人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為汗腺樣細(xì)胞過程中microRNA表達(dá)譜差異的分析

陳 艷　趙洪良　譚志軍　趙煥軍　張翠萍　付小兵2，(1．北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科，北京 100700；2．解放軍總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 10085；．解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨皮膚損傷修復(fù)與組織再生北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

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論著

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為汗腺樣細(xì)胞過程中microRNA表達(dá)譜差異的分析

陳 艷1,2趙洪良3譚志軍3趙煥軍3張翠萍3付小兵2，3
(1．北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科，北京 100700；2．解放軍總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100853；3．解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨皮膚損傷修復(fù)與組織再生北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

【摘要】目的：利用微小RNA（microRNA）表達(dá)譜基因芯片檢測(cè)新技術(shù)，尋找人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）分化為汗腺樣細(xì)胞（SGLCs）過程中的關(guān)鍵microRNAs及其介導(dǎo)的分子信號(hào)通路。方法：通過間接培養(yǎng)方法誘導(dǎo)MSCs分化為SGLCs后，利用microRNA基因芯片檢測(cè)，分析MSCs誘導(dǎo)前后以及MSCs、SGLC與正常成人汗腺細(xì)胞（SGCs）之間microRNA差異表達(dá)譜，篩選出其中發(fā)生極其顯著改變的microRNAs，通過microRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件，進(jìn)一步篩選出其中直接靶向與汗腺發(fā)育、干細(xì)胞分化相關(guān)基因的microRNAs及其靶基因。結(jié)果：microRNA表達(dá)譜的差異比對(duì)結(jié)果顯示，SGLCs與MSCs相比，19 個(gè)microRNAs 上調(diào)，49個(gè)microRNAs 下調(diào)；SGCs與MSCs相比，120個(gè)microRNAs 上調(diào)，59個(gè)microRNAs下調(diào)。取SGLCs與MSCs差異表達(dá)譜和SGCs 與MSCs差異表達(dá)譜的交集，發(fā)現(xiàn)37個(gè)microRNAs在以上兩個(gè)差異表達(dá)譜中均出現(xiàn)，其中12個(gè)microRNAs上調(diào)，25個(gè)microRNAs下調(diào)，它們可直接靶向與汗腺發(fā)育和干細(xì)胞分化相關(guān)的CEA等多個(gè)細(xì)胞因子，并參與EDA/ EDAR、NF-κB、Wnt、ERK等多個(gè)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。結(jié)論：通過生物信息學(xué)靶點(diǎn)分析，成功尋找到在MSCs分化為SGLCs的過程中，靶向汗腺發(fā)育和干細(xì)胞分化相關(guān)細(xì)胞因子和信號(hào)通路的關(guān)鍵microRNAs。

關(guān)鍵詞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞汗腺細(xì)胞microRNA表達(dá)譜差異性分析

