植物青枯菌LAMP檢測方法的建立

黃　雯，徐　進，張　昊，許景升，丁　偉，馮　潔

（1西南大學植物保護學院，重慶 400716；2中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

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植物青枯菌LAMP檢測方法的建立

黃雯1,2，徐進2，張昊2，許景升2，丁偉1，馮潔2

（1西南大學植物保護學院，重慶 400716；2中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

摘要：【目的】由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum，簡稱青枯菌）引起的青枯?。╞acterial wilt of plants）是世界范圍內(nèi)危害最為嚴重的土傳細菌病害之一，嚴重制約了多種經(jīng)濟作物的生產(chǎn)。建立高效、精準的早期診斷技術，是實現(xiàn)青枯病有效防控的基礎。論文旨在建立一種能夠特異檢測青枯菌的環(huán)介導等溫擴增方法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP），實現(xiàn)青枯菌的田間快速檢測。【方法】通過比對分析青枯菌的lpxC基因序列，并利用在線引物設計軟件Primer Explorer Version 4.0得到4條LAMP特異性引物，F(xiàn)3（5′-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3′）、B3（5′-ACCGCAACACGGGATCA-3′）、FIP（5′-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT -3′）、BIP（5′-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3′）。通過單因素變化試驗對LAMP反應體系中的各參數(shù)進行優(yōu)化，設置反應溫度為60、61、62、63、64、65℃，設置鎂離子濃度為2、4、6、8、10、12 mmol·L-1，設置內(nèi)外引物濃度比為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，確定最優(yōu)反應體系。以分離自不同寄主的24個青枯菌株為參試對象，5個非青枯菌株（Ralstonia mannitolilytica、Ralstonia pickettii、Enterobacter sp.、Acidovorax citrulli、Burkhoderia cepacia）為對照，驗證LAMP檢測方法的特異性。將青枯菌GMI1000菌株的基因組DNA進行10倍梯度系列稀釋，以原液和101、102、103、104、105、106、107倍的稀釋液為模板同步進行LAMP和普通PCR檢測，比較兩者的檢測靈敏度。將馬鈴薯青枯病菌株Po41、姜青枯病菌株Z-Aq-1分別與馬鈴薯塊莖和生姜根莖組織懸浮液混合，以LAMP檢測方法對混合物進行檢測，并以同樣方法對表現(xiàn)典型萎蔫癥狀的人工接種番茄植株和健康植株以及田間馬鈴薯罹病塊莖樣品進行檢測。反應結果直接通過觀察產(chǎn)生的白色焦磷酸鎂沉淀情況進行判定，或通過加入1 μL SYBR GreenⅠ熒光染料進行觀察，陽性樣品為綠色，陰性樣品為橙色?！窘Y果】建立了特異性檢測青枯菌的 LAMP方法，優(yōu)化后確立了檢測體系中 FIP/BIP與 F3/B3的濃度比為 8∶1（1.6∶0.2 μmol·L-1），鎂離子濃度為6 mmol·L-1，反應溫度為63℃。特異性檢測結果顯示，僅參試青枯菌反應管中的反應液呈現(xiàn)綠色，表明建立的檢測體系具有高度特異性。以青枯菌GMI1000菌株的DNA原液及不同梯度的稀釋液為模板進行的LAMP和普通PCR檢測結果顯示，LAMP的檢測靈敏度為1.42 pg，比普通PCR高10倍。能夠快速準確地從植物組織懸浮液、罹病番茄植物組織及田間罹病樣品中檢測到青枯菌?！窘Y論】建立的青枯菌LAMP檢測方法，高效特異，操作簡單，無需復雜儀器，肉眼可直接觀察檢測結果，適合基層和現(xiàn)場檢測。

關鍵詞：青枯菌；檢測；環(huán)介導等溫擴增

聯(lián)系方式：黃雯，E-mail：wenhuang224@126.com。通信作者丁偉，E-mail：dwing818@163.com。通信作者馮潔，E-mail：jfeng@ippcaas.cn

