、產(chǎn)物得率高等優(yōu)勢(shì)，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。2007年，KAZUHIKO T等人[10]在Bacillussubtilis168中發(fā)現(xiàn)了L-氨基酸連接酶(Lal)，此酶能夠催化游離的L-丙氨酸和L-谷氨酰胺合成丙谷二肽，利用大腸桿菌過(guò)表達(dá)Lal，發(fā)酵47 h后，丙谷二肽產(chǎn)量達(dá)到24.7 g/L。2011年，YOSHINORI H等[11]克隆表達(dá)了SphingobacteriumsiyangensisAJ2458中的α-氨基酸酯酰轉(zhuǎn)移酶(SAET)，該酶能以L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(L-Ala-OMe·HCl)和L-Gln為底物催化合成丙谷二肽，且酶的專(zhuān)一性較強(qiáng)，副產(chǎn)物較少。2013年，YOSHINORI H等[12]利用重組大腸桿菌過(guò)表達(dá)SAET，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模生物酶法催化生產(chǎn)丙谷二肽，在25 L發(fā)酵規(guī)模下，丙谷二肽濃度達(dá)到320 mmol/L。

本實(shí)驗(yàn)室率先在國(guó)內(nèi)開(kāi)展生物酶法生產(chǎn)丙谷二肽的研究，將α-氨基酸酯酰轉(zhuǎn)移酶基因(saet基因)置于組成型啟動(dòng)子的控制下，構(gòu)建出了不需添加誘導(dǎo)劑，能催化生產(chǎn)丙谷二肽的重組大腸桿菌[13]。 本文在本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的SAET生產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上，敲除大腸桿菌中肽酶D和氨肽酶的編碼基因(pepD、pepN)，在搖瓶水平上探討pepD、pepN基因雙敲除對(duì)SAET表達(dá)的影響，并對(duì)重組大腸桿菌催化生產(chǎn)丙谷二肽進(jìn)行了發(fā)酵優(yōu)化。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

本試驗(yàn)所用菌種及質(zhì)粒如表1所示。

表1　所用菌種、質(zhì)粒及其來(lái)源

1.1.2酶和試劑

TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、1 kb DNA Ladder、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、胰蛋白胨均購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司；DpnI快切酶、DL5000 DNA Marker及DL10000 DNA Marker購(gòu)自大連寶生物公司(Takara)公司；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺購(gòu)自TCI公司；L-谷氨酰胺購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；鄰苯二甲醛購(gòu)自Sigma公司。其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 引物

所用引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。敲除及鑒定用引物序列見(jiàn)表2。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，pH 7.0；固體培養(yǎng)基添加1.8% 瓊脂粉。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母抽提物10，胰蛋白胨10，(NH4)2SO45，KH2PO43，K2HPO41，MgSO40.5。

表2　敲除和鑒定用引物

The underlined sequence represents complementary to the sequence on the both ends of theKangene

1.2方法

1.2.1基因敲除用打靶片段的制備

以pKD4為模板，分別以DP1和DP2、NP1和NP2為引物，Taq和PfuDNA聚合酶以1∶1的比例混勻進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DpnI處理后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，以膠回收產(chǎn)物分別作為打靶片段敲除大腸桿菌JM109的pepD基因和JM109(ΔpepD)的pepN基因。

1.2.2大腸桿菌pepD、pepN基因的敲除

大腸桿菌JM109中pepD和JM109(ΔpepD) 中pepN基因的敲除方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]，驗(yàn)證用菌落PCR的引物對(duì)分別為DY1和DY2、NY1和NY2。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)條件

接種1環(huán)重組大腸桿菌至裝有30 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，按4%接種至裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，25 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)36 h。

1.2.4完整細(xì)胞生產(chǎn)丙谷二肽的反應(yīng)條件

取2 mL菌液，8 000 r/min離心5 min，去上清液，用等體積的生理鹽水洗滌細(xì)胞，用上述離心方法再次離心，棄上清，留下的菌體作為催化底物反應(yīng)合成丙谷二肽的粗酶源，加入500 μL含有50 mmol/L Gln及50 mmol/L Ala-Ome·HCl、pH 8.0的底物溶液，25 ℃ 反應(yīng)1.5 h，12 000 r/min離心5 min終止反應(yīng)，取50 μL反應(yīng)上清液用于丙谷二肽濃度檢測(cè)。

