6種中藥成分對豬傳染性胃腸炎病毒的體外抑制作用

金修哲，何　雷，程相朝，張春杰，余祖華，韓海鋒，楊丹芳，梅京京，李銀聚

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽471003）

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6種中藥成分對豬傳染性胃腸炎病毒的體外抑制作用

金修哲，何雷，程相朝，張春杰，余祖華，韓海鋒，楊丹芳，梅京京，李銀聚

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽471003）

摘要：【目的】為探討連翹苷等 6種中藥成分抗豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的作用機(jī)制，明確其體外抗病毒作用效果，為抗TGEV的藥物篩選提供依據(jù)?！痉椒ā坷脛?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，采用MTT比色法和細(xì)胞病變（CPE）觀察法相結(jié)合，測定連翹苷、連翹苷元、綠原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚6種中藥成分不同濃度下對豬睪丸細(xì)胞（ST）的毒性作用，通過觀察細(xì)胞CPE情況，確定藥物對細(xì)胞作用的最大安全濃度；同時(shí)測定病毒的TCID50，用細(xì)胞維持液配成100·TCID50病毒懸液備用；將6種藥物在最大安全濃度范圍內(nèi)連續(xù)2倍倍比稀釋后，分別采用先感染病毒后加藥、先加藥后感染病毒、藥與病毒混合后感染細(xì)胞3種不同作用方式進(jìn)行體外增殖抑制試驗(yàn)，各試驗(yàn)組均設(shè)置正常細(xì)胞對照組和病毒對照組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，通過酶標(biāo)儀測得630 nm處OD值，計(jì)算出不同作用方式下中藥成分分別對TGEV的抑制率，篩選出抗TGEV活性較好的中藥成分，并分別記錄抗病毒效果最佳時(shí)藥物的濃度；6種中藥成分與病毒作用后，測定TGEV的病毒滴度并進(jìn)行比較分析、RT-PCR鑒定各個(gè)藥物單體對病毒RNA合成的抑制情況，進(jìn)一步明確各中藥成分對TGEV的抑制作用?！窘Y(jié)果】連翹苷、連翹苷元、綠原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚的最大安全濃度分別為320、200、80、125、100、200 μmol·L-1；抗病毒效果最佳時(shí)藥物的濃度分別為：160、100、20、62.5、25、100 μmol·L-1。根據(jù)Karber法計(jì)算出初始TGEV的TCID50為10-6.25/0.1 mL；6種中藥成分對TGEV在ST細(xì)胞上均有一定的增殖抑制作用，其中咖啡酸濃度為62.5 μmol·L-1時(shí)與100·TCID50病毒混合作用后的病毒增殖抑制效果最好，相互作用72 h時(shí)，細(xì)胞形態(tài)依然能夠保持圓滑、無固縮、完整，且細(xì)胞間輪廓清晰，僅有少量細(xì)胞脫落、死亡；此時(shí)測上清病毒的 TCID50為10-3.75/0.1 mL，結(jié)果顯示咖啡酸組病毒含量比病毒對照組10-6.45/0.1 mL差異極顯著（P＜0.01）；通過酶標(biāo)儀測得630 nm處OD值計(jì)算出抑制率能夠達(dá)到84.4％，咖啡酸直接滅活病毒作用極其顯著。其次是連翹苷、連翹苷元、綠原酸、丹皮酚及丁香酚，其病毒滴度分別為：10-4.75、10-5.55、10-5.55、10-5.65、10-5.75/0.1 mL，但是這幾種中藥成分對病毒的抑制作用不夠顯著，抑制率大多在50％以下。另外，各中藥成分對TGEV在ST細(xì)胞上的增殖抑制作用均為對TGEV的直接滅活作用最好，其次為對TGEV吸附阻斷作用，最后為對TGEV的復(fù)制阻斷作用。RT-PCR鑒定中藥成分對病毒抑制作用，結(jié)果顯示咖啡酸組條帶與病毒對照組相比較暗，病毒效價(jià)較低，對病毒抑制作用效果顯著；其次是連翹苷、連翹苷元、綠原酸、丹皮酚及丁香酚。【結(jié)論】6種中藥成分在ST細(xì)胞上對TGEV均有一定的增殖抑制作用，其中咖啡酸直接滅活病毒作用最顯著，有望被開發(fā)成抗病毒藥物。