0 引言

【研究意義】植物細菌性青枯病（bacterial wilt of plants）是由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum，簡稱青枯菌）引起的一種世界性重大病害。青枯菌的群體遺傳結構復雜多樣，具有廣泛的寄主和生態(tài)適應性，可侵染54個科的450余種植物［1］，除茄科和豆科等雙子葉草本植物外，還包括桑樹、桉樹和木麻黃等雙子葉木本以及香蕉和生姜等單子葉植物［2］；生態(tài)適應性廣泛，體現(xiàn)在其作為動因引起的病害遍及熱帶、亞熱帶、溫帶乃至中高緯度地區(qū)。作為土壤習居菌，青枯菌可于土壤、水體、病殘以及隱癥寄主中長期存活，成為翌年的初侵染來源。在疫區(qū)青枯病可通過地表徑流、根際接觸和農(nóng)事操作等多種途徑進行擴散傳播，而帶菌植物材料則是青枯病遠距離傳播的主要途徑。已有明確的流行學證據(jù)表明香蕉青枯病通過繁殖材料球莖傳入菲律賓和澳大利亞昆士蘭州［3］；馬鈴薯青枯病通過加工薯和天竺葵鮮切花材料分別傳入歐洲和北美地區(qū)。因此，建立快速、高效、輕簡的檢測技術有助于控制青枯病的蔓延及重大損失的發(fā)生?！厩叭搜芯窟M展】目前常用的青枯菌檢測方法主要基于平板劃線分離、血清學檢測和分子檢測技術。1954年，KELMAN［4］報道了青枯菌野生型菌株在 TZC （2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride）培養(yǎng)平板上的菌落形態(tài)與自發(fā)突變株和非靶標菌間差異，并藉此建立了青枯菌的半選擇分離技術。但該方法費時費力，要求操作人員具備準確識別青枯菌菌落形態(tài)的能力；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是檢測植物青枯菌的常用方法，但其多克隆抗體缺乏足夠的特異性［5］；1988年，JANSE［6］創(chuàng)立了間接免疫熒光染色法（IFAS）用于檢測青枯菌，特異性和靈敏度雖有了較大提高，但血清的制備過程耗時耗力，且存在交叉反應，易造成假陽性檢測結果；1997年，OPINA等［7］基于隨機擴增片段長度多態(tài)性（random amplified polymorphism，RAPD）的分析結果，錨定了青枯菌lpxC及其上游部分序列，設計的PCR擴增引物Au759f/760r，因其在青枯菌種水平鑒定上具有高度的特異性和廣泛的通用性，因此被國內(nèi)外相關研究者廣為采用，然而該方法還需要通過瓊脂糖凝膠電泳進行結果驗證，不能實現(xiàn)青枯菌的快速檢測；Real-time PCR 檢測技術靈敏、可靠，但需要特殊的儀器進行反應溫度的控制［8］。環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是NOTOMI等［9］于2000年發(fā)明的一種可于特定恒溫條件下，實現(xiàn)對靶標序列高效擴增的技術。KUBOTA等分別報道了基于鞭毛蛋白FliC編碼基因保守區(qū)域的青枯LAMP檢測方法［10-11］； LENARCIC等［12］報道了基于egl的青枯菌LAMP檢測方法?！颈狙芯壳腥朦c】現(xiàn)有的青枯菌檢測方法在生產(chǎn)實踐中的應用仍具相當?shù)木窒扌?，本研究在靶標序列的選擇（青枯菌種特異性鑒定靶標lpxC）和擴增結果的判斷（擴增結果直接通過肉眼觀察由擴增副產(chǎn)物（白色焦磷酸鎂沉淀）引起的濁度變化［13］，或加入染料的顏色變化進行判定）上進行了改進?！緮M解決的關鍵問題】建立青枯菌的LAMP檢測方法，優(yōu)化擴增體系和反應條件，驗證方法的特異性、通用性和靈敏度，探尋病樣快速檢測的可行性，以期為青枯病的田間快速精準診斷、植物繁殖材料帶菌檢測以及病害防控效果評價提供技術支撐。

1 材料與方法

試驗于2015年7月至2016年1月在中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室完成。

1.1 材料、試劑與儀器

接種青枯菌2號小種Po82菌株后的罹病番茄植株、健康的番茄植株、市售健康馬鈴薯、生姜、田間馬鈴薯罹病塊莖樣品；供試菌株：24個青枯菌株（表1）、5個對照菌株（表2）由筆者實驗室分離、保存。