本實(shí)驗(yàn)室前期研究建立了體外熱休克汗腺細(xì)胞(SGCs)誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化為汗腺樣細(xì)胞（SGLCs）的培養(yǎng)體系，并證明了無汗性外胚葉發(fā)育不良蛋白(EDA-A1)、重組人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉(ITS)等相關(guān)汗腺誘導(dǎo)因子能促進(jìn)汗腺的增殖發(fā)育和誘導(dǎo)分化[1-3]。最近研究表明，大于60%的編碼基因翻譯成蛋白質(zhì)的過程都受微小RNA(microRNA)調(diào)控，檢測(cè)這些關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)的變化對(duì)于研究差異表達(dá)基因的生物學(xué)背景極為重要[4-5]。因此，尋找MSCs誘導(dǎo)成汗腺樣細(xì)胞過程中的關(guān)鍵microRNAs及其靶基因表達(dá)的變化對(duì)闡明該誘導(dǎo)分化過程的分子機(jī)制意義重大。本實(shí)驗(yàn)采用Affymetrix? GeneChip? microRNA 4.0 Arrays芯片，全面檢測(cè)miRBase Release 20數(shù)據(jù)庫(kù)中所有成熟的microRNAs序列，并列出了宿主基因ID、microRNAs的靶基因以及microRNAs的聚類信息，通過表達(dá)譜的差異分析，找出關(guān)鍵調(diào)控的microRNAs、其可能的靶基因以及參與的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑人Affymetrix? GeneChip? microRNA 4.0 Arrays 芯 片 (Affymetrix芯片)、真核雜交試劑盒和雜交、清洗、染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Affymetrix公司。mirVana?microRNA純化試劑盒（AM1561）購(gòu)自美國(guó)Ambion公司。FlashTag? Biotin RNA 標(biāo)記試劑盒購(gòu)自美國(guó) Genisphere 公司。Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó)Life Tech公司。Tris-Cl購(gòu)自美國(guó)Capitalbio 公司。氯仿、異丙醇和乙醇購(gòu)自北京化工廠。高速冷凍離心機(jī)(5900)生產(chǎn)廠家為日本Kubota公司。PCR 儀（PTC-225）為美國(guó)MJ公司生產(chǎn)。Hybridization Oven 640、Fluidics Station 450 和 GeneChip? Scanner 3000為美國(guó)Affymetrix公司生產(chǎn)。一次性RNase-Free吸頭、離心管生產(chǎn)廠家為美國(guó)Axygen公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組當(dāng)Transwell培養(yǎng)板下室的汗腺細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%～80%融合后，上室中加入培養(yǎng)的第3代MSCs，利用Transwell透明聚酯膜培養(yǎng)板，按參考文獻(xiàn)[3]的誘導(dǎo)方法，進(jìn)行汗腺熱休克、間接共培養(yǎng)，并添加EDA-A1、EGF和ITS等系列誘導(dǎo)因子。在MSCs加入到Transwell透明聚酯膜培養(yǎng)板上室的同時(shí)，取同批次MSCs，于6孔組織培養(yǎng)板中，以MSCs培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，作為MSCs平行對(duì)照組；同樣，在汗腺團(tuán)加入到transwell透明聚酯膜培養(yǎng)板下室的同時(shí)，取同批次汗腺團(tuán)，于6孔組織培養(yǎng)板中，以SGCs培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，作為SGCs平行對(duì)照組。

1.3MicroRNA芯片檢測(cè)樣本制備熱休克SGC 與MSCs間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)10 d后，收集上室誘導(dǎo)后的SGLCs。同時(shí)，分別收集未經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs平行對(duì)照組和SGCs平行對(duì)照組細(xì)胞。用 1×PBS沖洗細(xì)胞3次，晾干。每 1×107個(gè)細(xì)胞加入 1 ml Trizol，利用氯仿-異丙醇-乙醇分別提取3組樣本的總 RNA。

1.4MicroRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)

1.4.1實(shí)驗(yàn)原理首先將提取的待測(cè)樣品總RNA進(jìn)行定量和完整性質(zhì)檢，然后利用microRNA純化成套裝置進(jìn)一步純化獲取microRNA，再利用生物素進(jìn)行microRNA標(biāo)記、雜交、檢測(cè)。MicroRNA表達(dá)譜檢測(cè)的主要步驟包括：①poly A 加尾：通過 poly A 聚合酶的作用，在小RNA 的 3’端進(jìn)行 poly A 加尾；②連接3DNA dendrimer：通過連接酶的引導(dǎo)作用，將帶有生物素標(biāo)記的3DNA dendrimer 連接到上述已加尾RNA 的 poly A 尾巴上；③對(duì)Affymetrix芯片進(jìn)行雜交、清洗染色、掃描檢測(cè)熒光及數(shù)據(jù)結(jié)果分析。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.2.1總RNA的質(zhì)檢和純化按前述方法采用Trizol 試劑提取各樣本的總 RNA，然后進(jìn)行RNA定量（紫外分光光度計(jì)或Qubit等方法）和RNA完整性檢測(cè)（瓊脂糖凝膠電泳或Agilent2100檢測(cè)）；使用mirVana? microRNA 純化試劑盒（AM1561）對(duì)總 RNA進(jìn)行純化。