關(guān)鍵詞：中藥成分；豬傳染性胃腸炎病毒；抗病毒作用；咖啡酸

聯(lián)系方式：金修哲，E-mail：jinxiuzhe999@126.com。通信作者李銀聚，E-mail：lyj6511@126.com。通信作者何雷，E-mail：helei4280546@163.com

0 引言

【研究意義】豬傳染性胃腸炎（swine transmissible gastroenteritis， TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（swine transmissible gastroenteritis virus， TGEV）引起的一種高度傳染性豬病。TGEV是冠狀病毒屬成員之一，為單股正鏈RNA病毒。該病毒感染可導(dǎo)致仔豬嚴(yán)重腹瀉、嘔吐，一周齡以下仔豬死亡率極高，是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒［1］。因此，對于這種嚴(yán)重的現(xiàn)象亟待找到合適的藥物來控制疫情的發(fā)生。本研究根據(jù)已有的研究資料選取了連翹苷等6種中藥成分進(jìn)行試驗(yàn)。其提取工藝不盡相同，其中連翹苷、連翹苷元［2］和咖啡酸［3］可通過響應(yīng)面法提取，前兩者溶于極少量的二甲基亞砜，以細(xì)胞維持液稀釋成所需濃度用于體外試驗(yàn)，后者可由蒲公英等植物中提取，此工藝簡單、穩(wěn)定，其中超聲波時(shí)間、功率及料液比是影響提取純度的主要因素。綠原酸［4］可由金銀花等植物通過微波法提取，微波功率、溫度、時(shí)間，乙醇濃度、pH等會對提取效率產(chǎn)生影響。丁香酚［5］可由木犀科丁香屬關(guān)東丁香等植物中提取，超臨界二氧化碳萃取法是提取丁香酚的最佳方法，具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗病毒等藥理活性。丹皮酚［6］可由牡丹皮中提取，一般采用正交試驗(yàn)法，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒等藥理活性?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，中草藥抗病毒藥物的研發(fā)已經(jīng)成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，相關(guān)研究表明中藥單體成分可以成為良好的潛在抗病毒藥物［7］。連翹苷和連翹苷元均由木犀科連翹屬植物連翹的干燥果實(shí)中提取獲得，具有很強(qiáng)的抗菌、抗病毒和抗氧化活性，連翹對呼吸道合胞病毒有抑制作用［8］。綠原酸是植物體在有氧呼吸過程中合成的一種苯丙素類物質(zhì)，具有清除自由基、抗菌消炎、抗病毒等多種功效。2009年，陳娟娟等［9］發(fā)現(xiàn)綠原酸能抑制人巨細(xì)胞病毒。2015年，HUANG等［10］研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚具有抗HBV活性的作用。通過篩選出具有抗病毒效果較好的中藥成分，既可以發(fā)揮中草藥的藥物效果，也有利于藥物的定量應(yīng)用，在中草藥藥物研發(fā)中獨(dú)具優(yōu)勢?？Х人釋儆袡C(jī)酸、酚酸類化合物，廣泛存在于植物中，基于咖啡酸特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其具有優(yōu)異的抗氧化活性［11］。藥理學(xué)研究表明，咖啡酸具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗病毒等功效［12］。同時(shí)咖啡酸對于慢性鋁過負(fù)荷鼠腦損傷、神經(jīng)元退變有明顯保護(hù)作用［13］。RAJENDRA等［14］報(bào)道咖啡酸通過上調(diào)胞內(nèi)活性氧水平，進(jìn)而阻滯人纖維肉瘤細(xì)胞株增殖。不少關(guān)于TGEV致病機(jī)制的研究，主要集中在其結(jié)構(gòu)蛋白方面，TGEV有4種結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突蛋白（S）、核蛋白（N）、膜結(jié)合蛋白（M）和小膜蛋白（sM）。2013年，高長春等［15］發(fā)現(xiàn)豬源益生菌能夠體外抗豬傳染性胃腸炎病毒。2014年DING等［16］發(fā)現(xiàn)TGEV核殼體蛋白能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。另有研究表明，敗醬草［17］、木犀草素［18］、接骨木花色苷［19］、黃芩苷［20］等均有一定的抑制TGEV病毒增殖作用。中藥成分的復(fù)雜性及作用靶點(diǎn)的多樣性決定了對其進(jìn)行生物學(xué)評估的艱巨性，加大了研究中藥抗病毒作用機(jī)理的難度［21］。認(rèn)識中藥抗病毒的作用機(jī)制，開發(fā)新的藥物，降低疾病對養(yǎng)殖業(yè)造成的損失是本研究最終目的?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】研究中所選擇的 6種中藥成分，在之前相關(guān)的研究中均未報(bào)道過。另外，相對于中草藥，提取的中藥成分對于細(xì)胞的損傷和副作用相對較小，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，有利于準(zhǔn)確的定量應(yīng)用。【擬解決的關(guān)鍵問題】以TGEV為研究對象，從多種中藥成分中篩選出能夠抑制此病毒的藥物成分，為抗病毒藥物的研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