表1　用于檢測引物特異性的青枯菌菌株Table 1 Different strains of R. solanacearum used in this study to test the specificity of these primers

表2　用于檢測引物特異性的非青枯菌菌株Table 2 Different strains of non R. solanacearum used in this study to test the specificity of these primers

Bst 2.0 DNA聚合酶購于 New England Biolabs （NEB）公司；dNTP Mixture購于TaKaRa公司；甜菜堿購于上海生工生物工程有限公司；SYBR GreenⅠ染料購于美國AB公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購于北京百泰克生物科技有限公司。

NanoVue Plus核酸蛋白測定儀購于上海在途生物科技有限公司；VERITI PCR擴增儀為美國AB公司產(chǎn)品；TW2 水浴鍋為德國JULABO公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)基配制 NA（nutrient agar）培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母粉0.5 g，加水至1 L，調(diào)至pH 7.0，加入1.8％的瓊脂，121℃下滅菌20 min；TZC培養(yǎng)基：100 mL NA培養(yǎng)基中加入0.5 mL 1％紅四氮唑溶液；1％紅四氮唑（C19H15ClN4）溶液：稱取1 g紅四氮唑溶于100 mL蒸餾水中，高壓滅菌7—8 min，避光4℃保存。

1.2.2 供試菌株培養(yǎng)及 DNA提取 28℃條件下，于NA平板上培養(yǎng)48 h后的各供試菌株，根據(jù)細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取總DNA，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設計和合成 以青枯菌的lpxC作為檢測靶標，通過比對分析后，利用Primer Explorer Version 4.0（http：//primerexplorer.jp/e/）在線設計4條LAMP特異性引物，其中F3（5′-CCTGTACGTGGTCGGC TAT-3′）和B3（5′-ACCGCAACACGGGATCA-3′）為外側引物，F(xiàn)IP（5′-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGT ACACGGCGCACAAGT-3′）和BIP（5′-ATCGTCAC GTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3′）為內(nèi)側引物。引物由生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.4 LAMP反應體系的優(yōu)化及擴增產(chǎn)物檢測 以無菌水為空白對照，通過單因素變化試驗對LAMP反應體系的各參數(shù)，包括鎂離子濃度（終濃度變化范圍為2—12 mmol·L-1）、內(nèi)外引物濃度比（比值變化范圍為2∶1—12∶1）等進行優(yōu)化，并測定反應所需的最適溫度（反應溫度變化范圍為60—65℃）。反應結束后可直接通過觀察產(chǎn)生的白色焦磷酸鎂沉淀情況判定檢測結果，也可于反應前在PCR管內(nèi)蓋上加入1 μL SYBR GreenⅠ熒光染料，反應結束后瞬時離心，將染料與反應液混勻后觀察顏色變化，若反應管中有目的 DNA的大量擴增，則反應管顏色呈現(xiàn)綠色，反之為橙色。

1.2.5 LAMP方法特異性檢測 以不同寄主來源的24個青枯菌株為研究對象，5個非青枯菌株為對照材料，無菌水為空白對照，驗證LAMP檢測方法的特異性。以各菌株的DNA為模板，采用已優(yōu)化的反應體系進行試驗，結果通過直接觀察白色焦磷酸鎂沉淀或通過熒光染料法進行分析。

1.2.6 LAMP方法靈敏度檢測 按照試劑盒說明書提取青枯菌GMI1000菌株的DNA，通過核酸蛋白測定儀測定其濃度為1.42×102ng·μL-1，對DNA提取液進行 10倍梯度稀釋，對應的濃度依次為 1.42×101ng·μL-1、1.42×100ng·μL-1、1.42×102pg·μL-1、1.42×101pg·μL-1、1.42×100pg·μL-1、1.42×102fg·μL-1、1.42×101fg·μL-1，分別以各稀釋梯度的DNA溶液為模板，以無菌水為空白對照，同步進行LAMP和普通PCR檢測，比較二者的檢測靈敏度差異。

普通PCR采用以青枯菌lpxC及其上游部分序列為檢測靶標的擴增引物 Au759f/760r，引物序列：AU759f 5′-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3′，AU760r 5′-GT CGCCGTCA GCAATGCGGAATCG-3′。