1.2.5 α-氨基酸酯酰轉(zhuǎn)移酶全細(xì)胞酶活的測(cè)定

取2 mL菌液，8 000 r/min 離心5 min，去上清，用等體積的生理鹽水洗滌細(xì)胞，用上述方法再次離心，棄上清，留下的菌體直接作為催化底物反應(yīng)的酶源，加入500 μL含有200 mmol/L Gln及200 mmol/L Ala-Ome·HCl 、pH 8.0 的硼酸-NaOH緩沖液(0.1 mol/L)，25 ℃ 反應(yīng)5 min，12 000 r/min離心5 min 終止反應(yīng)，取50 μL反應(yīng)上清測(cè)定丙谷二肽濃度。1個(gè)單位酶活定義為：1 min 內(nèi)生成1 μmol 丙谷二肽所需酶量，單位為U；全細(xì)胞酶活定義為單位體積發(fā)酵液每克干菌體的酶活，單位為U/DCW，其中細(xì)胞干重DCW(g/L)=0.54×OD600。

1.2.6丙谷二肽的檢測(cè)

柱前衍生：取50 μL標(biāo)準(zhǔn)樣品或反應(yīng)液，加入200 μL 甲醇、200 μL 0.1 mmol/L 四硼酸鈉、50 μL衍生劑(20 mg鄰苯二甲醛，1.8 mL甲醇，200 μL 0.1 mmol/L四硼酸鈉，20 μL β-巰基乙醇，混勻)混勻，于37 ℃ 水浴25 min，加入500 μL 流動(dòng)相，過(guò)0.22 μm有機(jī)系膜。

HPLC檢測(cè)色譜條件：色譜柱 SB-AQ C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱溫 35 ℃ ；流動(dòng)相：磷酸緩沖液(12.5 mmol/L , pH 7.2) ∶乙腈 = 9∶1；流速 1 mL/min；激發(fā)波長(zhǎng) 338 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 450 nm。

1.2.7發(fā)酵優(yōu)化

(1)發(fā)酵培養(yǎng)基組分的單因素優(yōu)化：包括葡萄糖的濃度、硫酸銨的濃度、有機(jī)氮源(酵母提取物∶胰蛋白胨 = 1∶1)的濃度以及硫酸鎂的濃度。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基組分的正交實(shí)驗(yàn)：根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果，選取葡萄糖、硫酸銨、有機(jī)氮源(酵母提取物∶胰蛋白胨 = 1∶1)和硫酸鎂4個(gè)因素，按L9(34)正交表實(shí)驗(yàn)。

(3)發(fā)酵溫度優(yōu)化：發(fā)酵溫度分別為23、25、27、29、31、33 ℃ 。

(4)反應(yīng)條件優(yōu)化：優(yōu)化了反應(yīng)pH (7.5、8.0、8.5、9.0)、反應(yīng)溫度(20、25、30、35 ℃ )及兩種底物濃度配比(丙氨酸甲酯鹽酸鹽濃度為200 mmol/L時(shí)，谷氨酰胺的添加濃度為50、100、150、200、250 mmol/L)。

2結(jié)果與分析

2.1大腸桿菌中pepD和pepN基因的敲除

據(jù)報(bào)道，在大腸桿菌中，分別由pepA、pepB、pepD、pepN編碼的4種肽酶對(duì)二肽具有廣譜降解活性[15]。一方面，KAZUHIKO T等人通過(guò)構(gòu)建大腸桿菌pepA、pepB、pepD、pepN的單缺失型、雙缺失型及多缺失型突變菌株并加入丙谷二肽培養(yǎng)，探究單個(gè)或多個(gè)二肽酶和氨肽酶的失活對(duì)丙谷二肽降解的影響，結(jié)果表明，這些突變菌株中的丙谷二肽殘留量較野生菌都有不同程度的提高[10]，說(shuō)明這些肽酶對(duì)丙谷二肽都有不同程度的降解活性。另一方面，pepD編碼的肽酶D是一種二肽酶，其只對(duì)二肽有降解活性[16]，pepN編碼的氨肽酶是大腸桿菌中主要的氨肽酶[17]，因此本實(shí)驗(yàn)首先考慮在大腸桿菌催化生產(chǎn)丙谷二肽的過(guò)程中，敲除pepD、pepN基因，以期減少宿主大腸桿菌對(duì)產(chǎn)物丙谷二肽的降解。本文采用λ Red同源重組系統(tǒng)先后敲除大腸桿菌JM109中的pepD、pepN基因，構(gòu)建雙缺失型突變菌株JM109(ΔpepDΔpepN)，作為SAET表達(dá)的宿主菌株。