中藥成分抗病毒試驗(yàn)于2014年10月至2015年9月在河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試劑與儀器

中藥成分連翹苷、連翹苷元、綠原酸、咖啡酸、丁香酚由河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，丹皮酚由河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院楊國棟老師饋贈(zèng)，純度均大于98％；DMEM培養(yǎng)基和二甲基亞砜（DMSO）均購自Sigma公司；MTT購自Gibco公司；新生牛血清購自四季青生物公司；ST細(xì)胞由河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司；主要儀器：CO2培養(yǎng)箱，購自Napco公司；酶標(biāo)儀，購自美國Bio-Tek公司。

1.2 病毒與細(xì)胞

豬睪丸（Swine testis， ST）細(xì)胞和TGEV由河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。將TGEV病毒接種到ST細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，按照Karber法測定病毒半數(shù)組織細(xì)胞感染量（TCID50）為10-6.25/0.1 mL，用細(xì)胞維持液配成100·TCID50病毒懸液備用。

1.3 方法

1.3.1 病毒TCID50的測定 將TGEV連續(xù)10倍稀釋，將各稀釋度的病毒接種于長滿 96孔板單層的 ST細(xì)胞，置5％ CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，設(shè)正常細(xì)胞對照。每隔12 h觀察CPE，記錄病變孔數(shù)，根據(jù)Karber法，計(jì)算病毒的TCID50，lgTCID50=L-D（S-0.5）（L：最高稀釋度的對數(shù)，D：稀釋度對數(shù)之間的差，S：陽性孔比率總和）。

1.3.2 中藥成分對ST細(xì)胞最大安全濃度的測定 用細(xì)胞維持液將連翹苷、連翹苷元、綠原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚6種中藥成分分別配制成40、40、250、40、80、10 mmol·L-1，微孔濾膜過濾，二倍稀釋法加入長滿96孔板單層的ST細(xì)胞，每孔100 μL，每個(gè)濃度 3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照，置 5％ CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)72 h，每天觀察CPE情況并記錄。

1.3.3 6種中藥成分不同給藥方式對TGEV增殖抑制作用 （1）藥物對TGEV復(fù)制阻斷作用：將100·TCID50病毒加入長滿單層的96孔板細(xì)胞中，每孔100 μL，37℃吸附1.5 h后，PBS清洗3遍，加入含藥最大安全濃度內(nèi)2倍倍比稀釋的維持液，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，每隔24 h換含藥維持液繼續(xù)培養(yǎng)。（2）藥物對TGEV吸附阻斷作用：將最大安全濃度內(nèi)2倍倍比稀釋的藥物加入長滿單層ST細(xì)胞的96孔板中，37℃吸附1.5 h后，PBS清洗3遍，加入100·TCID50病毒，每孔100 μL，吸附1.5 h后，PBS清洗3遍，加入細(xì)胞維持液培養(yǎng)，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)。（3）藥物對TGEV直接滅活作用：將最大安全濃度內(nèi) 2倍倍比稀釋的藥物與100·TCID50病毒液37℃作用1.5 h后，將混合液加入長滿單層ST細(xì)胞的96孔板中，37℃吸附1.5 h后，PBS清洗3遍，加細(xì)胞維持液培養(yǎng)，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)。以上3種給藥方法，各組均設(shè)細(xì)胞對照組、病毒對照組。在37℃ 5％ CO2條件下培養(yǎng)，每12 h觀察并記錄CPE，72 h后，每孔加入5 g·L-1MTT 20 μL，37℃孵育4 h后，棄液體，每孔加入100 μL DMSO，37℃震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測OD630值。用以下公式計(jì)算藥物對病毒的抑制率：抑制率=（OD藥物-OD病毒）/（OD細(xì)胞-OD病毒）×100％。然后根據(jù)抑制率，明確抗病毒效果較好的作用方式，同時(shí)通過病毒滴度的測量確定最佳用藥濃度。

