不同生長期靈芝子實(shí)體三萜酸和多糖含量測定

李保明　華正根　王洪慶　劉 超　李 曄　陳若蕓*（. 天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 00050；. 福建仙芝樓生物科技有限公司 國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心 福建省藥用菌工程研究中心，福州 35000）

?

不同生長期靈芝子實(shí)體三萜酸和多糖含量測定

李保明1華正根2王洪慶1劉 超1李 曄2陳若蕓1*
（1. 天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050；2. 福建仙芝樓生物科技有限公司 國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心 福建省藥用菌工程研究中心，福州 350002）

摘 要分別采用HPLC法和藥典法測定不同生長期靈芝子實(shí)體中三萜酸和靈芝多糖的含量。HPLC法色譜條件：色譜柱為Alltech Alltima C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.04%甲酸溶液，檢測波長254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫15 ℃。結(jié)果：靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、靈芝烯酸A、靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝烯酸D和靈芝酸C1的線性范圍為5.9～42.0 μg/mL，r為0.999，加樣回收率為96.42%～104.14%。表現(xiàn)方法可行、重現(xiàn)性好，能定量測定靈芝中三萜酸和多糖的含量。

關(guān)鍵詞靈芝；生長期；三萜酸；多糖；含量測定

靈芝（Ganoderma lucidum）為靈芝科靈芝屬藥用真菌，在我國有廣泛、大量的栽培。研究人員從靈芝屬真菌中分離到了近400種化合物，但其活性成分主要為三萜和多糖類化合物［1］，為了更深入地了解靈芝不同生長期三萜和多糖的含量，我們對生長在福建省武夷山基地的不同生長階段靈芝子實(shí)體的化學(xué)成分進(jìn)行了測定，為靈芝的合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　三萜酸測定

1.1供試材料

9種靈芝三萜酸對照品均由本實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)IR、UV、NMR、MS等光譜鑒定，HPLC分析純度為98%以上；赤芝（Ganoderma lucidum）藥材來源于福建仙芝樓生物科技有限公司武夷山栽培基地。

1.2測定方法與結(jié)果［2］

（1）色譜條件。色譜柱：Alltech Alltima C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相為0.04%甲酸-乙腈。梯度洗脫條件：0～10 min，乙腈20%→25%；10～20 min，乙腈25%→30%；20～50 min，乙腈 30%→30%；50～65 min，乙腈30%→38%；65～80 min，乙腈為38%。柱溫15℃；流速1.0 mL/min ；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長254 nm。

（2）對照品溶液的制備。精密稱取靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、靈芝烯酸A、靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝烯酸D、靈芝酸C1對照品適量，加甲醇溶解并制成約50 mg/L的對照品溶液。

（3）樣品溶液的制備。取靈芝子實(shí)體粉末（過2號篩）0.5 g，精密稱定，加入甲醇100 mL，加熱回流1小時(shí)，冷卻后過濾，濃縮至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取濾液，作為供試品溶液。

（4）方法學(xué)考察。①線性關(guān)系考察：精密吸取濃度為50 mg/L的對照品溶液0.25、0.50、0.75、1.0、1.5 mL置于2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取20 μL，注入色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積；以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得靈芝酸C2回歸方程為Y=0.921 X-0.285，r=0.9992；靈芝酸G 為Y=1.28 X-2.15，r=0.9992；靈芝烯酸B 為Y=1.90 X-12.8，r=0.9994；靈芝酸B為Y =1.24 X+1.29，r=0.9992；靈芝烯酸A為Y= 2.60X-4.30，r=0.9992；靈芝酸A為Y=1.27 X +16.3，r=0.9995；靈芝酸D為Y=1.33 X+4.51，r=0.9990；靈芝烯酸D為Y=2.70 X-17.1，r= 0.999 2；靈芝酸C1為Y=1.16 X+8.41，r=0.9994。表明靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、靈芝烯酸A、靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝烯酸D、靈芝酸C1分別為0.136～0.818 μg、0.128～0.765 μg、0.135～0.810 μg、0.128～0.765 μg、0.119～0.713 μg、0.118～0.705 μg、0.140～0.840 μg、0.124～0.743 μg、0.121～0.728 μg，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

