基于GEO數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)方法分析子宮內(nèi)膜癌相關(guān)基因和候選通路

王 治，洪 莉，李素廷，曾婉玲

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430060)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma ,EC)是婦科常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤20%～30%，好發(fā)于圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后女性。研究[2]顯示:EC每年發(fā)病率約為0.2/10 000～1/10 000，且近年來其發(fā)病率逐漸升高，并呈現(xiàn)年輕化趨勢。EC發(fā)病原因和機(jī)制尚不明確，其早期診斷及治療方面盡管已有較大進(jìn)展，但仍有相當(dāng)一部分的病例發(fā)展至晚期才被確診。因此，研究EC發(fā)病原因和疾病發(fā)展相關(guān)機(jī)制及干預(yù)靶標(biāo)，有助于進(jìn)一步改善EC的診斷、治療和預(yù)后。 隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展以及生物信息學(xué)相關(guān)工具的完善，目前基因表達(dá)匯編(Gene Expression Omnibus， GEO)數(shù)據(jù)庫[3]提供了大量的基因表達(dá)譜相關(guān)數(shù)據(jù)，對其進(jìn)行數(shù)據(jù)分析可以快速發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的差異表達(dá)基因，并可通過進(jìn)一步分析尋找到影響疾病發(fā)生發(fā)展的分子靶標(biāo)。在肺癌[4]、胃癌[5]、乳腺癌[6]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[7]、腸癌[8]和卵巢癌[9]等多種腫瘤中，對GEO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析已經(jīng)在多種腫瘤機(jī)制研究中得到了廣泛應(yīng)用，該分析方法已經(jīng)被證實(shí)切實(shí)有效。通過生物信息學(xué)技術(shù)篩選EC患者組織的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)來發(fā)現(xiàn)潛在標(biāo)志物，對EC的診斷和治療方案的確定具有重要意義。本研究通過對GEO數(shù)據(jù)庫中EC組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE3678和GSE17025進(jìn)行聯(lián)合分析，篩選出具有高可信度的DEGs和重要的相關(guān)信號通路，構(gòu)建了DEGs的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI)，并篩選出了關(guān)鍵基因作為分子靶標(biāo)，以期通過DEGs和PPI的分析結(jié)果為EC的研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)集信息通過GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載高通量測序數(shù)據(jù)集GSE63678和GSE17025, 2組基因芯片數(shù)據(jù)類型均為Expression profiling by array，種屬均為Homo sapiens；GSE63678數(shù)據(jù)集注釋平臺為GPL571，包括5例正常組織樣本(GSM1555092～GSM1555096)和7例EC樣本(GSM1555085～GSM1555091)；GSE17025數(shù)據(jù)集注釋平臺為GPL570，包括12例正常組織樣本(GSM425927～GSM425938)和79例EC樣本(GSM425837～GSM425915)。

1.2 DEGs的提取和分析GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)可用于分析GEO數(shù)據(jù)集中不同數(shù)據(jù)組的差異表達(dá)水平。在基因表達(dá)數(shù)據(jù)集中，以正常組織樣本為對照組，以EC組織為實(shí)驗(yàn)組，使用GEO2R在線分析工具分別分析并篩選出GSE63678和GSE17025的DEGs，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05并且|log(FC)|>2，使用R軟件ggplot2和pheatmap程序包分析DEGs并進(jìn)行可視化，分別生成火山圖與熱圖。最后用FunRich軟件生成venn圖篩選出在GSE63678和GSE17025中同時(shí)上調(diào)或下調(diào)的DEGs用于進(jìn)一步分析。

由于石墨烯材料的邊緣具有化學(xué)活性，Tan等[17]采用電子束光刻法和氧等離子體法將石墨烯圖形化成四列納米帶(GNRs)來改善羥基組的數(shù)量，每條納米帶的寬度為 (99.1±1.5) nm，長度為 5.5 μm。石墨烯圖形化前的光學(xué)圖像如圖3(a)所示；圖形化后的光學(xué)圖像如圖3(b)左圖所示，對應(yīng)的AFM圖像如圖3(b)右圖所示。研究表明，圖形化后的石墨烯器件對pH的靈敏度(pH 6～8)由 6.5 mV/pH提升至 23.6 mV/pH。