1.3.4 6種中藥成分對TGEV直接殺滅作用不同時(shí)間形態(tài)學(xué)的影響 將6種中藥成分的最佳藥效濃度分別與TGEV混合后作用，置5％ CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，設(shè)正常細(xì)胞對照組、病毒對照組，分別于12、24、36、48、60、72 h時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)，記錄CPE情況。

1.3.5 3種不同作用方式對TGEV病毒滴度的影響 6種藥物均在最佳作用濃度下分別與TGEV作用72 h后，取病毒液上清，分別將 TGEV病毒液連續(xù) 10倍稀釋，各稀釋度的病毒接種于長滿96孔板單層的ST細(xì)胞，設(shè)正常細(xì)胞對照。每隔12 h觀察細(xì)胞病變，記錄病變孔數(shù)，根據(jù) Karber法，計(jì)算病毒的TCID50。

1.3.6 6種中藥成分組分別與TGEV組對ST細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 按照抗病毒效果最佳時(shí)藥物的濃度分別配為：160、100、20、62.5、25、100 μmol·L-1，與100 TCID50TGEV病毒液作用于長滿單層細(xì)胞的 96孔板上，置5％ CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，設(shè)細(xì)胞對照組和病毒對照組，使用倒置顯微鏡觀察24、48、72 h時(shí)細(xì)胞形態(tài)變化并留圖，對各組CPE進(jìn)行分析判斷。

1.3.7 RT-PCR對6種中藥成分與TGEV作用后病毒的鑒定 將正常ST細(xì)胞消化后，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待孔內(nèi)細(xì)胞生長至60％—70％匯合度時(shí)，將TGEV 與 6種中藥成分均在最佳作用濃度下分別以4×100·TCID50的量感染各孔細(xì)胞。72 h后，收集細(xì)胞上清500 μL，并提取總RNA。用cDNA第一鏈合成試劑盒在20 μL的RT反應(yīng)體系進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，之后以cDNA為模板進(jìn)行M基因的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：cDNA模板2 μL、Mix 12.5 μL、上游引物：5′-ACTGAATTCTGATGAAGATTTTGTTAAT TAGCG-3′；下游引物：5′-GTAGGATCCGCTACCATA TATGTAATAATTTTTCTTG-3′各 1 μL、ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：94℃ 4 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析處理 利用SPSS 18.0軟件對組間病毒抑制率及其病毒滴度的差異性進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒TCID50的測定

細(xì)胞形態(tài)觀察TGEV在96 h時(shí)各病毒稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，計(jì)算出現(xiàn)CPE孔的比率（表1）。根據(jù)Karber法，lgTCID50=L-D（S-0.5），計(jì)算得：TCID50= 10-6.25/0.1 mL。

表1　細(xì)胞病變孔數(shù)結(jié)果Table 1 The result of cell lesion numbers

2.2 中藥成分對ST細(xì)胞最大安全濃度測定

在藥物的最大安全濃度的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)，能夠有效地避免由藥物自身毒性對細(xì)胞生長的影響，增加了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。將分別加藥的各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，與空白對照組比較，無退變、變形和脫落的最高藥物稀釋度為藥物對 ST細(xì)胞的最大安全濃度，測定結(jié)果見表2。

2.3 中藥成分對TGEV體外抑制作用

MTT法測得OD630，計(jì)算出各中藥成分在最佳藥效濃度時(shí)對 TGEV直接滅活作用的抑制率見表3。6種中藥成分對TGEV在ST細(xì)胞增殖中均有一定的抑制作用。各中藥成分對TGEV在ST細(xì)胞上的增殖抑制作用均為對TGEV的直接滅活作用最好，其次為對TGEV吸附阻斷作用，最后為對TGEV的復(fù)制阻斷作用；6種中藥成分中，咖啡酸濃度為62.5 μmol·L-1時(shí)對TGEV抑制率最高，復(fù)制阻斷作用為50.72％，吸附阻斷作用為 65.39％，直接滅活作用為 84.44％，直接滅活作用顯著。

表2　中藥成分對ST細(xì)胞最大安全濃度試驗(yàn)Table 2 The result of Chinese herbal monomers on maximum safe concentration test of ST cell （μmol·L-1）