首先分別制備pepD和pepN基因敲除的打靶片段。以pKD4為模板，分別以DP1和DP2、NP1和NP2為引物對(duì)，擴(kuò)增出一段兩端分別與pepD、pepN基因兩端序列同源的，中間為Kan抗性基因的DNA片段，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，片段大小與理論值1601 bp、1572 bp一致(圖1)，經(jīng)過(guò)DpnI處理及膠回收后，所得的產(chǎn)物即可作為JM109中pepD、pepN基因敲除用打靶片段。

A-pepD基因敲除用打靶片段；B-pepN基因敲除用打靶片段圖1　基因敲除用打靶片段的電泳分析Fig.1　Electrophoresis analysis of PCR products

將打靶片段分別電轉(zhuǎn)入含有pKD46的大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，涂布Kan/LB平板。挑選平板上長(zhǎng)出的單菌落做菌落PCR鑒定，分別以DY1和DY2、NY1和NY2為引物，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小。若以大腸桿菌野生型菌株為模板時(shí)，擴(kuò)增出的條帶理論大小分別為1 458 bp、2 859 bp；若Kan抗性基因替代pepD、pepN基因整合到大腸桿菌的基因組上時(shí)，擴(kuò)增出的條帶理論大小為1 589 bp、1 835 bp。通過(guò)平板篩選及菌落PCR鑒定(圖2)可以證明pepD、pepN基因被成功敲除。再將質(zhì)粒pCP20分別轉(zhuǎn)化至陽(yáng)性重組子中，通過(guò)42 ℃ 高溫誘導(dǎo)完成Kan抗性基因的消除及pKD46與pCP20質(zhì)粒的丟失。并分別以DY1和DY2、NY1和NY2為引物做菌落PCR，以進(jìn)一步確認(rèn)Kan抗性基因的消除。若Kan抗性基因從基因組上消除，擴(kuò)增出的條帶理論大小分別為236 bp、441 bp(圖3)。從圖中可以看出，各個(gè)條帶的大小均與理論值一致，即成功敲除大腸桿菌JM109中pepD和pepN基因，構(gòu)建了突變菌株JM109(ΔpepDΔpepN)。

圖2　大腸桿菌JM109野生型菌株及基因缺失型菌株P(guān)CR電泳圖譜Fig.2 　Identification of E.coli JM109 gene knockout by colony PCR(A)泳道1：DL5000 DNA Marker；泳道2、3、4：以JM109野生型菌株為模板的菌落PCR；泳道5、6、7：以JM109(ΔpepD)為模板的菌落PCR(B)泳道1、2：以JM109(ΔpepDΔpepN)為模板的菌落PCR；泳道3、4：以JM109野生型菌株為模板的菌落PCR；泳道5：DL5000 DNA Marker

圖3　 大腸桿菌JM109基因缺失型菌株及Kan抗性消除菌株P(guān)CR電泳圖譜Fig.3 　Identification of the elimination of Kan resistance gene by colony PCR(A)泳道1：DL5000 DNA Marker；泳道2：空白對(duì)照；泳道3、4：以JM109(ΔpepD)為模板的菌落PCR；泳道5、6：以去除Kan抗性基因菌株為模板的菌落PCR(B)泳道1：DL5000 DNA Marker；泳道2：JM109野生型菌株為模板的菌落PCR；泳道3：以JM109(ΔpepDΔpepN)為模板的菌落PCR；泳道5、6：以去除Kan抗性基因菌株為模板的菌落PCR