1.2.7 植物組織液及病株中青枯菌的LAMP檢測 分別以滅菌手術刀切取小塊表面消毒后的馬鈴薯和生姜內(nèi)部植物組織，以研磨杵碾碎后懸浮于滅菌水中。隨后分別于各組織懸浮液中加入新鮮配置的 Po41和Z-Aq-1菌懸液至菌體細胞終濃度約105cfu/mL，以無菌水為空白對照，使用LAMP方法進行檢測。

分別取接種Po82菌株10 d后表現(xiàn)明顯萎蔫癥狀的番茄植株和健康番茄植株各1株，截取其近根部約2 cm的莖組織，懸浮于5 mL無菌水中并剪碎，30 min后以該液體為模板，以無菌水為空白對照進行LAMP檢測。

1.2.8 馬鈴薯罹病樣品的LAMP檢測 7份采集于云南疑似青枯病的馬鈴薯塊莖樣品經(jīng)沖洗、表面消毒后縱向剖開，以滅菌手術刀切取小塊維管束組織，懸浮于5 mL 無菌水中，30 min 后以懸浮液為模板，以無菌水為空白對照，同步進行LAMP和普通PCR檢測。

2 結果

2.1 LAMP反應體系優(yōu)化

2.1.1 反應溫度優(yōu)化 LAMP反應產(chǎn)物經(jīng)加入SYBR GreenⅠ染料染色后表明，反應在60、61、62、63、64、65℃ 6個不同的反應溫度下均有擴增，差異不顯著，表明該引物的反應條件寬松（圖 1），確定63℃為反應溫度。

1—6：溫度分別為60、61、62、63、64、65℃ Reaction temperatures were 60， 61， 62， 63， 64， and 65℃， respectively；7：空白對照Blank control圖1　不同溫度條件下的LAMP檢測Fig. 1 LAMP detection with different amplification temperatures

2.1.2 鎂離子濃度優(yōu)化 LAMP反應產(chǎn)物經(jīng)加入SYBR GreenⅠ染料染色后表明，當鎂離子濃度在6—12 mmol·L-1時，反應產(chǎn)物均能呈現(xiàn)明顯的綠色，根據(jù)效果相同，用量最少原則，確定該反應體系的最佳鎂離子濃度為6 mmol·L-1（圖2）。

1—6：Mg2+濃度分別為2、4、6、8、10、12 mmol·L-1Concentrations of Mg2+were 2， 4， 6， 8， 10， and 12 mmol·L-1， respectively；7：空白對照 Blank control圖2　不同Mg2+濃度下的LAMP檢測Fig. 2 LAMP detection with different concentrations of Mg2+

2.1.3 內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化 LAMP反應產(chǎn)物經(jīng)加入 SYBR GreenⅠ染料染色后表明，不同的內(nèi)外引物濃度比下均能發(fā)生擴增反應，當內(nèi)外濃度比為 6∶1（1.2∶0.2 μmol·L-1）及以下時，綠色較淺，而當內(nèi)外濃度比為8∶1（1.6∶0.2 μmol·L-1）到12∶1（2.4∶0.2 μmol·L-1）時，綠色較亮，說明產(chǎn)生大量目的片段的擴增，因此選擇8∶1作為該擴增體系的內(nèi)外引物濃度比（圖3）。

1—6：內(nèi)外引物濃度比分別為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1 Different concentration ratios of inner and outer primers were 2∶1，4∶1， 6∶1， 8∶1， 10∶1， and 12∶1， respectively；7：空白對照Blank control圖3　不同內(nèi)外引物濃度比的LAMP檢測Fig. 3 LAMP detection with different concentration ratios of inner and outer primers

LAMP反應體系設定為25 μL：體系中內(nèi)引物FIP 和BIP的濃度分別為1.6 μmol·L-1，外引物F3和B3的濃度分別為 0.2 μmol·L-1，dNTP的濃度為 1.4 mmol·L-1，甜菜堿1.0 mol·L-1，基礎反應液（20 mmol·L-1Tris-HCl，10 mmol·L-1（NH4）2SO4，50 mmol·L-1KCl，6 mmol·L-1MgSO4，0.1％ Tween-20），模板DNA 1 μL，然后加入8個單位的Bst 2.0 DNA聚合酶，補水至25 μL?；靹螂x心后，63℃孵育45 min。