2.4 6種中藥成分最佳藥效濃度結(jié)果

通過2.3得出的藥物對TGEV抑制率，判斷出藥物直接滅活作用效果較好，此時(shí)，6種中藥成分最大安全濃度內(nèi)分別2倍倍比稀釋后與100·TCID50作用，分別測定直接滅活病毒時(shí)不同藥物濃度對病毒作用后病毒TCID50，根據(jù)病毒滴度判斷藥物效果最佳濃度，如圖1所示，連翹苷、連翹苷元、綠原酸、咖啡酸、丁香酚和丹皮酚的最佳藥效濃度分別為：160、100、20、62.5、25、100 μmol·L-1。

2.5 6種中藥成分對TGEV直接殺滅作用不同時(shí)間形態(tài)學(xué)的觀察

倒置顯微鏡觀察6種中藥成分在最佳藥效濃度時(shí)對TGEV病毒作用12、24、36、48、60、72 h時(shí)，細(xì)胞病變情況，如表4所示，ST細(xì)胞在72 h內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)完整，基本無細(xì)胞死亡；病毒對照組，在接毒24 h時(shí)開始發(fā)生病變，在48 h時(shí)病毒快速增殖，大部分細(xì)胞脫離單層、死亡；6種中藥單體與病毒作用組，48 h時(shí)，除了咖啡酸組仍能有正常細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞數(shù)目增加，折光性良好，其余各組都發(fā)生明顯病變，大部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞固縮、破碎，發(fā)生死亡。與病毒對照組比較，咖啡酸能明顯抑制TGEV的增殖。

2.6 3種不同作用方式對TGEV病毒滴度的影響

3種不同作用方式下，計(jì)算不同中藥成分在最佳藥效濃度下對病毒抑制作用后的病毒滴度，如圖2，6種病毒的 TCID50與病毒對照組相比均有一定的差異。6種中藥成分對TGEV復(fù)制阻斷作用試驗(yàn)后測得病毒TCID50分別為10-5.75、10-6.25、10-6.35、10-4.25、10-6.15、10-6.45/0.1 mL；6種中藥成分對TGEV吸附阻斷作用試驗(yàn)后測得TCID50分別為10-5.25、10-5.75、10-6.15、10-3.75、10-6.05、10-6.15/0.1 mL；6種中藥成分對 TGEV直接殺滅作用試驗(yàn)后測得 TCID50分別為10-4.75、10-5.55、10-5.55、10-3.25、10-5.75、10-5.65/0.1 mL；病毒對照組TCID50為10-6.45/0.1 mL。各組內(nèi)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，直接殺滅作用效果均好于吸附阻斷作用和復(fù)制阻斷作用。病毒滴度的大小可直接反映出病毒量的多少，同時(shí)反映出藥物對于病毒抑制作用的大小。其中咖啡酸與TGEV混合作用后上清的病毒滴度10-3.75/0.1 mL與病毒對照組TCID5010-6.45/0.1 mL相比差異極顯著（P＜0.01），說明咖啡酸能抑制TGEV增殖和延長ST細(xì)胞的脫落時(shí)間，對細(xì)胞的生長起到保護(hù)作用。而其他5種中藥成分抗病毒效果則不夠顯著，僅能夠在短時(shí)間內(nèi)保護(hù)細(xì)胞生長，隨著病毒不斷地增殖，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)病變直至完全脫落、死亡。

圖1　中藥成分與TGEV作用后TCID50測定Fig. 1 The determination result after effected between Chinese traditional medicine components and TGEV

表4　中藥成分對TGEV直接殺滅作用不同時(shí)間ST細(xì)胞CPETable 4 The result of CPE on ST cell about Chinese herbal monomers killed TGEV directly in different time

圖2　不同藥物對TGEV病毒滴度的影響Fig. 2 Different drug treatment groups effect to TCID50of TGEV

2.7 6種中藥成分分別與TGEV作用對ST細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察

使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，如圖3所示，分別對6種中藥成分最佳藥物濃度下與TGEV作用24、48、72 h后觀察細(xì)胞形態(tài)，ST細(xì)胞對照組在72 h內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)完整；病毒對照組24 h出現(xiàn)病變，病毒開始繁殖，表現(xiàn)為細(xì)胞固縮、脫落、不圓滑；48 h后，大部分細(xì)胞固縮、脫落、變圓，發(fā)生嚴(yán)重病變；72 h時(shí)大部分細(xì)胞破碎、脫落、死亡。分別加入6種中藥成分處理后，ST細(xì)胞脫落時(shí)間延長，在最佳抗TGEV濃度處理時(shí)，24 h時(shí)細(xì)胞生長密集，狀態(tài)良好；48 h時(shí)病毒大量增殖，除了咖啡酸外其他5種加藥細(xì)胞均有部分細(xì)胞脫落、死亡；72 h時(shí)除咖啡酸外其他5種加藥細(xì)胞均受到TGEV的影響，細(xì)胞大部分破碎、脫落、死亡。TGEV侵染ST細(xì)胞在咖啡酸濃度為62.5 μmol·L-1處理時(shí)，細(xì)胞死亡較少，形態(tài)完整，折光性良好，治療效果較好，咖啡酸能明顯抑制TGEV的增殖。