1.3 基因本體論(gene ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析對大規(guī)?；蜻M(jìn)行GO分析已經(jīng)成為生物信息學(xué)分析的常用手段，可從細(xì)胞組分、生物過程和分子功能等多方面對DEGs進(jìn)行全面注釋。KEGG數(shù)據(jù)庫已被廣泛用于通路富集分析，可得到EC發(fā)展過程中的關(guān)鍵通路。使用R語言clusterProfiler包對DEGs分別進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號通路分析，并對結(jié)果進(jìn)行可視化。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵模塊分析使用MCODE插件對PPI進(jìn)行關(guān)鍵模塊的篩選，共篩選出3個(gè)重要的子模塊，篩選標(biāo)準(zhǔn)為K-core=2，Node Score Cutoff=0.2，Degree Cutoff=2，Maximum Depth=100。A模塊MCODE得分為42.048，由43個(gè)節(jié)點(diǎn)和883個(gè)相互作用關(guān)系構(gòu)成(圖4A)；B模塊MCODE得分為4.25，由9個(gè)節(jié)點(diǎn)和17個(gè)相互作用關(guān)系構(gòu)成(圖4B)；C模塊MCODE得分為4.0，由4個(gè)節(jié)點(diǎn)和6個(gè)相互作用關(guān)系構(gòu)成(圖4C)。

EC是臨床常見的婦科腫瘤之一，在全球婦科腫瘤中發(fā)病率位列第4位，在過去數(shù)十年間其發(fā)病率和死亡率逐年升高。EC典型的臨床表現(xiàn)為陰道出血，肥胖、高血壓和糖尿病是EC的“三聯(lián)征”。目前EC治療以手術(shù)為主，同時(shí)給予化療或內(nèi)分泌治療，但其治療效果卻不甚理想，存在手術(shù)不徹底、化療藥物毒性大和易產(chǎn)生耐藥性等問題[10-11]。發(fā)現(xiàn)較早的Ⅰ期EC患者綜合治療后5年生存率可達(dá)85%以上，中晚期患者生存率則明顯降低，Ⅱ期EC患 者5年生存率約為70%，Ⅲ期患者則僅為50%[12]。早期發(fā)現(xiàn)和治療是提高EC患者生存率的最佳途徑。隨著對EC發(fā)生發(fā)展機(jī)制的不斷探索，已有多項(xiàng)研究[13-15]證實(shí)：多基因組學(xué)改變和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常在EC發(fā)病中起重要的調(diào)控作用，多基因多通路的復(fù)雜連鎖反應(yīng)過程也是腫瘤發(fā)生機(jī)制研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建基于String數(shù)據(jù)庫在線分析DEGs的PPI關(guān)系，納入PPI標(biāo)準(zhǔn)為綜合得分>0.4，共得到165個(gè)PPI節(jié)點(diǎn)和1 131個(gè)蛋白互作關(guān)系，在所有DEGs中占比80.1%。使用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化及分析(圖3A)。使用CentiScape插件對PPI節(jié)點(diǎn)進(jìn)行評估，選擇具有最高度連通性的10個(gè)節(jié)點(diǎn)DEG作為EC的關(guān)鍵基因(圖3B)，可能在EC發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用的基因有細(xì)胞分裂周期基因20(cell division cycle gene 20,CDC20)、極光激酶A(aurora kinase A,AURKA)、細(xì)胞周期蛋白B1(Cyclin B1,CCNB1)、泛素E3連接酶(denticleless E3 ubiquitin protein ligase,DTL)、中心體相關(guān)蛋白55(centrosomal protein 55,CEP55)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1)、驅(qū)動蛋白家族成員11(kinesin family member 11,KIF11)、母系胚胎亮氨酸拉鏈激酶(maternal embryonic leucine zipper kinase,MELK)、細(xì)胞周期蛋白B2(Cyclin B2,CCNB2)和苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白1 (budding uninhibited by benzimidazoles 1, BUB1)。見表1。

2.2 對選用的復(fù)合（混）肥或作物專用肥，不含有機(jī)質(zhì)或含量在15%以下的肥料，要增加充分腐熟的畜禽純干糞不少于20公斤/畝，可有效的杜絕或緩解玉米苗期肥害。