2.2敲除菌與原菌全細(xì)胞酶活比較

將本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的含SAET的質(zhì)粒載體pAMP-phoC-SAET(圖4)分別轉(zhuǎn)化至野生菌和敲除菌中，比較SAET在野生菌和敲除菌中的表達(dá)情況。如表3所示，首先，敲除菌較野生菌，其菌體生長(zhǎng)較慢，有報(bào)道pepA、pepB、pepD、pepN缺失型突變株的生長(zhǎng)比野生型菌株慢[18]，一些小肽(如含亮氨酸)會(huì)抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)[15]。綜合考慮，肽酶缺失導(dǎo)致胞內(nèi)一些肽類(lèi)的累積可能抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)，但目前還不清楚這些肽酶對(duì)胞內(nèi)二肽的整體降解有多大影響[19]。其次，pepD、pepN雙缺失型菌株，其全細(xì)胞酶活較野生菌提高了0.29倍，原因可能是雙突變菌株的生長(zhǎng)較野生菌慢，在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，其OD600也較低，進(jìn)而影響了DCW的值；肽酶D和氨肽酶的失活減少了丙谷二肽的分解，使突變菌株的酶活有所提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野生菌的pepD和pepN基因的雙敲除，對(duì)SAET催化產(chǎn)丙谷二肽有一定的正向促進(jìn)作用。

圖4　SAET 表達(dá)載體Fig.4　SAET expression vector

重組E.coliOD600值酶活性(U/DCW)JM109/pAMP-phoC-SAET9.1772.33JM109(ΔpepD)/pAMP-phoC-SAET8.0273.5JM109(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET7.9493.33

2.3大腸桿菌生長(zhǎng)曲線及種齡的選擇

種齡對(duì)微生物發(fā)酵周期有著重要影響，發(fā)酵中一般選擇菌種生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)中后期為宜。挑取JM109 (ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET單菌落接種于LB中，菌種OD600與時(shí)間的關(guān)系如圖5所示。菌種接入LB后，4 h開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，4～12 h為菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。因此，選擇最佳種齡時(shí)間為10 h。

圖5　重組菌JM109/(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET生長(zhǎng)曲線Fig.5　The growth curve of recombinant E. coli JM109/(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET

2.4重組大腸桿菌發(fā)酵曲線及發(fā)酵時(shí)間的選擇

為了確定合適的發(fā)酵時(shí)間，繪制了重組大腸桿菌的發(fā)酵曲線。如圖6所示，在發(fā)酵36 h之后，丙谷二肽產(chǎn)量沒(méi)有明顯的提高，因此，將重組大腸桿菌的發(fā)酵時(shí)間定為36 h。

圖6　重組菌JM109/(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET發(fā)酵曲線Fig.6　The fermentation curve of recombinant E. coli JM109(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET

2.5發(fā)酵培養(yǎng)基單因素優(yōu)化

2.5.1葡萄糖濃度的優(yōu)化

在大腸桿菌中，葡萄糖過(guò)量會(huì)導(dǎo)致溢流效應(yīng)，葡萄糖經(jīng)EMP途徑后由代謝支路溢出生成乙酸[20]，而乙酸的積累會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)和蛋白的表達(dá)[21]。對(duì)葡萄糖濃度的優(yōu)化(圖7)結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖濃度小于8 g/L時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量明顯降低；當(dāng)葡萄糖濃度校大于8 g/L時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量逐漸降低，因此，葡萄糖的最佳濃度為8 g/L。

圖7　葡萄糖添加量的優(yōu)化Fig.7　The optimization of carbon source concentration

2.5.2氮源濃度的優(yōu)化

培養(yǎng)基中的氮源能為微生物提供生長(zhǎng)所必需的核苷酸、維生素和礦物質(zhì)元素等。本文優(yōu)化了無(wú)機(jī)氮源硫酸銨的添加濃度，如圖8A顯示，當(dāng)硫酸銨添加濃度大于3 g/L時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量逐漸降低，因此，硫酸銨添加量定為3 g/L。

與無(wú)機(jī)氮源相比，有機(jī)氮源除含有豐富的蛋白質(zhì)、肽類(lèi)、游離的氨基酸以外，還含有少量的糖類(lèi),脂肪和生長(zhǎng)因子等。據(jù)報(bào)道，以酵母提取物與胰蛋白胨為有機(jī)氮源時(shí)，兩種氮源以1∶1的比例添加時(shí)比單獨(dú)添加一種有機(jī)氮源丙谷二肽產(chǎn)量高[13]，因此在優(yōu)化有機(jī)氮源添加量時(shí)，以1∶1的比例添加。由圖8B可知，當(dāng)有機(jī)氮源為30 g/L時(shí)，即酵母提取物與胰蛋白胨添加量分別為15 g/L時(shí)，丙谷二肽濃度最高。

