近日節(jié)律紊亂對小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的影響*

黃昶荃　李永紅　關(guān)俊文　劉清秀

(1.綿陽市第三人民醫(yī)院老年綜合科，四川 綿陽　621000；2.成都信息工程大學(xué)，四川 成都　610103；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川 成都　610041)

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論著

近日節(jié)律紊亂對小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的影響*

黃昶荃1李永紅2關(guān)俊文3劉清秀1

(1.綿陽市第三人民醫(yī)院老年綜合科，四川 綿陽621000；2.成都信息工程大學(xué)，四川 成都610103；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川 成都610041)

摘要目的：用不規(guī)律光暗循環(huán)建立小鼠近日節(jié)律紊亂動(dòng)物模型，觀察近日節(jié)律紊亂對小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的影響。方法：將40只雄性ICR小鼠(8-10 周齡，體質(zhì)量18-20 g)隨機(jī)分成節(jié)律正常組和節(jié)律紊亂組，每組20只。節(jié)律正常組給予光照12小時(shí)和12小時(shí)黑暗。節(jié)律紊亂組給予光照3小時(shí)和黑暗5小時(shí)與光照5小時(shí)和黑暗3小時(shí)交替。6個(gè)月后，水迷宮測小鼠的認(rèn)知功能、電生理技術(shù)觀測海馬長時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation，LTP)現(xiàn)象、電鏡檢測小鼠海馬細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：與節(jié)律正常組比較，節(jié)律紊亂組小鼠逃避潛伏時(shí)間顯著延長、穿越中心區(qū)域次數(shù)顯示中央?yún)^(qū)次數(shù)顯著減少(P<0.05)。節(jié)律紊亂組小鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)模糊，突觸前、后膜軸漿溶解，突觸小泡明顯減少，突觸后膜腫脹，變薄，突觸間隙變窄，海馬突觸LTP發(fā)生率和峰值均顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：近日節(jié)律紊亂可導(dǎo)致小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞、神經(jīng)傳導(dǎo)功能下降、小鼠認(rèn)知功能受損。

關(guān)鍵詞：近日節(jié)律；海馬結(jié)構(gòu)和功能；認(rèn)知功能

生物體內(nèi)存在以近24小時(shí)周期的生物節(jié)律，哺乳動(dòng)物都證明其節(jié)律可以被光暗循環(huán)(LD循環(huán))所導(dǎo)引[1-3]。現(xiàn)已明確近日節(jié)律紊亂將導(dǎo)致動(dòng)物的認(rèn)知功能受損，但其機(jī)制還不完全清楚[4]。本研究用LD循環(huán)3/5和5/3建立節(jié)律紊亂模型，檢測小鼠的海馬的電鏡超微結(jié)構(gòu)、海馬神經(jīng)元突觸傳遞的長時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation，LTP)和學(xué)習(xí)記憶能力，以明確近日節(jié)律紊亂導(dǎo)致認(rèn)知功能受損及其機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物分組及處理

40只雄性ICR小鼠(8-10周齡，體重18-20 g左右)先適應(yīng)LD 12/12(光照12 h，黑暗12 h)光暗循環(huán)2周，再隨機(jī)分為節(jié)律正常組和節(jié)律紊亂組，每組 20只。節(jié)律正常組和節(jié)律紊亂組分別在LD12/12和LD3/5(光照3 h，黑暗5 h)和5/3光照5 h，黑暗3 h)交替下飼養(yǎng)6個(gè)月。

1.2水迷宮測試

應(yīng)用 Morris水迷宮測試小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶情況，包括定位航行實(shí)驗(yàn)、記憶保留實(shí)驗(yàn)、空間探索實(shí)驗(yàn)和可見平臺(tái)實(shí)驗(yàn)。

1.3海馬神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)檢測

水迷宮實(shí)驗(yàn)完成兩天后，隨機(jī)取各組小鼠5只，斷頭處死，迅速取出雙側(cè)海馬，切取1 mm3組織塊迅速放入4℃ 2.5 %的戊二醛中固定，24 h后洗凈，再二次固定于1%的四氧化鋨60 min。酒精梯度脫水，丙酮酸置換，浸透，Epon812包埋，聚合，制成超薄切片，酸雙氧鈾，檸檬酸鉛復(fù)染。透射電鏡下觀察海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。