2.8 RT-PCR鑒定TGEV

將細(xì)胞對照組、病毒對照組及6種中藥成分在最佳藥效濃度下與TGEV作用后上清，分別提取mRNA，以mRNA為模板進(jìn)行RT-PCR，成功的擴(kuò)增了TGEV M基因的DNA片段，其均全長為789 bp，共編碼263個(gè)氨基酸，均與預(yù)期結(jié)果一致（圖 4），核苷酸與氨基酸序列和TGEV的M序列相似性為99.7％和99.6％。其中，第6組為咖啡酸與病毒直接殺滅組，其條帶亮度與病毒對照組和另外幾組相比較弱，說明咖啡酸組病毒量低于其他各組，咖啡酸對于TGEV起到了較好的增殖抑制作用，其對于藥物的研發(fā)有一定價(jià)值。

3 討論

中藥抗病毒的研究已經(jīng)成為本研究領(lǐng)域熱點(diǎn)，篩選出具有抗病毒效果較好的中藥成分，對藥物的研發(fā)有重要意義［22］?？共《局兴幊煞值暮Y選分體內(nèi)篩選和體外篩選，體內(nèi)篩選方法是通過病毒接種動(dòng)物，然后服用抗病毒中藥成分，觀察試驗(yàn)動(dòng)物的臨床表現(xiàn)，并計(jì)算肺病變指數(shù)、動(dòng)物存活率等以衡量藥物的抗病毒效果［23］。但是，體內(nèi)篩選有消耗大量人力物力、試驗(yàn)條件不易控制等弊端［24］。體外篩選藥物，可在短期、少量情況下判斷中藥成分抗病毒的廣度和強(qiáng)度，是篩選抗病毒藥物的有效方法。常用的方法是病毒致細(xì)胞病變抑制法、染料攝入法、MTT法等［25］。病毒致細(xì)胞病變抑制法，即通過觀察加藥后接毒細(xì)胞是否出現(xiàn)CPE判斷藥物的抗病毒功效，該法比較直觀，但無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，所以本試驗(yàn)結(jié)合了MTT法，對藥物在抗病毒情況下活細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，使結(jié)果更加客觀。

目前，人們研究發(fā)現(xiàn)中藥單體成分發(fā)揮作用大概通過三種途徑，第一、中藥血清學(xué)研究中藥成分抗病毒作用，通過檢測血清中的有效成分，能夠反映中藥進(jìn)入機(jī)體后的變化，明確發(fā)揮抗病毒作用的中藥成分［26］。第二、從分子水平研究中藥成分抗病毒機(jī)制，通過檢測病毒DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯某一環(huán)節(jié)是否被抑制，或者病毒吸附到細(xì)胞受體、脫殼、裝配等是否被中藥成分阻斷［27］。第三、中藥成分通過提高機(jī)體免疫力抗病毒，比如誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素、提高T細(xì)胞的殺傷能力、促進(jìn)特異性抗體產(chǎn)生等途徑［28］。本研究分別從中藥成分抑制病毒吸附、抑制病毒復(fù)制、直接殺滅病毒三個(gè)方面進(jìn)行初步研究，檢測指標(biāo)主要是藥物與病毒作用后細(xì)胞生長狀態(tài)及細(xì)胞存活率。運(yùn)用MTT法、細(xì)胞病變觀察法、病毒滴度的測量、RT-PCR鑒定病毒，篩選出了抗病毒效果較好的中藥成分，驗(yàn)證了其對病毒的直接殺滅作用。采取對應(yīng)的提取工藝可以從中草藥中提出多種提取物，如生物堿類、黃酮類、蒽醌類、內(nèi)酯類和多糖類等是中藥的關(guān)鍵活性成分。2005年，姜成剛等［17］研究發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根、魚腥草和敗醬草均對TGEV具有抑制增殖作用，但是，由于中草藥成分的復(fù)雜性，其發(fā)揮抗病毒作用的主要藥物成分不夠明確，而本研究則更加明確藥物成分，能夠精確、定量地發(fā)揮藥效，藥物成分提取工藝成熟、簡單、純度高，能夠有效降低生產(chǎn)成本。本研究中中藥成分直接殺滅作用效果好于復(fù)制阻斷作用與吸附阻斷作用，與張為民等［20］研究的黃芩素對TGEV直接殺滅作用優(yōu)于其他兩種作用方式的結(jié)果相一致，均表達(dá)了中藥有效成分研究對藥物開發(fā)的重要性，能夠高效、準(zhǔn)確、靈敏地發(fā)揮藥效。