1.4.2.2Poly A加尾①稀釋ATP mix：對(duì)于起始樣本量為1 μg 的總RNA，取1支1.5 ml 的EP管，加入500 μl 1 mmol/L 的Tris-Cl和1 μl 的ATP mix，冰浴中放置。②配制RNA spike control混合物；另取200 μl EP 管1支，加入1 μg 經(jīng)純化處理的樣本總RNA，用無RNA酶的水稀釋至8 μl，再加入RNA Spike Control Oligos 2 μl，冰浴中放置。③配制Poly(A) Tailing Mix 5 μl：10倍體積的反應(yīng)緩沖液1.5 μl，25 mmol/L MnCl21.5 μl, 上述稀釋的 ATP mix 1 μl，PAP 酶1 μl，利用移液器將其加入至上述配置的10 μl RNA spike control的混合物中，冰浴中放置。④將盛有上述準(zhǔn)備好樣品的EP管放入PCR儀中，37 ℃ 15 min，4 ℃保存。

1.4.2.3生物素標(biāo)記在上述反應(yīng)后的15 μl 體系中，使用移液槍加入5×Flash Tag Ligation Mix Biotin 4 μl；然后往上述體系中加入T4 DNA Ligase 2 μl，這時(shí)終體積達(dá)到21 μl，使所有溶液管底集中；PCR反應(yīng)：25 ℃ 30 min，4 ℃保存；向EP管中加入終止液2.5 μl終止反應(yīng)。

1.4.2.4芯片雜交①預(yù)先取出芯片，室溫下平衡若干小時(shí)。②配制雜交反應(yīng)體系： 20倍濃縮液的真核生物雜交對(duì)照在使用前需進(jìn)行65 ℃變性處理5 min。配制單張芯片微陣列所需的雜交混合液81.7 μl：2×雜交液50 μl，27.5%的甲酰胺15 μl，DMSO 10 μl，20倍濃縮液的真核生物雜交對(duì)照（bioB, bioC, bioD, cre）5 μl，寡核苷酸對(duì)照B2（3 nmol/L）1.7 μl。③將上述雜交體系于99 ℃恒溫金屬浴溫育5 min， 45 ℃恒溫金屬浴溫育 5 min；放入高速微量離心機(jī)中13 200 r/min離心5 min。④芯片加樣：根據(jù)不同的芯片類型加入相應(yīng)體積的雜交液，并用標(biāo)簽紙做好標(biāo)記；芯片放在雜交爐中（保持水平放置）進(jìn)行旋轉(zhuǎn)雜交：48 ℃，60 r/min 16 h。

1.4.2.5芯片清洗、染色、檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析①雜交完成后，棄盡雜交液，注入Wash Buffer A 。②使用 Affymetrix? GeneChip? Commol/Land Console? Software（AGCC軟件）的如下程序?qū)π酒M(jìn)行清洗、染色處理:清洗#1，25 ℃，清洗緩沖液A，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)混合2次；清洗#2，50 ℃，清洗緩沖液B，8個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)混合15次；染色#1，25 ℃，染料1，染色探針微陣列，10 min；染色后清洗，30 ℃，清洗緩沖液A，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)混合4次；染色#2，25 ℃，染料2，染色探針微陣列，10 min；染色#3，25 ℃，染料3，染色探針微陣列，10 min；最后一次清洗，35 ℃，清洗緩沖液A，15個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)4次；芯片維持緩沖液，維持緩沖液注入探針微陣列。 ③將上述染色清洗好的芯片放入掃描儀，點(diǎn)擊Scan進(jìn)行檢測(cè)。掃描時(shí)間一般設(shè)定為6 min；芯片微陣列的熒光掃描結(jié)束后，將圖像保存為“.DAT”類型的文件，以便后續(xù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5與汗腺發(fā)育、干細(xì)胞分化相關(guān)microRNA靶點(diǎn)的分析和驗(yàn)證篩選出MSCs誘導(dǎo)分化為汗腺細(xì)胞過程中發(fā)生顯著變化的差異microRNAs后，利用miRBase并結(jié)合microRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件DIANAmT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR5、PITA、RNA22、Targetscan，預(yù)測(cè)出其可能直接作用的靶基因，利用Microsoft Excel 2007建立microRNAs的靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)。打開該靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)，點(diǎn)擊菜單按鈕“篩選”，點(diǎn)擊“靶基因”這一列列首右下角的三角形按鈕，在下拉框中選擇“文本篩選”，“包含”字段中分別輸入已知的與干細(xì)胞分化、汗腺發(fā)育相關(guān)的基因，點(diǎn)擊“確定”，即顯示該數(shù)據(jù)庫(kù)中可能靶向該基因的差異性表達(dá)的microRNAs。

