微波法提取蘋果皮類黃酮及其抗氧化性研究* 1

黃　慶，張河輝，吳笑臣，張熊祿

(贛南師范學院 化學化工學院，江西 贛州　341000)

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微波法提取蘋果皮類黃酮及其抗氧化性研究* 1

黃慶，張河輝，吳笑臣，張熊祿?

(贛南師范學院 化學化工學院，江西 贛州341000)

摘要：以蘋果皮為原料，采用微波法及單因素試驗，黃酮類化合物提取率為考察指標，優(yōu)選其最佳提取工藝；并以Trolox作為參照，對提取化合物進行抗氧化性實驗研究.結(jié)果表明：最佳提取工藝條件是溶劑60%乙醇，料液比1∶5(g/mL)，微波功率390 w，提取時間2 min，黃酮類化合物的提取率可達2.50%.且蘋果皮渣黃酮類化合物對GO·的清除率隨其濃度的增大而增大，最大清除率達到25.2%，說明目標物質(zhì)對機體內(nèi)自由基有較好的清除能力.

關(guān)鍵詞：黃酮類；蘋果皮；微波；Galvinoxyl自由基；Trolox；抗氧化

防衰老，抗衰老功能的研究是當前食品研究的重要領(lǐng)域，根據(jù)抗衰老自由基生物的理論，抗氧化能力成為抗衰老活性添加物篩選的主要依據(jù)[1-2]，如何從天然植物資源中提取出具有抑制自由基氧化能力的活性物質(zhì)是當前化學研究領(lǐng)域的熱點之一[3-4].

蘋果中富含黃酮類、多酚類、色素類等多種有重要作用的化學活性成分，且是我國四大水果之首，世界產(chǎn)量第一，營養(yǎng)豐富，人們喜愛的水果之一.其中蘋果中黃酮類化合物是優(yōu)良天然抗氧化劑，具有良好的生物和藥理活性[5-6]，有抗氧化、抗菌、增強骨質(zhì)、防輻射、抗動脈硬化，還可以預防腫瘤、心血管疾病等作用，且對人的身體沒有毒害作用[7-12].因此，開發(fā)和利用蘋果黃酮類化合物有著很好的實用價值. 蘋果皮渣或未成熟蘋果是廢棄物，如果不進行綜合開發(fā)利用，最大可能提取出這些所含豐富的黃酮類、多酚類、色素類等活性化合物，不僅浪費了寶貴的資源，還有污染環(huán)境的潛在危害. 近來年，關(guān)于蘋果中多酚的提取及抗氧化活性的研究較多，但是對蘋果皮中的黃酮類化合物及其抗氧化性的測定研究較少.

1材料與方法

1.1原料和試劑

新鮮蘋果,市售，產(chǎn)地為山東威海；Galvinoxyl自由基東京仁成工業(yè)株式會社，Trolox Sigma-Aldrich(st.Louis,MO)，無水乙醇(分析純)江蘇強盛功能化學股份有限公司.

1.2主要儀器設(shè)備

UV-7504型紫外可見分光光度計，上海精科實業(yè)有限公司；MCR-3型微波爐上海捷呈儀器有限公司；NB-XZ20型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司，電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；WBE-SDJ型電熱恒溫鼓風干燥箱，東莞市威邦儀器股份有限公司.

1.3實驗方法

1.3.1蘋果皮中的黃酮類提取流程

用果刀削新鮮蘋果皮，再用果刀將大塊的蘋果皮渣切成若干塊，緊接著稱取一定質(zhì)量的蘋果皮渣，然后用乙醇溶液做溶劑，在微波爐中回流提取3次，最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀得到蘋果皮渣黃酮類濃縮液.