2.1 DEGs的提取對GSE63678數(shù)據(jù)集進(jìn)行處理分析后，共鑒定出459個(gè)DEGs，其中包括242個(gè)上調(diào)基因(52.7%)和217個(gè)下調(diào)基因(47.3%)(圖1A，見插頁七)；GSE17025數(shù)據(jù)集分析，與對照組比較，EC組共有1 508個(gè)DEGs，有797個(gè)基因發(fā)生了上調(diào)(52.9%)，711個(gè)基因發(fā)生了下調(diào)(47.1%)(圖1B，見插頁七)。2組芯片數(shù)據(jù)集的差異基因表達(dá)熱圖分別見圖1C和1D(插頁七)。將篩選出來的差異表達(dá)基因進(jìn)行Venny分析，結(jié)果顯示：在數(shù)據(jù)集GSE3678和GSE17025中同時(shí)發(fā)生上調(diào)的基因有100個(gè)，同時(shí)發(fā)生下調(diào)的基因有106個(gè)(圖1E，見插頁七)。

表1 關(guān)鍵基因的計(jì)算結(jié)果

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析String在線數(shù)據(jù)庫(http://string.embl.de/)可用于檢索分子間相互作用以及預(yù)測蛋白質(zhì)互作關(guān)系。使用String數(shù)據(jù)庫對上述所得的206個(gè)DEGs進(jìn)行分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，使用Cytohubba插件對PPI網(wǎng)絡(luò)上所有DEGs進(jìn)行評分，以其中最高相關(guān)度的前10個(gè)DEGs作為EC發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因，即hub基因。最后使用Cytoscape軟件MCODE插件對DEGs進(jìn)行聚類功能模塊構(gòu)建，關(guān)鍵模塊篩選標(biāo)準(zhǔn)為MCODE評分>4，并對關(guān)鍵模塊所包含基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。模塊篩選標(biāo)準(zhǔn)：Degree Cutoff = 2， K-core = 2， Maximum Depth=100，Node Score Cutoff = 0.2。

A:Interaction of submodule A; B:Interaction of submodule B; C:Interaction of submodule C.

2.5 重要模塊基因的富集分析對PPI中3個(gè)重要子模塊所包含的56個(gè)DEGs進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號通路分析。GO富集分析結(jié)果顯示：DEGs主要在細(xì)胞核分裂和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等生物過程中發(fā)揮重要作用。KEGG信號通路分析結(jié)果顯示：DEGs主要與細(xì)胞周期、卵母細(xì)胞分裂、p53、細(xì)胞衰老、2型糖尿病和叉頭轉(zhuǎn)錄因子O(FoxO)等信號通路有密切關(guān)聯(lián)。見圖5(插頁七)。

3 討 論

從圖4中可以明顯看出，隨著毛雞只重的不斷增加，肉雞主產(chǎn)品出成在不斷增加。毛雞重量自4.31×500g增加到5.91×500g的過程中，主產(chǎn)品出成增加了0.09%，即：一只4.31×500g的毛雞要比一只5.91×500g的毛雞少出0.61kg主產(chǎn)品。

2.2 DEGs的GO富集分析和KEGG信號通路分析對共同上調(diào)或下調(diào)的DEGs進(jìn)行GO富集分析，GO注釋主要分為細(xì)胞組成、生物過程和分子功能3個(gè)部分。DEGs主要富集在有絲分裂染色體分離、核分裂和細(xì)胞器分裂等生物學(xué)過程。KEGG信號通路分析結(jié)果顯示：差異基因主要富集于細(xì)胞周期、miRNA、p53信號通路和2型糖尿病等信號通路過程。見圖2(插頁七)。

隨著生物信息學(xué)技術(shù)及二代測序技術(shù)的飛速發(fā)展，通過基因芯片數(shù)據(jù)研究EC發(fā)病機(jī)制成為了可能，也是研究EC的重要方向。本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)對GEO數(shù)據(jù)庫中2個(gè)EC相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE63678和GSE17025進(jìn)行聯(lián)合分析，共鑒定出了共同發(fā)生上調(diào)的差異基因100個(gè)，同時(shí)發(fā)生下調(diào)的差異基因106個(gè)；GO富集分析表明：差異基因主要富集于有絲分裂染色體分離、核分裂、細(xì)胞器分裂等生物學(xué)過程；KEGG信號通路分析表明：差異基因主要富集于細(xì)胞周期、miRNA、p53信號通路和2型糖尿病等信號通路過程。對差異基因構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步分析后，CDC20、AURKA、CCNB1、DTL、CEP55、CDK1、KIF11、MELK、CCNB2和BUB1被篩選為關(guān)鍵基因，其在EC發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。本文作者在PPI網(wǎng)絡(luò)中提取出了3個(gè)重要的子模塊，其所包含基因依然富集于細(xì)胞核分裂和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等生物過程，KEGG通路富集分析則表示這些基因主要與細(xì)胞周期、卵母細(xì)胞分裂、p53信號通路、細(xì)胞衰老、Ⅱ型糖尿病和FoxO信號通路等有關(guān)聯(lián)。