A-無(wú)機(jī)氮源硫酸銨濃度優(yōu)化；B-有機(jī)氮源濃度優(yōu)化(酵母提取物∶胰蛋白胨=1∶1)圖8　氮源添加量的優(yōu)化Fig.8　The optimization of nitrogen source concentration

2.5.3硫酸鎂質(zhì)量濃度的優(yōu)化

Mg2+處于離子狀態(tài)時(shí)，是許多重要酶的激活劑，MgSO4質(zhì)量不但影響基質(zhì)的氧化，還影響蛋白質(zhì)的合成，而硫可以為菌體合成含硫蛋白質(zhì)提供硫源。本實(shí)驗(yàn)考察了MgSO4質(zhì)量濃度對(duì)丙谷二肽產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖9，當(dāng)MgSO4質(zhì)量濃度小于2 g/L時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量無(wú)明顯變化，MgSO4質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量相對(duì)較高；當(dāng)MgSO4質(zhì)量補(bǔ)加量超過(guò)2 g/L時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量明顯降低。

圖9　MgSO4質(zhì)量濃度的優(yōu)化Fig.9　The optimization of MgSO4 concentration

2.5.4培養(yǎng)基組分的正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上單因素優(yōu)化結(jié)果，考察發(fā)酵培養(yǎng)基各組分間的交互作用，選取葡萄糖、硫酸銨、有機(jī)氮源(酵母提取物∶胰蛋白胨=1∶1)、MgSO4這4因素做正交實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素3個(gè)水平，本實(shí)驗(yàn)選取L9(34)正交表試驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表4，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4　正交試驗(yàn)因素水平表

表5　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Ti為各因素同一水平下丙谷二肽產(chǎn)量總和；Ki為T(mén)i平均值；R為極差，表示各因素不同水平下丙谷二肽產(chǎn)量總和的最大差值。

由極差R值可知各因素對(duì)丙谷二肽產(chǎn)量的影響順序?yàn)椋毫蛩徭V>有機(jī)氮源>硫酸銨>葡萄糖；得到各因素的最佳搭配為：A3B1C1D1。最佳培養(yǎng)基是：12 g/L葡萄糖、1 g/L硫酸銨、10 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、3 g/L磷酸二氫鉀、1 g/L磷酸氫二鉀、0.2 g/L硫酸鎂。經(jīng)發(fā)酵驗(yàn)證，正交實(shí)驗(yàn)所確定的最佳搭配，丙谷二肽產(chǎn)量為5.08 g/L，是優(yōu)化前(3.06 g/L)的1.66倍。

2.6發(fā)酵溫度優(yōu)化

培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和目的基因的表達(dá)有重要影響，溫度除了直接影響發(fā)酵過(guò)程中各種反應(yīng)速率外，還通過(guò)改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，間接影響菌體的生物合成。如圖10所示，發(fā)酵溫度對(duì)丙谷二肽的催化生產(chǎn)有較大影響，當(dāng)發(fā)酵溫度為27 ℃ 時(shí)，所對(duì)應(yīng)的丙谷二肽濃度最高，當(dāng)發(fā)酵溫度高于27 ℃ 時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量快速下降。

圖10　培養(yǎng)溫度的優(yōu)化Fig.10　The optimization of fermentation temperature

2.7酶催化反應(yīng)條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)以發(fā)酵菌體為粗酶源，催化L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺合成丙谷二肽。酶促反應(yīng)條件是影響酶活性的重要因素，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化催化反應(yīng)條件，探索產(chǎn)SAET的最適酶促反應(yīng)條件。

2.7.1反應(yīng)pH優(yōu)化

酶的穩(wěn)定性與其所處環(huán)境的pH緊密相關(guān)，環(huán)境的pH會(huì)影響酶分子中相關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)，對(duì)反應(yīng)體系pH值的優(yōu)化結(jié)果如圖11，反應(yīng)體系pH值為8.5時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量最高，因此將酶促反應(yīng)的最適pH定為8.5。

