miR-15a下調(diào)BCL-2和BCL2L2 對下咽鱗癌FaDu細胞凋亡影響

路武豪馮龍婁衛(wèi)華

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miR-15a下調(diào)BCL-2和BCL2L2 對下咽鱗癌FaDu細胞凋亡影響

路武豪1馮龍2婁衛(wèi)華1

【摘要】目的 miR-15a在許多癌癥中均發(fā)現(xiàn)有表達異常，但其在下咽鱗狀細胞癌的作用不清。本研究通過miR-15a抑制BCL-2和BCL2L2表達，探討在將miR-15a對下咽鱗癌細胞凋亡的影響。方法 通過Lipofectamine2000將miR-15a mimics轉(zhuǎn)染入下咽鱗癌FaDu細胞中。RT-PCR檢測BCL-2和BCL2L2 mRNA的表達；Western Blotting檢測BCL-2和BCL2L2蛋白的表達；流式細胞術檢測檢測miR-15a的對細胞凋亡的影響。結果 BCL-2和BCL2L2在FaDu細胞中表達較強；轉(zhuǎn)染miR-15a mimics后的FaDu細胞中，BCL-2和BCL2L2蛋白和mRNA 的表達水平逐漸下調(diào)；同時轉(zhuǎn)染miR-15a mimics后，F(xiàn)aDu細胞凋亡明顯增加。結論 miR-15a可以下調(diào)BCL-2和BCL2L2的表達，促進下咽鱗癌細胞凋亡。

【關鍵詞】miR-15a；下咽鱗癌；FaFu細胞；miRNA；凋亡；BCL-2；BCL2L2

下咽鱗狀細胞癌是頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）中常見的惡性腫瘤［1］。我國下咽鱗狀細胞癌發(fā)病率唇部、口咽、喉咽和喉癌依次為0.04～0.14/10萬，1～2/10萬，0.15～0.8/10萬和3～5/10萬［2］。吸煙和嗜酒是頭頸部鱗癌的主要的致癌因素。微小RNA （microRNA）是近年發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性小分子非編碼單鏈RNA，由22個核苷酸組成，由長約70～90 nt具有發(fā)夾結構的單鏈RNA前體加工而來，能夠通過互補或部分互補的方式與靶mRNA的3'端非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）結合，從而介導靶mRNA降解或抑制其翻譯，負性調(diào)控下游靶基因的表達［3］。目前對下咽鱗癌miRNAs表達情況了解有限。因此，有必要對下咽鱗癌miRNAs表達情況進行深入研究。本研究通過miR-15a下調(diào)BCL-2和BCL2L2的表達，觀察其對下咽鱗癌FaDu細胞凋亡的影響。探討將miR-15a作為基因治療靶點的價值，為以后的進入臨床治療提供有效的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 標本來自于2012年7月～2014年6月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院咽喉頭頸外科接受喉咽鱗癌手術切除的患者，術前已經(jīng)與患者簽署知情同意書。

1.1.2 細胞株及細胞培養(yǎng) 人下咽鱗癌FaDu細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所。細胞在含有10%的胎牛血清，100單位/ml青霉素，100 μg /ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液（Gibco，美國）中生長，并置于37℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)，實驗細胞均處于對數(shù)生長期。

1.1.3 抗體和試劑 鼠抗人BCL2（sc-7382）單克隆抗體和鼠抗人BCL2L2（sc-293236）單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；細胞蛋白提取試劑盒購自Pierce公司；Annexin V凋亡檢測試劑盒購自BD公司；miR-15a mimics上海吉瑪制藥技術有限公司。

1. 2 實驗方法

1.2.1 miR-15a轉(zhuǎn)染人下咽鱗癌FaDu細胞 實驗分為以下3組：（1）miR-15a組，加入miR-15a mimics 150 nmol/L和脂質(zhì)體；（2）miRNA無關序列對照組，加入 miRNA scramble 150 nmol/L和脂質(zhì)體；（3）空白對照組，無任何轉(zhuǎn)染。選用對數(shù)生長期FaDu細胞按照之前的實驗分組參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書分別進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)6 h，換含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，37℃，5% CO2，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞進行檢測。

1.2.2 細胞總PCR的提取和引物設計 FaDu細胞培養(yǎng)于25 mm的培養(yǎng)瓶中，當細胞匯合度至90%時，每瓶細胞中加1 ml Trizol試劑進行RNA提取。分別設計miR-15a、BCL-2和BCL2L2引物。見表1、圖1所示。