1.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Affymetrix芯片掃描結(jié)果的文件類型為“.CEL”文件，與Affymetrix? Expression Console? 軟 件 相 互 兼 容， 便于數(shù)據(jù)結(jié)果分析。差異表達(dá)的數(shù)據(jù)分析可通過 Affymetrix? Transcriptome Analysis Console 實(shí)現(xiàn)。結(jié)果判定：SGLC組與MSC組檢測(cè)數(shù)據(jù)的比值[SGLC/MSC（Ratio）] >2，表示顯著高調(diào)的microRNA，記錄Transcript ID(Array Design)；SGLC/MSC（Ratio）<0.5， 表 示 顯 著 低 調(diào) 的microRNA， 記 錄Transcript ID(Array Design)。

2　結(jié) 果

2.1MSCs誘導(dǎo)前后MicroRNA表達(dá)散點(diǎn)圖分析誘導(dǎo)組與MSC對(duì)照組的比對(duì)結(jié)果顯示，顯著上調(diào)的microRNAs位點(diǎn)有19個(gè)；顯著下調(diào)的microRNAs位點(diǎn)有49個(gè)（圖1A，見封三）。汗腺對(duì)照組與MSC對(duì)照組的比對(duì)結(jié)果顯示，顯著上調(diào)的microRNAs位點(diǎn)有120個(gè)，顯著下調(diào)的microRNAs位點(diǎn)有59個(gè)（圖1B，見封三）。我們發(fā)現(xiàn)圖1B比圖1A有更多的microRNAs位點(diǎn)發(fā)生了顯著調(diào)高和調(diào)低的遷移，說明microRNA表達(dá)譜正由誘導(dǎo)后向汗腺轉(zhuǎn)變。誘導(dǎo)后細(xì)胞與汗腺細(xì)胞比較，上調(diào)的miRNAs位點(diǎn)有38個(gè)，下調(diào)的microRNAs位點(diǎn)有131個(gè)（圖1C，見封三）。

2.2MicroRNA數(shù)據(jù)比對(duì)分析microRNA Array 的檢測(cè)結(jié)果紛繁復(fù)雜，為了縮小研究范圍，篩選更有意義的microRNA位點(diǎn)進(jìn)行下一步的驗(yàn)證分析，本研究中取圖1A和圖1B兩個(gè)結(jié)果的交集，共得到37個(gè)microRNA位點(diǎn)（其中調(diào)高的12種，調(diào)低的25種，見表1和表2，這些microRNA在誘導(dǎo)分化后的SGLCs與MSCs對(duì)照組的microRNA表達(dá)譜比較中，以及成人汗腺與MSCs的microRNA表達(dá)譜比較中，均有顯著變化；表示這些microRNAs既是MSCs誘導(dǎo)分化為汗腺樣細(xì)胞過程中的關(guān)鍵microRNAs，也存在于成熟的汗腺細(xì)胞中并維持著顯著的差異性表達(dá)，具有雙重顯著意義。這些篩選結(jié)果，為后期驗(yàn)證microRNAs作用靶點(diǎn)和分析信號(hào)通路，提供了研究范圍和可靠的理論支持。

表1　37個(gè)microRNAs位點(diǎn)的microRNA Chip Array 的檢測(cè)數(shù)據(jù)中顯著低調(diào)的25個(gè)microRNAs檢測(cè)數(shù)據(jù)

表2　37個(gè)microRNAs位點(diǎn)的microRNA Chip Array 的檢測(cè)數(shù)據(jù)中顯著高調(diào)的12個(gè)microRNAs檢測(cè)數(shù)據(jù)