圖11　反應(yīng)液pH的優(yōu)化Fig.11　The optimization of reaction liquid pH

2.7.2反應(yīng)溫度優(yōu)化

溫度對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一方面是溫度升高時(shí)，反應(yīng)速率加快；另一方面由于酶是蛋白質(zhì)，隨著溫度的升高，酶蛋白容易逐漸變性而失活，引起酶反應(yīng)速率的下降。不同溫度對(duì)SAET催化生成丙谷二肽的影響結(jié)果如圖12，當(dāng)反應(yīng)溫度為25 ℃ 時(shí)，丙谷二肽的生成量最高。

圖12　反應(yīng)溫度的優(yōu)化Fig.12　The optimization of reaction temperature

2.7.3 底物濃度及其配比優(yōu)化

底物濃度和配比同樣對(duì)酶促反應(yīng)有著重要影響，為了確定最適的底物添加量，將Ala-OMe·HCl固定在200 mmol/L，測(cè)定不同Gln濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響，考察底物濃度對(duì)SAET催化產(chǎn)丙谷二肽的影響，結(jié)果如圖13，隨著Gln添加量的加大，丙谷二肽生成量也不斷提高，在底物濃度比為200∶200 時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量最高。當(dāng)繼續(xù)增加Gln的添加量時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量不再提高，因此將Ala-OMe·HCl和Gln最適底物濃度及配比定為200∶200。

圖13　底物配比的優(yōu)化Fig.13　The optimization of the ratio of the two substrates,AlaOMe·HCl and Gln

3結(jié)論

Ala-Gln不僅具有Gln的各種重要的生理功能，且穩(wěn)定性好，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究在本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建的SAET表達(dá)菌株基礎(chǔ)上，敲除了宿主大腸桿菌JM109中的肽酶D與氨肽酶對(duì)應(yīng)的編碼基因pepD與pepN，構(gòu)建重組大腸桿菌JM109(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET。突變菌株的全細(xì)胞酶活較野生菌提高了0.29倍。并進(jìn)一步優(yōu)化了重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丙谷二肽的發(fā)酵培養(yǎng)基組分、發(fā)酵溫度及反應(yīng)條件，在最優(yōu)條件下，丙谷二肽產(chǎn)量達(dá)到了14.51 g/L反應(yīng)液，是優(yōu)化前的4.74倍(3.06 g/L)，是國(guó)內(nèi)已知生物酶法生產(chǎn)丙谷二肽的最高水平，為丙谷二肽的工業(yè)化生產(chǎn)及國(guó)產(chǎn)化提供了技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

[1]張軍民. 條件性必需氨基酸谷氨酰胺研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)飼料, 1999(17): 22-24.

[2]賈秀紅, 韓琳. 谷氨酰胺的臨床應(yīng)用[J]. 濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2008, 31(5): 368-370.

[3]柯遠(yuǎn). 丙谷二肽合成工藝改進(jìn)[D]. 濟(jì)南:濟(jì)南大學(xué), 2013.

[4]王歲歲, 梁琨. 谷氨酰胺對(duì)早產(chǎn)兒胃腸道屏障及免疫功能的影響[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2010, 16(4): 521-523.

[5]馬爽, 王家慶, 王虹玲,等. 谷氨酰胺的生理作用及應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014(26): 9 172-9 173.

[6]鄒健, 王康寧. 谷氨酰胺對(duì)動(dòng)物腸道結(jié)構(gòu)和免疫功能的影響[J]. 飼料工業(yè), 2006(3): 17-22.

[7]周榮艷. 飼料中谷氨酰胺及丙氨酰谷氨酰胺的測(cè)定[J]. 飼料研究, 2004(1): 30-32.

[8]金輝. 1.谷氨酰胺二肽的合成工藝研究 2.非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥—扎托洛芬合成研究[D]. 成都:四川大學(xué), 2003.

[9]唐果. N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的合成與反應(yīng)研究[D]. 廈門(mén):廈門(mén)大學(xué), 2004:15-17.

[10]KAZUHIKO T, SSHIN-ICHI H. Fermentative production ofL-alanyl-L-glutamine by a metabolically engineeredEscherichiacolistrain expressingL-amino acid-ligase[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2007, 73(20): 6 378-6 385.