表1 miR-15a、U6 nRNA、BCL-2、BCL2L2、GAPDH引物

1.2.3 miR-15a表達水平的檢測 參照Trizol試劑盒說明書提取各組細胞的總RNA，運用miR-15a qPCR Quantitation Kit進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增。逆轉(zhuǎn)錄反應體系為：4×dNTP 1 μl，miR-RT primer 1 μl，5×RT buffer 4 μl，M-MLV 0.5 μl，總RNA 1 μl，RNaseFree H2O補足至20 μl體積。逆轉(zhuǎn)錄反應程序：37℃ 60 min，95℃ 10 min。PCR擴增體系為：miR specific primer set 1 μl，2×Real-time PCR buffer 20 μl，Taq酶0.2 μl，miRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μl，ddH2O補足至40 μl體積。定量PCR反應程序：95℃ 3 min預變性；95℃ 15 s，65℃ 45 s，循環(huán)40圈。所有反應均設置3個復孔，使用ABI 7500 Fast儀器進行擴增檢測。以U6作為內(nèi)參，記錄Ct值，每個樣本的Ct值取平均數(shù)，各組間miR-15a相對定量的倍數(shù)用2-△△CT值表示。

1.2.4 BCL-2和BCL2L2表達水平檢測 反應總體積為30 μl，以上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為cDNA模板，每個反應設置3個復孔。Real-time PCR反應體系如下：94℃ 2 min，95℃ 1 min，兩種引物分別在551 min，72℃ 1 min，34個循環(huán)， 72℃延伸5 min。

1.2.5 細胞蛋白的制備 參照細胞蛋白提取試劑盒說明書，提取細胞總蛋白，Bradford法檢測總蛋白含量，并于-70℃保存。

1.2.6 BCL-2和BCL2L2蛋白表達水平檢測 提取人下咽鱗癌FaDu細胞總蛋白25μg，與2×SDS 緩沖液按1:1混合，沸水煮浴10 min，經(jīng)12%SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上。5%的脫脂奶粉TBST溶液封閉2 h，與單克隆鼠BCL-2和BCL2L2分別按1:2000 4℃孵育過夜，TBST溶液洗滌10 min，3次，硝酸纖維膜分別與辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠（1:5000）室溫孵育1 h，TBST 溶液洗滌10 min，3次，使用Molecular Dynamics densitometer對蛋白條帶強度進行定量。實驗重復3次，取其平均值。另外，轉(zhuǎn)染miR-15a后，按照上述方法檢測人下咽鱗癌FaDu細胞中BCL-2和BCL2L2蛋白的表達水平。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集各組細胞，細胞數(shù)調(diào)整為5×106個/ml細胞1 ml，PBS洗滌2次。用100 μl冰預冷的緩沖液重懸細胞，并向該細胞懸液中加入5 μl Annexin V-APC和2.5 μl 7-AAD染液，輕輕混勻，置于冰上。流式細胞儀檢測。實驗重復3次，取平均值。

表2 各組中miR-15a相對表達量

1. 3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0對實驗結果進行統(tǒng)計學處理。不同組間細胞凋亡比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 miR-15a在人下咽鱗癌FaDu細胞中表達顯著升高

miR-15a mimics轉(zhuǎn)染人下咽鱗癌FaDu細胞后，qRT-PCR檢測到miR-15a組與miRNA無關序列對照組和空白對照組相比，miR-15a表達水平顯著升高。如表2所示。

2.2 miR-15a下調(diào)BCL-2和BCL2L2的表達

為了評估的miR-15a和BCL2L2h和/或BCL-2之間的相關性，我們用miR-15a mimics轉(zhuǎn)染后細胞中BCL2L2和/或BCL-2的表達進行了評價。miR-15a的高表達能夠顯著抑制BCL2L2和/或BCL-2 mRNA表達水平和蛋白質(zhì)表達水平。見表3，圖1所示。

表3 各組細胞中BCL-2和BCL2L2 mRNA相對表達量

圖1 Western Blotting法檢測BCL-2 和BCL2L2在FaDu中蛋白的表達

2.3 流式細胞術（FCM）檢測細胞凋亡結果

無關序列對照組與空白對照組相細胞凋亡率無顯著性差異（P ＞0.05）。miR-15a組（7.246±0.815）與無關序列對照組與空白對照組相比細胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表4，圖2。