②精密度試驗(yàn)：取樣品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，計(jì)算靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、靈芝烯酸A、靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝烯酸D、靈芝酸C1峰面積的RSD分別為0.53%、0.89%、0.45%、0.48%、0.67%、1.2%、0.53%、0.53%和 1.1%。說明儀器精密度良好。

③穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品溶液，按上述色譜條件分別在0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20 μL，計(jì)算靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、靈芝烯酸A、靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝烯酸 D、靈芝酸 C1峰面積的 RSD分別為0.63%、0.85%、0.62%、0.76%、0.86%、1.3%、0.56%、0.73%和1. 2%。說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

④重現(xiàn)性試驗(yàn)：取段木靈芝粉末6份，按“1.2 （3）”項(xiàng)的方法平行制取樣品溶液并測定，靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、靈芝烯酸A、靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝烯酸D、靈芝酸C1的峰面積的RSD分別為2.2%、0.41%、3.4%、2.1%、3.1%、0.53%、3.3%、0.39%和1.7%，重復(fù)性良好。

⑤回收率試驗(yàn)：取已知含量的靈芝粉末5份，分別精密適量加入9種對照品混合溶液，按照樣品測定項(xiàng)下方法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果其平均回收率分別為 102.14%、102.29%、100.64%、103.27%、104.14%、103.19%、96.42%、102.46%、101.50%，RSD為1.5%、0.96%、1.8%、1.3%、1.7%、2.5%、0.62%、2.9%和1.3%。

（5）樣品溶液三萜酸含量的測定。在已選定的色譜條件下進(jìn)樣20 μL按外標(biāo)法定量，分別計(jì)算樣品中三萜酸的含量，結(jié)果見表1。

表1　不同生長期靈芝樣品中的三萜酸含量

2　多糖的測定

2.1測定方法［3］

（1）對照品溶液的制備。取葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.1 mg的對照溶液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。分別精密量取對照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于10 mL具塞試管中，加水至2.0 mL，精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.1 g，加80%的硫酸溶液100 mL使溶解，搖勻）6 mL，搖勻，置水浴中加熱15 min，取出，放入冰浴中冷卻15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，在625 nm處測定波長為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）樣品溶液的制備。取靈芝子實(shí)體粉末2 g，精密稱定，置于索氏提取器中，加水90 mL，加熱回流提取至提取液無色，提取液轉(zhuǎn)移至 100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取10 mL，加入乙醇150 mL，搖勻，4 ℃放置12 h，取出，離心，傾去上清液，沉淀加水溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。

（4）樣品測定。精密量取樣品溶液2 mL，置10 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中含葡萄糖的量。

2.2不同生長期靈芝樣品的多糖含量測定結(jié)果

生長期1的多糖含量為0.874%；生長期2的多糖含量為0.424%；生長期3的多糖含量為0.426%；生長期4的多糖含量為0.284%；生長期5的多糖含量為0.149%；生長期6的多糖含量為0.387%。

3　討 論

從測定的結(jié)果看，同一品種的靈芝子實(shí)體在不同的生長期三萜酸的含量有較大差異，其中，第7天含量最高，第14天和第7天基本一致，而在第210天后有明顯下降，降幅達(dá)到50%；多糖含量也是第7天最高，第14天明顯下降，降幅達(dá)到50%。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，三萜酸和多糖的含量隨著生長期的延長有同樣下降的趨勢，可能的原因是靈芝子實(shí)體的木質(zhì)部生長比較快，子實(shí)體重量增加比較多，而化合物積累比較慢，所以含量出現(xiàn)下降。實(shí)際栽培中，在靈芝子實(shí)體生成原基階段，會(huì)將弱小、多余的原基剪切掉，只留1個(gè)強(qiáng)壯的原基長成子實(shí)體。這些剪切下的原基，三萜酸和多糖含量都比較高，可以作為靈芝精粉或保健品的提取原料加以利用。

參考文獻(xiàn)

［1］ 林志彬主編. 靈芝的現(xiàn)代研究［M］. 第四版， 北京: 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社， 2015.

［2］ 李保明， 古海鋒， 李曄， 等. HPLC測定不同產(chǎn)地靈芝中9種三萜酸 ［J］. 中國中藥雜志， 2012， 37（23）: 3599-3603.

［3］ 中華人民共和國藥典2015版一部［M］. 第1版， 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015: 188-189.

*為通訊作者

中圖分類號：S646

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：2095-0934（2016）01-051-03