[11]HUBER S, ROOSJE PJ, JANDA J, et al. Gene cloning and characterization of α-amino acid ester acyl transferase inEmpedobacterbrevisATCC14234 andSphingobacteriumsiyangensisAJ2458[J]. Veterinary Immunology & Immunopathology, 2011, 75(11): 2 087-2 092.

[12]HIRAO Y, MIHARA Y, KIRA I, et al. Enzymatic production ofL-alanyl-L-glutamine by recombinantE.coliexpressing α-amino acid ester acyltransferase fromSphingobacteriumsiyangensis[J]. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2014, 77(3): 618-623.

[13]何艷春. 產(chǎn)α-氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶重組大腸桿菌的構(gòu)建及發(fā)酵優(yōu)化[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué), 2015.

[14]DATSENKO K A, WANNER B L. One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichiacoliK-12 using PCR products[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(12): 6 640-6 645.

[15]LAZDUNSKI AM. Peptidases and proteases ofEscherichiacoliandSalmonellatyphimurium[J]. Fems Microbiology Reviews, 1989, 63(3): 265-276.

[16]KLEIN J, HENRICH B, PLAPP R. Cloning and expression of thepepDgene ofEscherichiacoli[J]. Journal of General Microbiology, 1986, 132(8): 2 337-2 343.

[17]DILIP C, DIPANKAR N. PepN is the major aminopeptidase inEscherichiacoli: insights on substrate specificity and role during sodium-salicylate-induced stress[J]. Microbiology, 2004, 149(Pt 12): 3 437-3 447.

[18]HERMSDORF C L, SIMMONDS S, SAUNDERS A. Soluble di‐ and aminopeptidases inEscherichiacoliK-12 dispensible enzymes[J]. European Journal of Allergy & Clinical Immunology, 1979, 13(13): 146-151.

[19]MILLER C G, SCHWARTZ G. Peptidase-deficient mutants ofEscherichiacoli[J]. Journal of Bacteriology, 1978, 135(2): 603-611.

[20]KO YF, BENTLEY WE, WEIGAND WA. An integrated metabolic modeling approach to describe the energy efficiency ofEscherichiacolifermentations under oxygen-limited conditions: Cellular energetics, carbon flux, and acetate production[J]. Biotechnology & Bioengineering, 1993, 42(7): 843-853.

[21]LULI G W, STROHL W R. Comparison of growth, acetate production, and acetate inhibition ofEscherichiacolistrains in batch and fed-batch fermentations[J]. Applied & Environmental Microbiology, 1990, 56(4): 1 004-1 011.

The knockout of genespepDandpepNof recombinantEscherichiacoliproducingL-alanyl-L-glutamine and optimization of its fermentation conditions

LIU Pei-pei, ZHANG Zhen-yu, SUN Fu-bao, ZHOU Hao

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education,Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology,Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

ABSTRACTL-alanyl-L-glutamine is widely recognized as the L-glutamine carrier and applied in the field of clinical medicine and nutrition.In order to interrupt the degradation of proglumetacin dipeptide in E. coli during the biosynthesis process, the λ Red homologous recombination system was employed to knockout the peptidase D and aminopeptidase corresponding coding genes. Compared with wild-type strains, double knockout mutant strain of whole cell enzyme activity increased 0.29 times. The optimized medium composition contained (g/L): glucose 12，yeast extract 10，bacto tryptone 10，(NH4)2SO4 1，KH2PO4 3，K2HPO4 1，MgSO4 0.2. The optimal cultivation temperature is 27 ℃; the most appropriate reaction conditions are: Gln 200 mmol/L, Ala-Ome·HCl 200 mmol/L, reaction pH value is 8.5, reaction temperature is 25 ℃. Finally, after 36 h fermentation under the optimal conditions, the yield is 14.51 g/L reaction liquid which is 4.74 fold that of the initial codition.

Key wordsL-alanyl-L-glutamine; Escherichia coli; enzymatic; gene knockout; λ Red homologous recombination; fermentation optimization

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606002

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(30970058)；國(guó)家自然科學(xué)基金(21176106)；工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))開(kāi)放課題基金(KLIB-ZR200801)

收稿日期：2016-01-15，改回日期：2016-03-01

第一作者：碩士研究生(張震宇教授為通訊作者,E-mail:zhangzy@jiangnan.edu.cn)。