1.3.2單因素對黃酮類提取率的影響

在不同的實驗條件下，進行3次重復實驗取平均值，分別考察回流時間、料液比、微波爐功率及溶劑濃度4個因素對黃酮類提取率的影響，并用紫外可見分光光度計測定其提取液的吸光度.4因素實驗設(shè)計如下：每組稱取2.07 g的蘋果皮渣，固定溶劑濃度60%的乙醇，微波功率390 W，料液比1∶5，分別回流1 min、2 min、3 min、4 min、5 min.每組稱取2.07 g的蘋果皮渣，設(shè)定回流時間2 min，微波功率390 W，溶劑濃度60%的乙醇，料液比(g/mL，下同)分別為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8.每組稱取2.04 g的蘋果皮渣，固定料液比1∶5，回流時間2 min，溶劑濃度60%的乙醇，分別用微波功率為130 W、260 W、390 W、520 W、585 W進行微波加熱.每組稱取2.06 g 蘋果皮渣，設(shè)定回流時間2 min，微波功率390 W，料液比1∶5，分別選擇40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇及水作為溶劑.

1.3.3蘋果皮渣黃酮類提取液的處理

在最佳工藝的條件下，收集所得到提取液，然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，收集濾液定容至50 mL，放在冰箱中儲存待用.

1.3.4蘋果皮渣黃酮類化合物的定量測定方法

蘋果皮渣黃酮類跟葛根中黃酮類的結(jié)構(gòu)相似，蘋果皮渣黃酮類的含量的測定參照文獻[11]方法進行，紫外可見分光光度波長選擇249 nm.

1.3.5蘋果皮渣黃酮類化合物清除GO·能力的測定

參照文獻[12]方法，實驗以Trolox為標準參照物，紫外可見分光光度波長選擇428 nm，繪制Trolox濃度對GO·的清除率工作曲線并建立回歸方程.根據(jù)工作曲線及回歸方程，計算和評價蘋果皮渣黃酮類對GO·相對清除能力.

圖1　葛根素標準曲線

圖2　回流時間對蘋果黃酮類提取率的影響

圖3　料液比與黃酮類提取率的影響

2結(jié)果與分析

2.1葛根素標準曲線回歸方程的建立

稱取5.05 g葛根素樣品，溶于無水乙醇中，定容至250 mL，做標準儲備溶液.分別吸取0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL的標準儲備溶液至25 mL比色管中，并用無水乙醇定容，配制成不同濃度(濃度分別為0、0.404、0.808、1.21、1.62、2.02 mg·mL-1)的標準溶液，在249 nm處測定葛根素不同濃度的吸光度，繪制葛根素工作曲線見圖1：

建立回歸方程為y=0.576x-0.012，R2=0.999,y表示葛根素的吸光度，x表示葛根素的濃度.

此方程可以用來測定提取的黃酮類的濃度.經(jīng)測定和換算，提取的黃酮類濃縮液的濃度為4.23 mg/mL.

2.2蘋果皮渣回流時間對蘋果黃酮類提取率的影響

分別對不同回流時間蘋果皮渣的提取液在紫外可見分光光度計中測量吸光度.經(jīng)過換算處理得到回流時間與提取率的關(guān)系圖(圖2).

由圖2可知，黃酮類提取率隨回流時間的增加而提高，后又逐漸減小，當回流時間達到2 min時，黃酮類的提取率達到2.5%的最大值.導致這種現(xiàn)象可能的原因是微波加熱，溶液溫度逐漸上升，引起分子摩擦增加，從而導致細胞膜破碎，有利于黃酮類化合物的溢出，提高了黃銅提取率；而隨著回流時間的延長，溶液溫度升高，熱效應(yīng)會破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，導致黃銅提取率的下降.

2.3料液比對黃酮類提取率的影響

根據(jù)不同料液比蘋果皮渣的提取液在紫外可見分光光度計中測量吸光度.經(jīng)過換算處理得料液比與提取率的關(guān)系圖(圖3).

由圖3可知，隨著料液比的升高，黃酮類提取率先升高，后減小，當料液比達到1∶5的時候，此時的黃銅提取率最大，繼續(xù)增加溶劑的量，提取率反而下降，這可能的原因是料液比降低，溶劑吸收了較多的熱，影響了黃酮類的溢出，從而導致黃酮類提取率的降低[8].