表4 各組細胞凋亡檢測結果

圖2 各組細胞凋亡率比較

3 討論

頭頸部鱗狀細胞癌是一類常見的惡性腫瘤，大量吸煙和飲酒是其主要的致癌因素。miRNAs是一種內(nèi)源性小分子RNA，可介導靶mRNA降解或抑制其翻譯，能夠?qū)毎脑鲋?、分化和凋亡進行調(diào)控，目前已明確其與包括腫瘤在內(nèi)的諸多疾病密切相關［4］。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中通常存在miRNAs表達水平的異常，miRNA基因在腫瘤發(fā)生過程中既可以起癌基因的作用，又可以充當抑癌基因角色［5］。

miR-15a是腫瘤中最易發(fā)生突變的基因區(qū)域之一［6］。有研究報道，miR-15a在腫瘤細胞中表達下調(diào)或缺失，推斷miR-15a在腫瘤發(fā)生中可能是抑癌基因，由于等位基因缺失造成的miR-15a失活可能會導致腫瘤的發(fā)生［7-8］。我們的研究結果顯示，人下咽鱗癌FaDu細胞中miR-15a表達水平較低，但轉(zhuǎn)染miR-15a mimic后，人下咽鱗癌FaDu細胞中miR-15a表達水平高于轉(zhuǎn)染之前，并且結果顯示：miR-15a能夠明顯抑制下游目的基因BCL-2和BCL2L2 的mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達，細胞的凋亡顯著增加。因此，以miR-15a這種抑癌基因，作為抗腫瘤治療的靶點，如果能在下咽鱗癌組織中高表達，是否能夠提高患者的生存率，以期為以后的臨床治療提供有益的參考。

參考文獻

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［7］ Lin K，F(xiàn)arahani M，Yang Y，et al. Loss of MIR15A and MIR16-1 at 13q14 is associated with increased TP53 mRNA，de-repression of BCL2 and adverse outcome in chronic lymphocytic leukaemia［J］. British Journal of Haematology，2014，167（3）：346-355.

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【中圖分類號】R739.65

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9308（2016）15-0202-03

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.15.135

基金項目：國家自然科學基金項目：81503677

作者單位：1 鄭州大學第一附屬醫(yī)院咽喉頭頸外科，河南 鄭州450052；2 河南中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院病原生物學與免疫學科，河南鄭州 450008

通訊作者：婁衛(wèi)華，E-mail：louweihuazzu@163.com

Effects of miR-15a Down Regulated BCL-2 and BCL2L2 on Apoptosis of FaDu Cells in the Lower Pharyngeal Squamous Cell Carcinoma

LU Wuhao1FENG Long2LOU Weihua1
1 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery， First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou He’nan 450052， China， 2 Department of Pathogenic Organism Biology， He’nan University of Chinese Medicine， Zhengzhou He’nan 450008， China

［Abstract］Objective MiR-15a is found to have abnormal expression in many cancers， but its role in the squamous cell carcinoma of the lower pharynx is not clear. In this study， the expression of BCL-2 and BCL2L2 was inhibited by miR-15a， and the effect of miR-15a on the apoptosis of the cell apoptosis was studied. Methods Mimics FaDu was transfected into the miR-15a cells of the pharynx squamous cell carcinoma by Lipofectamine2000. RT-PCR detection of BCL-2 and mRNA BCL2L2 expression. Blotting Western to detect the expression of BCL-2 and BCL2L2 protein， flow cytometry to detect the effect of miR-15a on the apoptosis of the cell. Results Bcl-2 and BCL2L2 in FaDu cells expressed strong； transfection miR-15a mimics the FaDu cells， Bcl-2 and BCL2L2 protein and mRNA expression level decreased gradually； at the same time after transfection of miR-15a mimics， FaDu cells apoptosis significantly increased. Conclusion MiR-15a can down regulate the expression of BCL-2 and BCL2L2， and promote the apoptosis of cell apoptosis in the lower pharynx squamous cell carcinoma.

［Key words］miR-15a， Squamous cell carcinoma of the lower pharynx，F(xiàn)aFu cell， miRNA， Apoptosis， BCL-2， BCL2L2