2.2 LAMP方法特異性檢測

相同反應條件下，分別以青枯菌菌株和非青枯菌菌株的DNA為模板進行LAMP擴增反應，反應結束后觀察各反應管中顏色變化，其中青枯菌菌株反應管中反應液均呈現(xiàn)綠色，表明有大量目的DNA進行了擴增；而其他參比菌株及空白對照的反應液均保持橙色不變，表明本研究中所設計的引物不能使這些菌株發(fā)生擴增反應，且該檢測過程未出現(xiàn)假陽性（圖4）。

2.3 LAMP方法靈敏度檢測

以提取的青枯菌GMI1000菌株的DNA原液及10倍梯度稀釋后的稀釋液為模板進行LAMP檢測和普通PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，普通PCR在105倍的稀釋模板下無明顯擴增反應（圖5-a），表明其最低檢測濃度為14.2 pg。熒光染料法結果顯示，LAMP在 106倍的稀釋模板下無明顯擴增反應（圖5-b），表明其最低檢測濃度為1.42 pg。LAMP的檢測靈敏度較普通PCR提高10倍。

1—24：青枯菌菌株Different strains of R. solanacearum；25—29：非青枯菌菌株Different strains of non R. solanacearum；30：空白對照Blank control圖4　LAMP方法特異性檢測Fig. 4 Specificity test of LAMP

圖5　普通PCR（a）與LAMP（b）方法靈敏度比較Fig. 5 Comparison between traditional PCR （a） and LAMP （b） in sensitivity for R. solanacearum

2.4 植物組織液及病株中青枯菌的LAMP檢測

分別以混入青枯菌 Po41菌株的馬鈴薯組織浸出液和混入青枯菌 Z-Aq-1 菌株的姜組織浸出液為LAMP擴增模板進行檢測，結果顯示（圖 6），反應液均呈現(xiàn)綠色，而空白對照的反應液保持橙色，表明該方法不受植物組織浸出液干擾，可靈敏地檢測青枯菌。

以LAMP方法檢測罹病番茄植株及健康植株，結果顯示（圖7），罹病植物的反應管中反應液為綠色，表明有大量靶標序列進行擴增，而健康植物和空白對照反應管中的反應液為橙色，表明未發(fā)生擴增反應，該方法可用于病株樣品的檢測。

2.5 馬鈴薯罹病塊莖樣品的LAMP檢測

LAMP檢測結果顯示（圖8-c），7份待檢馬鈴薯塊莖樣品的反應液均呈綠色，對照管保持橙色；同步進行的普通PCR檢測結果顯示（圖 8-b）7份樣品均可擴增獲得片段大小為282 bp條帶。LAMP和PCR的檢測結果均表明疑似罹病樣品的青枯病檢測結果為陽性。因此，本研究所建立的LAMP方法可特異、靈敏地檢測出罹病樣品中的青枯菌。

1：混入Po41菌株的馬鈴薯組織液Mixture of potato tissue and strain Po41；2：混入Z-Aq-1菌株的姜組織液Mixture of ginger tissue and strain Z-Aq-1；3：空白對照Blank control圖6　植物組織液中青枯菌的LAMP檢測Fig. 6 LAMP detection of R. solanacearum in the plant tissues

1：罹病植株The plant infected by R. solanacearum；2：健康植株The healthy plant；3：空白對照Blank control圖7　病株中青枯菌的LAMP檢測Fig. 7 LAMP detection of R. solanacearum in the diseased plant

圖8　馬鈴薯罹病樣品（a）及其普通PCR（b）和LAMP（c）檢測Fig. 8 Samples of diseased potatoes （a） and the detection of traditional PCR （b） and LAMP （c）