2.3與干細(xì)胞分化、汗腺發(fā)育相關(guān)的microRNA靶基因分析篩選出的37個(gè)microRNAs是MSCs誘導(dǎo)分化為汗腺細(xì)胞過程中發(fā)生顯著變化的差異microRNAs，其直接靶向的靶基因可能成千上萬。通過對(duì)與汗腺發(fā)育、干細(xì)胞分化相關(guān)microRNA靶點(diǎn)的分析和篩選，發(fā)現(xiàn)MSC誘導(dǎo)前后表達(dá)顯著變化的差異性microRNAs主要靶向以下與干細(xì)胞分化、汗腺發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞因子，通過參與EDA/EDAR、NF-κB、Wnt及ERK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)促進(jìn)MSCs向汗腺細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

2.3.1與干細(xì)胞分化、汗腺發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞因子EGF、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）8、FGF10、癌胚抗原（CEA）、細(xì)胞角蛋白（KRT）7、KRT8、KRT14、KRT19、KRT79、Ptch、fox A1、shh、Bmp4、activin A。

2.3.2與干細(xì)胞分化、汗腺發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路① EDA/EDAR信號(hào)通路：EDA、EDAR、EDARadd等；② NF-κB信號(hào)通路：NFKB1、NFKB2、RELA、RELB、REL、IRAK1、TRAF2、TRAF5、TRAF6等；③Wnt/β-Catenin信號(hào)通路：β-Catenin、Lef1等；④ ERK信號(hào)通路：Ras-Raf-MEK-ERK。

另外，對(duì)37個(gè)關(guān)鍵microRNAs靶基因庫(kù)篩選的結(jié)果表明，沒有能直接靶向CD29、CD44、CD105、CD90、CD71、CD166這6種MSC分子標(biāo)志基因，也沒有能直接靶向NANOG、UTF1、 REX-1、SOX-2、OCT-4這5種MSC多能性分化潛能標(biāo)志基因的microRNAs。但并不表示microRNAs一定不影響MSC分子標(biāo)志的表達(dá)和MSC多能性分化潛能，microRNAs也可能通過間接作用，降低MSC分子標(biāo)志的表達(dá)，促進(jìn)MSC多能性分化潛能的增強(qiáng)，其作用還有待于進(jìn)一步的研究考證。

3　討 論

現(xiàn)階段從分子水平對(duì)各種生理、病理改變的研究，主要包括編碼基因、mRNA、蛋白表達(dá)和相關(guān)microRNAs調(diào)控等層面的協(xié)同研究[6]。最近研究顯示，在MSCs自我更新和多向分化過程中，microRNA表達(dá)譜存在顯著差異[7-8]，這些顯著差異性表達(dá)的microRNAs可能促使MSCs向特定方向分化，特異性microRNA表型也將成為區(qū)分特定細(xì)胞的分子標(biāo)志[9]。例如，促進(jìn)MSCs成骨分化的microRNAs有miR-196a、miR-210、miR-24等；促進(jìn)MSCs成脂分化的microRNAs 有miR-143和miR-24；促進(jìn)MSCs分化為神經(jīng)元的microRNAs有miR-130a、miR-206等[10]。然而，參與干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成汗腺細(xì)胞過程中的關(guān)鍵microRNAs尚未見研究和報(bào)道。因此，我們研究了該過程中的關(guān)鍵差異性microRNAs及其可能參與的信號(hào)通路調(diào)節(jié)。