2.4微波爐功率對黃酮類提取率的影響

圖4　微波功率與黃酮類提取率影響

圖5　溶劑對黃酮類提取率影響

圖6　Trolox-GO·標準曲線

圖7　蘋果皮渣黃酮類樣品-GO·標準曲線

對不同微波功率加熱的蘋果皮渣提取液在紫外可見分光光度計中測量吸光度.經(jīng)過換算處理得到提取率與微波功率的關(guān)系圖(圖4).

由上圖可知，隨著微波功率加大，提取率在增加，但超過390 W(60%)后反而會降低，這可能的原因是微波功率過大，溶液溫度升高過快，隨提取液可能產(chǎn)生的蒸發(fā)而使黃酮類化合物一起蒸發(fā)損失，從而影響黃酮類的提取率[8].

2.5溶劑濃度對黃酮類提取率的影響

相同條件下，對蘋果皮渣提取液在紫外可見分光光度計中測量吸光度(圖5).

由圖5可知，水、乙醇作為提取劑都有較佳的提取效果，但是水沒有乙醇那么好，并且不同濃度的乙醇對黃酮類的提取率也有不同的效果，當乙醇濃度為60%時黃酮類的提取率最高，因此本實驗采用60%的乙醇作為溶劑.

2.6提取物抗氧化能力的測定

2.6.1Trolox-GO·標準曲線的建立

以溶于40%乙醇的Trolox溶液為標樣，以吸光值的減少值與trolox濃度作標準曲線如圖6，空白為0.2 mL的40%乙醇，得到清除率(y)與Trolox濃度(x)之間的回歸方程: Y=-2.438x+1.278R2 =0.996，y表示反應(yīng)后剩余的GO·的吸光度，x表示Trolox的濃度.

2.6.2建立蘋果皮渣黃酮類濃縮液-GO·工作曲線，評價蘋果皮渣黃酮類對GO·的清除能力

用10 μL微量進樣器分別移取0 μL、1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL上述蘋果皮渣黃酮類濃縮液于石英比色皿中，加入2 mL乙醇和2.8 μL GO·標液，充分震蕩，在25 ℃下反應(yīng)10 min，用UV-7504紫外可見分光光度計上測定吸光度，繪制蘋果皮渣黃酮類濃縮液-GO·工作曲線(圖7).

建立回歸方程為y=-0.25x+0.81，R2=0.990,y表示反應(yīng)后GO·的吸光度，x表示蘋果皮渣黃酮類濃度.由圖表明蘋果皮渣黃酮類對GO·具有清除能力；同時控制GO·濃度不變時可計算蘋果皮渣黃酮類的濃度或計算給定濃度的黃酮類對GO·的清除率大小.

結(jié)果表明，蘋果皮渣黃酮類對GO·的清除率隨其濃度的增大而增大，最后趨于穩(wěn)定，蘋果皮渣最大清除率達到25.2%.

3結(jié)論

由上分析可知，所提取的黃酮類化合物具有較強的自由基清除能力，但比Trolox的弱，Trolox作為維生素E類物質(zhì)的一種，也表現(xiàn)出良好的抗氧化性[11]，常用于藥物研制.由于黃酮類化合物具有較高的營養(yǎng)價值和安全性，這些年來，人們越來越喜歡用天然抗氧化劑.因此，選用Trolox作為蘋果皮渣黃酮類自由基清除能力測定的參照品，由此來評價蘋果黃酮類的抗氧化能力.本實驗的結(jié)果表明，蘋果皮渣黃酮類化合物提取的最佳實驗條件是：溶劑為60%的乙醇，料液比為1∶5(g/mL)，微波爐的功率為60%(390 W)，回流時間為2 min，此條件下最大吸光度為1.77%，即可得到蘋果皮渣黃酮類最多.且由實驗可知，蘋果皮渣黃酮類對GO·的清除率隨其濃度的增大而增大，即在以上最優(yōu)條件下蘋果皮渣黃酮類對GO·的清除率最大.