3 討論

青枯病是常見、易發(fā)和傳播迅速的重要土傳細菌病害之一［14］，中國目前南起20°N的海南省、北至42°N的河北壩上地區(qū)均有該病發(fā)生的報道［15］。青枯菌可隨土壤、排溉水以及種苗、種薯（姜）等植物繁殖材料傳播擴散。因此，建立準確、快速、高效的檢測方法，及時檢測出帶菌種子、幼苗、水體或土壤，對阻止青枯菌的傳播蔓延具有重要意義。21世紀初建立起來的環(huán)介導等溫擴增法（LAMP）憑借特異性強、靈敏度高、檢測成本低和操作步驟簡單等優(yōu)點，迅速被廣泛應用于植物保護、食品安全和醫(yī)學衛(wèi)生等諸多領域［16］，如苜蓿疫霉根腐病菌（Phytophthora medicaginis）［17］、禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）［18］等病原真菌的檢測；根結線蟲（Meloidogyne incognita）［19］、松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）［20］等植物病原線蟲的檢測；植物病毒多為RNA，針對植物病毒及類病毒的檢測采用反轉錄環(huán)介導等溫擴增技術（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP），如煙草花葉病毒（Tobaccomosaic virus，TMV）［21］、葡萄 A 病毒（Grapevine virus A，GVA）［22］、菜豆莢斑駁病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）［23］等；許多學者利用LAMP技術對難以培養(yǎng)的細菌、生化反應不明顯及傳統(tǒng)表型方法不能鑒定的細菌進行快速準確的鑒定［24］，如空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）［25］、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）［26］等。

本研究基于 lpxC基因序列設計了青枯菌LAMP檢測的擴增引物，該基因作為青枯菌演化型復合PCR鑒定中的種特異性鑒定靶標，已被國內(nèi)外青枯病相關領域的研究人員廣為采用。因此，以其為靶序列設計引物可充分保證LAMP反應的高度特異性和廣泛通用性。在KUBOTA等［10］的研究中，擴增結果通過瓊脂糖凝膠電泳進行判斷，由于LAMP反應產(chǎn)物高溫條件下易造成氣溶膠污染，使之后的檢測出現(xiàn)較高的假陽性率，且通過電泳判斷結果費時費力，無法實現(xiàn)青枯菌的田間快速檢測。本研究采用反應前于PCR管內(nèi)蓋上加入染料［27］，反應后通過離心與擴增產(chǎn)物混合，實現(xiàn)了無需開蓋的樣品快速可視化檢測。在賈蒙驁等［11］的研究中，以胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum）和大腸桿菌工程菌株為對照菌、煙草青枯病菌 FQY4菌株為參試菌驗證LAMP反應的特異性，參試菌株量過少，不足以支撐檢測結果。本研究以歸屬于 5個不同生理小種、涉及14種分離寄主的24個青枯菌株材料為參試對象，并以青枯菌的近緣種Ralstonia mannitolilytica、Ralstonia pickettii和Burkhoderia cepacia以及常見菌 Enterobacter sp.和 Acidovorax citrulli為對照菌，能夠確保本研究所建立的檢測方法具有高度的特異性和廣泛的適用性。LENARCIC等［12］比對了以16S rRNA、fliC和egl為靶標建立的LAMP方法在檢測特異性方面的差異，并與real-time PCR進行對比，最終基于egl建立了高效快速的LAMP檢測方法，但該研究所采用菌株多分離于馬鈴薯等茄科和芭蕉科寄主，且檢測過程需通過Genie Ⅱ等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)進行監(jiān)測，大大增加了檢測成本，不適合在田間及基層推廣。

較之其他檢測方法，本研究建立的LAMP檢測方法的優(yōu)勢在于：高效快捷，可于45 min內(nèi)完成擴增反應；靈敏度高，DNA樣品的檢測閾值為1.42 pg；適用范圍廣，可直接用于帶菌植物和田間罹病樣品的檢測，且不需要PCR儀等昂貴設備，僅用水浴鍋或者保溫杯即可實現(xiàn)該檢測過程；成本低廉，與目前應用于田間青枯菌檢測的阿格迪（Agdia?）試紙條相比，此方法在顯著提高靈敏度的同時大大降低了成本，具有廣闊的應用前景。

目前，青枯菌帶菌土壤的檢測方法主要包括平板分離培養(yǎng)、BIO-PCR、土壤DNA常規(guī)PCR和實時熒光定量PCR等，這些方法各有利弊，均可用于土壤樣品的檢測，但亦都存在耗時較長或需特殊儀器等不足，無法實現(xiàn)田間快速檢測。本研究曾試圖采用 LAMP法對疫區(qū)大田自然土懸浮液直接進行檢測，但發(fā)現(xiàn)該方法與土樣直接PCR檢測法存在同樣的制約瓶頸，即Bst酶（LAMP擴增體系）與Taq酶（PCR擴增體系）一樣受到土壤中腐植酸等的抑制因子的干擾，無法有效完成對靶序列的擴增。因此，可將土壤DNA快速提取試劑盒與青枯菌LAMP檢測方法相結合，實現(xiàn)大田土壤的青枯菌快速檢測。