圖3　體外培養(yǎng)24、48、72 h對ST細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響Fig. 3 The influence to ST cell morphology after 24， 48， 72 h in vitro culture （200×）

M： DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：細(xì)胞對照組PCR產(chǎn)物；2、3、4、5、6、7：分別為連翹苷組、連翹苷元組、綠原酸組、丁香酚組、咖啡酸組、丹皮酚組PCR產(chǎn)物；8：病毒對照組PCR產(chǎn)物M： DNA marker DL2000； 1： PCR products of control group； 2， 3， 4， 5， 6， 7：PCR products of phillyrin， forsythiaside， chlorogenic acid， eugenol， caffeic acid and paeonol； 8： PCR products of virus control圖4　TGEV M基因的PCRFig. 4 Amplification results of PCR of M gene

OD值的大小反映活細(xì)胞數(shù)量的多少，也反映細(xì)胞的病變程度，間接地反映病毒的增殖程度［29］。根據(jù)測出的OD值，計(jì)算出抑制率，細(xì)胞病變觀察法結(jié)合病毒TCID50的測定，比較中藥成分與病毒作用后TCID50，能更加直觀地判斷出藥物對病毒的抑制作用。試驗(yàn)中能夠增殖 TGEV的細(xì)胞常用的有PK-15和ST細(xì)胞，本研究采用ST細(xì)胞進(jìn)行體外試驗(yàn)有以下兩點(diǎn)原因：一、ST細(xì)胞體外貼壁生長，單層細(xì)胞形態(tài)良好情況下，細(xì)胞輪廓比PK-15清晰，可連續(xù)傳代培養(yǎng)，攻毒之后，細(xì)胞病變更便于識別［30］。二、ST細(xì)胞對于TGEV的敏感性要高于PK-15細(xì)胞［31］，攻毒之后，ST細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)間比 PK-15提前，毒價(jià)高出很多。尤其是在疫苗的制備上，選用合適的細(xì)胞株增殖病毒能夠提高效價(jià)，使疫苗的免疫原性良好，增加產(chǎn)量，減少成本。本研究發(fā)現(xiàn)咖啡酸對TGEV具有顯著的直接殺滅效果，并且在抑制病毒復(fù)制方面，咖啡酸效果也優(yōu)于其他5種藥物，連翹苷的作用效果同樣顯著，當(dāng)濃度為 160 μmol·L-1時(shí)，抑制率能夠達(dá)到 51.3％，其具有抑制病毒增殖作用，對于新藥的研發(fā)有一定的價(jià)值。6種中藥成分直接殺滅作用效果好于吸附阻斷作用，最后是復(fù)制阻斷作用，這與 2014年郝寶成等［32］研究的苦馬豆素對牛病毒性腹瀉病毒抑制作用中，復(fù)制抑制作用效果好于吸附抑制作用的結(jié)論不同，可能是由于藥物對特定病毒在合適的條件下才會發(fā)揮保護(hù)作用。推測其抗病毒的主要效應(yīng)可能是中藥成分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)抑制TGEV的復(fù)制增殖以及直接滅活游離TGEV而發(fā)揮作用，但其確切的作用機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。該發(fā)現(xiàn)既豐富了咖啡酸的研究資料，也為TGEV的治療提供了新的方法，為抗病毒藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，從藥理基礎(chǔ)和臨床方面均值得繼續(xù)深入研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)選擇的6種中藥成分對TGEV均有一定的抑制作用，且直接殺滅作用均好于復(fù)制阻斷作用和吸附阻斷作用。其中，咖啡酸效果最佳，當(dāng)咖啡酸濃度為62.5 μmol·L-1時(shí)，抑制率達(dá)到84.4％，直接滅活作用顯著。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Effect of Six Chinese Traditional Medicine Components on Inhibiting Swine Transmissible Gastroenteritis Virus in vitro