MSCs誘導(dǎo)前后microRNA表達(dá)譜差異的比對(duì)分析結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的SGLCs和成熟的SGCs中，has-miR-138-5p的表達(dá)量為誘導(dǎo)前MSCs的不到1/10（microRNA芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，MSC: SGLC: SGC =59.221 4: 5.416 6: 1.943 6），為調(diào)低最為顯著的microRNA；誘導(dǎo)后的SGLCs和成熟的SGCs中，has-miR-146a-5p的表達(dá)量為誘導(dǎo)前MSCs的 10倍多（microRNA芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，MSC: SGLC: SGC =2.547 4: 28.558 9: 64.021 1），為調(diào)高最為顯著的microRNA。這兩種microRNAs的變化將顯著影響其靶基因的表達(dá)，可能為MSCs向SGLCs誘導(dǎo)分化過程中的關(guān)鍵microRNAs。通過靶基因預(yù)測(cè)軟件結(jié)合生物信息學(xué)分析，建立差異性microRNAs的靶基因庫(kù)，再進(jìn)一步分類篩選，我們找到了這些差異性microRNAs可能靶向、并參與調(diào)控MSCs誘導(dǎo)分化為SGLCs的關(guān)鍵靶基因及分子信號(hào)通路。這些通路多數(shù)已被證實(shí)是影響汗腺發(fā)生發(fā)育的關(guān)鍵信號(hào)通路，例如，ERK信號(hào)通路被認(rèn)為是細(xì)胞因子促進(jìn)干細(xì)胞分化的主要作用途徑；EDA/EDAR通路可使外胚葉發(fā)育缺陷Tabby鼠實(shí)現(xiàn)毛發(fā)和汗腺的再生，且能刺激正常小鼠的外胚層組織和器官的發(fā)育；NF-κB作為下游通路，可被EDA/EDAR通路和MEKK1激活，促進(jìn)皮膚附屬器的發(fā)育。

本研究中，我們?cè)诒姸囝A(yù)測(cè)到的靶基因中挑選出與汗腺發(fā)生、發(fā)育和干細(xì)胞分化相關(guān)的microRNAs靶基因，下一步我們將對(duì)這些靶基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)、靶基因驗(yàn)證和生物功能學(xué)驗(yàn)證，以確定所研究的microRNAs是否真正引起了靶基因表達(dá)的改變，是否影響了細(xì)胞表型和生物功能學(xué)的變化。

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Analysis on differential expression profiles of microRNA in the process of human bone marrow mesenchymal stem cells differentiated into sweat gland-like cells

Chen Yan*, Zhao Hongliang, Tan Zhijun, Zhao Huanjun, Zhang Cuiping, Fu Xiaobing. *Department of Pharmacy, General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700, China; Institute of Basic Medicine, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China
Corresponding author: Zhang Cuiping( E-mail: zcp666666@sohu.com)
Fu Xiaobing(E-mail: fuxiaobing@vip.sina.com)

AbstractObjective: To search the key microRNAs and investigate the microRNA-mediated regulating mechanisms on molecular signaling pathways by microRNA expressing profile gene chips detection in the process of human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) differentiated into sweat gland-like cells (SGLCs). Methods: MSCs was induced to differentiate into SGLCs by the method of indirect culture. The profiles of microRNA differential expression in MSCs before and after differentiation, as well as in MSCs, SGLCs and adult matured sweat gland cells (SGCs) were arrayed by microRNA microarray detection, the markedly changed microRNAs were screened out. Subsequently, the significantly changed microRNAs which targeted the genes related to SGCs development and MSCs differentiation were screened out by microRNA target prediction software for further validation. Results: The comparison results of microRNA differential expression profiles showed that 19 microRNAs were up-regulated and 49 microRNAs down-regulated in SGLCs vs. MSCs. While 120 microRNAs up-regulated and 59 microRNAs down-regulated in SGCs vs. MSCs. Thirty-seven microRNAs were found simultaneously in the result of significantly changed microRNAs in SGLCs vs. MSCs and SGCs vs. MSCs, in which 12 up-regulated and 25 down-regulated. All the 37 microRNAs targeted directly to a number of cytokines related to the

Key words:Bone marrow mesenchymal stem cell;Sweat gland cell;MicroRNA expression profi les;Difference analysis

DOI:10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 01. 002

基金項(xiàng)目：國(guó)家“973”計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012CB518105）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81121004, 81230041, 81171798）

通訊作者：張翠萍，副研究員（E-mail: zcp666666@sohu.com） 付小兵，研究員，中國(guó)工程院院士（E-mail: fuxiaobing@vip.sina.com）sweat gland development and stem cells differentiation like CEA, and participated in the regulation of signaling pathways of EDA/EDAR, NF-κB, Wnt and ERK, etc. Conclusions: A series of differentially expressed microRNAs targeting to related cytokines and signaling pathways correlated with regulation of SGCs development and differentiation of MSCs have been found successfully by bioinformatics analysis..

(收稿日期：2015-11-16)