1.4海馬長時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation, LTP)現(xiàn)象

小鼠斷頭處死后，取出一側(cè)海馬，順海馬槽纖維的走向連續(xù)切片，片厚400-500 μm。迅速將其移至浴槽尼龍網(wǎng)上，隨之保證持續(xù)的恒溫人工腦脊液(Artificial cerebrospinal fluid，ACSF)灌流。腦片的供氧以界面式進(jìn)行。即讓95%O2與5%CO2的混合氣體通過外室熱水加熱、濕化再彌散于腦片的表面，供氧量為1dl·min-1。腦片在孵育0.5 h后，開始灌注含F(xiàn)luo-3(AM)的ACSF。Fluo-3的濃度為40 μmol·L-1。灌流1 h，灌流量約1～1.5 ml，采用間歇灌流方式。標(biāo)記完畢后用ACSF沖洗0.5 h，隨后開始電生理記錄。本實(shí)驗(yàn)刺激電極置于來自CA3區(qū)錐體細(xì)胞的Schaffer側(cè)枝上，記錄電極置于CA1區(qū)的放射層，所記錄的電活動(dòng)是Schaffer側(cè)枝CA1區(qū)錐體細(xì)胞的場興奮性突觸后電位(Field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)。記錄時(shí)，先行測試刺激(Test stimulation，TS)，測試刺激每5～10 min一次。以觀察fEPSP是穩(wěn)定，待其穩(wěn)定15 min后，再行條件刺激(Conditioning stimulation，CS)。條件刺激10 min后，檢測LTP是否產(chǎn)生。檢測LTP后，取出腦片立即進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察。觀察時(shí)注意調(diào)整聚焦平面，以獲取最佳效果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

節(jié)律紊亂組避潛伏時(shí)間顯著長于節(jié)律正常組(P<0.05)，穿越中心次數(shù)顯著少于節(jié)律正常組(P<0.05)。表明節(jié)律紊亂組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力顯著減退，見表1。

表1　各組小鼠morris水迷宮測試結(jié)果

注：與正常組比較，*P<0.05。

2.2小鼠海馬突觸超微結(jié)構(gòu)改變

電鏡下節(jié)律正常組小鼠海馬突觸前后結(jié)構(gòu)清晰，突觸前膜小泡，突觸間隙清晰可見。節(jié)律紊亂組小鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)模糊，突觸前、后膜軸漿溶解，突觸小泡明顯減少，突觸后膜腫脹、變薄、突觸間隙變窄。

2.3小鼠離體腦片海馬LTP

小鼠離體腦片電生理技術(shù)檢測海馬LTP檢測結(jié)果顯示節(jié)律紊亂組小鼠LTP發(fā)生率和LTP發(fā)生的高峰值顯著低于節(jié)律正常組，見表2。

表2　近日節(jié)律正常與光暗循環(huán)紊亂小鼠離海馬LTP比較±SD，n=15)

注：與正常組比較，*P<0.05。

3討論

本研究用不同規(guī)則光暗循環(huán)建立近日節(jié)律紊亂小鼠的動(dòng)物模型，探討近日節(jié)律紊亂導(dǎo)致認(rèn)知功能可能受損及其機(jī)制。結(jié)果顯示，近日節(jié)律紊亂小鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退，存在一定的認(rèn)知功能受損，同時(shí)近日節(jié)律紊亂海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)受損和海馬受刺激后發(fā)生的長程動(dòng)作電位發(fā)生次數(shù)減少和LTP波幅降低。

輕度認(rèn)知功能障礙(Mild Cognitive Impairment，MCI)是介于正常與癡呆之間的一種認(rèn)知功能損害或過渡狀態(tài)。以記憶障礙為突出表現(xiàn)，可有其他認(rèn)知功能的減退，但日常活動(dòng)能力不受影響，未達(dá)到符合癡呆的診斷標(biāo)準(zhǔn)。近年報(bào)道認(rèn)為其是阿爾茨海默病(AD)的超早期階段[6]。有文獻(xiàn)表明每年約10%～15%的MCI患者發(fā)展為癡呆[7]。因此，MCI可能是癡呆的高危因素。由于癡呆為不可逆損害，而MCI經(jīng)積極治療可以改善患者生活質(zhì)量，可能實(shí)現(xiàn)對老年癡呆的早期診斷及早期干預(yù)，成為近年來神經(jīng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