CDC20在許多種腫瘤中具有高表達(dá)，對腫瘤的發(fā)生起促進(jìn)作用，抑制CDC20活性可加速細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期[16-17]，因此CDC20可作為抗腫瘤治療的有效靶點(diǎn)。AURKA是一個(gè)周期性蛋白，通過參與中心體的復(fù)制分離和成熟在細(xì)胞周期中起著重要作用，其高表達(dá)可使多種抑癌蛋白失活同時(shí)激活多種致癌基因的表達(dá)[18]。CCNB1和CCNB2均屬于細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)家族成員，研究[3,19-23]表明：CCNB1基因在乳腺癌、卵巢癌和直腸癌等多種腫瘤組織中同樣高表達(dá)，在結(jié)直腸癌和肺癌組織中CCNB2高表達(dá)能加快細(xì)胞周期進(jìn)程、促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。未來有望通過靶向CCNB1和CCNB2基因的治療方法來抑制腫瘤細(xì)胞增殖。DTL介導(dǎo)細(xì)胞泛素化修飾及降解，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)，研究[24]表明：DTL通過介導(dǎo)雌激素促進(jìn)EC細(xì)胞侵襲遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換，其機(jī)制可能為EC診斷及治療提供新思路。CEP55是中心體相關(guān)蛋白家族成員，在中心體依賴相關(guān)的細(xì)胞功能如細(xì)胞周期進(jìn)展、胞質(zhì)分裂中心體復(fù)制等過程中發(fā)揮重要作用[25]。CDK1可與細(xì)胞周期蛋白B(Cyclin B，CCNB)組成復(fù)合物即有絲分裂促進(jìn)因子(mitosis-promoting factor，MPF)，促使細(xì)胞周期從G2期進(jìn)入M期，是哺乳動物細(xì)胞增殖所必需的基因，CDK1活性失調(diào)會導(dǎo)致染色體破裂和細(xì)胞死亡[26]。KIF11是一種經(jīng)典的分子馬達(dá)，在染色體的分離和雙極紡錘體的組裝過程中發(fā)揮重要作用，與細(xì)胞增殖有密切關(guān)聯(lián)[27]。MELK是一種周期依賴性激酶，研究[28-29]顯示：MELK在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)。BUB1是紡錘體的重要組成部分，其主要功能是監(jiān)控并保證有絲分裂過程的進(jìn)行[30]。

式中，dij 是i和j之間的距離，Rj是i搜索區(qū)(dij

高度有序的細(xì)胞周期活動是細(xì)胞維持正常代謝與增殖過程的保證，當(dāng)細(xì)胞周期[31]調(diào)控發(fā)生異常，例如周期相關(guān)蛋白、復(fù)合蛋白或細(xì)胞周期監(jiān)測點(diǎn)等細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)生異常時(shí)，會導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，含有異常受損DNA的細(xì)胞無法凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖和腫瘤形成[32]。本研究基于微陣列數(shù)據(jù)集，通過生物信息學(xué)技術(shù)分析了EC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的易感基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，富集分析和PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明：細(xì)胞周期相關(guān)的基因和通路在EC發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出的關(guān)鍵基因絕大多數(shù)與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)聯(lián)，由此可見，細(xì)胞周期失調(diào)是EC發(fā)病的主要機(jī)制。本研究結(jié)果為EC相關(guān)的發(fā)病機(jī)制、診斷、治療和預(yù)后判斷等研究提供了重要依據(jù)。結(jié)合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以上參與EC發(fā)病的關(guān)鍵分子有望成為具有臨床價(jià)值的EC生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。