JIN Xiu-zhe， HE Lei， CHENG Xiang-chao， ZHANG Chun-jie， YU Zu-hua， HAN Hai-feng， YANG Dan-fang，MEI Jing-jing， LI Yin-ju
（College of Animal Science and Technology/Laboratory of Animal Disease and Public Health， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， Henan）

Abstract：【Objective】To evaluate the antiviral activity mechanism action of phillyrin and other Chinese traditional medicine components to swine transmissible gastroenteritis virus （TGEV）， to confirm the antiviral effect of the drug components in vitro， and therefore to provide scientific basis for screening drugs of antiviral activity to TGEV.【Method】Animal cell culture techniques， MTT detection and cytopathic effect （CPE） methods were used to determine the toxic effect of six Chinese traditional medicine components， including phillyrin， forsythiaside， chlorogenic acid， caffeic acid， eugenol and paeonol， on Swine testis （ST） cells. The maximum safe concentrations of the drugs on ST cells were determined by observing CPE of cells， virus TCID50was determined at the same time， and 100·TCID50with cell culture maintenance medium was prepared. The original solutions of the 6 drug components were diluted within the maximum safe concentration scope， and their antiviral effects for cell growth inhibition in vitro were measured with three arrangement routes： TGEV before drugs adding， TGEV after drugs adding and TGEV-and-drugs at the same time. Normal cell control and virus control were arranged for each testing group， with three replications for all treatments. The OD630was determined by using Eliasa approach， the rate of inhibition of six Chinese traditional medicine components to TGEV in different ways was determined， and the inhibition of the best Chinese traditional medicine component on the replication of TGEV was screened， the best antiviral effect concentration of each drug component was recorded. After the six Chinese traditional medicine components reacted with the TGEV， the TCID50， RT-PCR was used to evaluate the viral titer in the supernatant. Furthermore， the proliferation inhibition of six Chinese traditional medicine components on TGEV in ST cell was determined.【Result】The results showed that the highest safe concentrations of Phillyrin， Forsythiaside， Chlorogenic acid， Caffeic acid， Eugenol， Paeonol were 320，200， 80， 125， 100， 200 μmol·L-1， respectively； the best antiviral effect concentration were 160， 100， 20， 62.5， 25， 100 μmol·L-1，respectively. By using Karber method， the TCID50of initial TGEV was estimated to be 10-6.25/0.1 mL. All the six Chinese traditional medicine components had inhibition effects on TGEV in ST cells in vitro. In particular， caffeic acid at 62.5 μmol·L-1mixed with TGEV at 100·TCID50showed the best inhibition effect. With this caffeic acid treatment， 72 h after the test started， the tested cells could still keep smooth， without pycnosis， complete， and profile clear between cells， with only a few cells fell off， or death. At that moment， the measured TGEV TCID50was 10-3.75/0.1 mL in the supernatants. The results showed that the virus in treatment with caffeic acid was significantly different， compared to the virus control group with 10-6.45/0.1 mL （P＜0.01）. The inhibition rate reached 84.4％ according to the OD630value in the direct inactivation experiment. For other tested components， the TGEV TCID50of phillyrin， forsythiaside， chlorogenic acid， paeonol and eugenol were 10-4.75， 10-5.55， 10-5.55， 10-5.65， 10-5.75/0.1 mL， respectively， with no significant difference， compared to the virus control group， with most of the rate of inhibition below 50％. In addition， all of the six Chinese traditional medicine components had proliferation inhibition on TGEV in ST cells， directly killing effect was the most affective one， followed by adsorpt blocking effect， with replicate blocking effect behind. RT-PCR was used to evaluate the viral titer in the supernatant， the result showed that caffeic acid group was dark compared with the virus control group， the virus titer was low，inhibition effect was remarkable to virus. The next were Phillyrin， Forsythiaside， Chlorogenic acid， Paeonol and Eugenol. 【Conclusion】All the six Chinese traditional medicine components had proliferation inhibition on TGEV in ST cells， and caffeic acid showed the best inhibition effect. It has the potential to develop into the antiviral drugs.

Key words：Chinese traditional medicine component； swine transmissible gastroenteritis； antiviral effects； caffeic acid

收稿日期：2015-10-28；接受日期：2016-02-02

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31302105）、河南科技大學(xué)青年科學(xué)基金（2013QN017）