生物體內(nèi)存在以近24小時(shí)的周期變化的生物節(jié)律?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)證實(shí)生物節(jié)律與認(rèn)知功能關(guān)系密切，前期研究發(fā)現(xiàn)光/暗5/5、12/12(近日節(jié)律)和22/22h干預(yù)小鼠6月，12/12(近日節(jié)律)的學(xué)習(xí)記憶能力好于其他兩組。表明保持規(guī)律光照，但周期長短不同，近日節(jié)律(24小時(shí)為周期)狀態(tài)下學(xué)習(xí)記憶能力最好。本研究發(fā)現(xiàn)，指規(guī)律光照下，小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯然好于不規(guī)律率光照小鼠。

突觸是是神經(jīng)傳遞結(jié)構(gòu)，突觸前膜受刺激后突觸后膜的反應(yīng)是顯示突觸后膜的長程電位活動(dòng)是反映神經(jīng)信息在不同神經(jīng)元傳遞效率的指標(biāo)。本文結(jié)果顯示以24小時(shí)為周期不規(guī)律光照誘導(dǎo)近日節(jié)律紊亂動(dòng)物可損傷突觸的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元間信息傳遞效率降低，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)物的認(rèn)知功能受損。

綜上所述，在不規(guī)律光照導(dǎo)致的近日節(jié)律紊亂的條件下，小鼠認(rèn)知功能下降，海馬神經(jīng)元信息傳遞結(jié)構(gòu)受損和傳遞效率降低是造成該現(xiàn)象的重要原因之一。

參考文獻(xiàn)

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Influence of circadian disorder on structures and functions of neurons in hippocampus of mice*

Huang Chang-quan1, Li Yong-hong2, Guan Jun-wen3, Liu Qing-xiu1

(1.Department of Geriatrics, The Third People Hospital or Mianyang, Sichuan Mianyang 621000;2.Chengdu University of Information Technology, Sichuan Chengdu 610103;3.West China Hospital, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

AbstractObjective：To study the influence of circadian disorder on structures and functions of neurons in hippocampus of mice. Methods: Forty male ICR (8-10 weeks of age, body mass 18-20 g) were randomly divided into rhythm disorder group and normal rhythm group. The rhythm disorder group was treated with 3 hours light/5 hours dark and 5 hours light/3 hours dark, alternately. The normal rhythm group was treated with 12 light and 12 dark. The intervention maintained six months. Electron microscope was used to detect the mouse hippocampal cell ultrastructure. Morris water maze was used to test mice cognitive function. The brain slice electric physiological techniques were used to detect synapses in the hippocampus LTP effect. Results: The time of escape latency of rhythm disorder group was longer than that of normal rhythm group. The times of through central area of rhythm disorder group was less than that of normal rhythm group. The structure of synapses of hippocampal cell of rhythm disorder group was fuzzy. The axoplasm in anterior-posterior membranes of synapses of rhythm disorder group was dissolved. The synaptic vesicles of rhythm disorder group were decreased. The posterior membranes of synapses of rhythm disorder group were swelled and attenuated. The incidence and crest value of LTP effect f rhythm disorder group were decreased. Conclusion: Circadian rhythm disorder induced by irregular light-dark circle can lead to the structural damage of hippocampal neurons, decrease nerve conduction function and damage the cognitive function in mice.

Key Words:Circadian rhythm; Structures and functions of neurons; Hippocampus; Cognitive function

*基金項(xiàng)目：四川省科技支撐計(jì)劃(編號(hào)：2010FZ0061，2013FZ0051)；四川省杰出青年基金(編號(hào)：2012JQ0050)

作者簡介：黃昶荃，男，研究員，主要從事老年醫(yī)學(xué)的臨床和科研工作，Email：18030990101@163.com。

(收稿日期：2016-5-8)