蘋果皮渣黃酮類對GO·具有一定的清除能力，本實驗清除能力達到25.2%，表明它對機體內(nèi)的自由基有清除能力，具有較好的抗氧化能力，在藥物開發(fā)方面有發(fā)展前景，但相對于標準物Trolox，其清除GO·的能力相對較弱.

參考文獻：

[1]趙保路.自由基、營養(yǎng)、天然抗氧化劑與衰老[J].生物物理學報，2010，26(1):26-36.

[2]李素云，王立芹，鄭稼琳，等.自由基與衰老的研究進展[J].中國老年學雜志，2007，27:46-48.

[3]張曉娟，祝鈞.橘子皮、柚子皮、橙子皮抗氧化活性物質(zhì)的提取與保存條件優(yōu)化[J].北京工商大學學報，2010,(3):25-30.

[4]黨美珠，付麗，張秀鳳，等.蘋果渣多酚類化合物的應(yīng)用研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014,(4):70-76.

[5]姚紅娟.蘋果中抗氧化黃酮類結(jié)構(gòu)和功能研究[D].洛陽：河南科技大學，2014：3-8.

[6]張敏.蘋果類黃酮類及其磺化衍生物抗腫瘤作用的研究[D].西安：陜西師范大學，2012:6-13.

[7]楊濱，黃璐琦.電化學分析法研究天然抗氧化劑的應(yīng)用及展望[J].中國中藥雜志，2002,27(12):881-883.

[8]王瑋，王琳.黃酮類化合物的研究進展[J].沈陽醫(yī)學院學報，2002，(2):4-7.

[9]鄒耀洪，李桂榮.黃酮類化合物清除活性氧自由基性能的研究[J].常熟高專學報,2001,(2):23-25.

[10]鄒耀洪，李桂榮.反相高效液相色譜分析楊梅葉中抗氧化成分黃酮類類化合物[J].分析化學,1998,26(5):531-535.

[11]方俊.葛根總黃酮的ADS系列吸附樹脂分離比較及其與環(huán)糊精包合研究[D].重慶：重慶大學，2009：15-16.

[12]王根女.紫蘇中酚類物質(zhì)的微波輔助提取工藝及其抗氧化能力研究[D].杭州：浙江大學，2010:21-22.

* 收稿日期：2016-03-02

DOI：10.13698/j.cnki.cn36-1037/c.2016.03.011

基金項目：江西省教育廳科學技術(shù)研究項目(GJJ13667)

作者簡介：黃慶(1965-)，男，江西奉新人，贛南師范學院化學化工學院高級實驗師，研究方向：酶催化、天然產(chǎn)物應(yīng)用. ? 通訊作者：張熊祿(1955-)，男，江西婺源人，贛南師范學院化學化工學院教授，研究方向：有機藥物合成.

中圖分類號：TQ914.1

文獻標志碼：A

文章編號：1004-8332(2016)03-0041-04

Study on Extraction of Flavonoids from Apple Peel with Microwave and Its Antioxidant

HUANG Qing, ZHANG Hehui, WU Xiaochen, ZHANG Xionglu

(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,GannanNormalUniversity,Ganzhou341000,China)

Abstract:In the paper, the extraction conditions of flavonoids in apple peels were optimized based on microwave method and single factor experiment. The antioxidant abilities of flavonoids were also studied by using Trolox as the reference. The results showed that the extraction efficiency of flavonoids can reach 2.50% under the optimum extraction conditions (solid-to-liquid ratio 1:5, concertration ethanol 60%, microwave power 390 W, extraction time 2 min). The clearance rate of flavonoids extracted from apple peels toward GO· was increased as the concentration of flavonoids was increased. Moreover, the maximum clearance rate was up to 25.2 %, indicating that the flavonoids extracted from apple peels have potential clearance ability toward radicals in human bodies.

Key words:flavonoid; apple peels; microwave; galvinoxyl radical; trolox; antioxidant activity

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/36.1037.C.20160510.1106.010.html