4 結論

優(yōu)化了青枯菌的LAMP檢測方法，可用于病原菌的快速、高效、特異的檢測，適合科研單位和生產(chǎn)基層使用。在青枯病的早期診斷方面發(fā)揮作用，可為青枯病的科學防治提供技術保障。

References

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（責任編輯 岳梅）

Development of a LAMP Approach for Detection of Ralstonia solanacearum

HUANG Wen1，2， XU Jin2， ZHANG Hao2， XU Jing-sheng2， DING Wei1， FENG Jie2
（1College of Plant Protection， Southwest University， Chongqing 400716；2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193）

Abstract：【Objective】Bacterial wilt of plants， caused by Ralstonia solanacearum， is one of the most devastating soil-bornediseases in the worldwide and severely restricts production of economically important crops. Simple and sensitive detection assay is the basis for effective prevention and control. The objective of this study is to establish a rapid and specific method for detection of R. solanacearum using an isothermal method known as loop-mediated isothermal amplification （LAMP）， to make it possible for researchers and technical staff achieve simple detection of this pathogen. 【Method】 Four specific LAMP primers were designed to target the lpxC of R. solanacearum using online design software Primer Explorer Version 4.0， the inner primers are FIP （5′-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT-3′） and BIP （5′-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCG GCTGCAACTG-3′） ， the outer primers are F3 （5′-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3′） and B3 （5′-ACCGCAACACGGGATCA-3′）. Single-factor experiments were conducted to optimize the parameters of the reaction system， the reaction temperatures were set ranging from 60 to 65℃， the concentrations of Mg2+were set ranging from 2 to 12 mmol·L-1， the concentration ratios of inner and outer primers were set ranging from 2∶1 to 12∶1. The specificity of LAMP was tested by using 24 strains of R. solanacearum isolated from different hosts and 5 different strains of non R. solanacearum （Ralstonia mannitolilytica， Ralstonia pickettii， Enterobacter sp.， Acidovorax citrulli， Burkhoderia cepacia）， of which 3 species are closely related to R. solanacearum and the others are common bacteria in nature. The sensitivities of LAMP and PCR for detecting R. solanacearum were compared by using ten-fold serially diluted DNA of GMI1000 as templates （including original DNA， 101， 102， 103， 104， 105， 106， and 107times of diluent）. The LAMP method was used to detect the mixture of potato tissue and strain Po41， mixture of ginger tissue and strain Z-Aq-1， also to detect the wilted tomato plant inoculated with R. solanacearum strain Po82 and the health one. Furthermore， the samples of potatoes which may be infected by R. solanacearum were detected by LAMP method. The results of LAMP could be observed by the magnesium pyrophosphate precipitate produced during the reaction， or by the color changing after adding SYBR Green Ⅰ， the positive samples were green and negative ones were orange.【Result】The LAMP assay for rapidly and specifically detecting R. solanacearum was established. In this reaction system， the reacting temperature was determined as 63℃ and the concentrations of Mg2+was 6 mmol·L-1， the concentration ratios of inner and outer primers was 8∶1 （1.6∶0.2 μmol·L-1）. The result of specificity test showed that only the reaction liquids with the DNA of R. solanacearum change green， which indicated this method had a good specificity. Sensitivity experiments indicated that LAMP could detect original DNA， 101， 102， 103， 104， and 105times of diluent， the sensitivity was 1.42 pg which is 10 times higher than conventional PCR. Also this assay could quickly and accurately detect R. solanacearum from plant tissue suspension， diseased plants as well as infected potato tubers sampled in the field. 【Conclusion】 The LAMP assay established in this study had advantages of high sensitivity， specificity， efficiency and low cost over traditional methods and conventional PCR， the reaction results could be directly observed by naked eyes. All the characteristics of LAMP made it suitable to be widely used in field and grass-roots units.

Key words：Ralstonia solanacearum； detection； LAMP

收稿日期：2016-02-15；接受日期：2016-04-17

基金項目：國家自然科學基金（31272008，31371908）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303015）、 國家科技支撐計劃（2015BAD08B03）