乙型肝炎病毒PreS1Ag、抗HBc-IgM和HBV-DNA聯(lián)合監(jiān)測相關(guān)性分析

劉勇波，陳燕如

(廣東省佛山市南海經(jīng)濟開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.內(nèi)科　528237)

·臨床研究·

乙型肝炎病毒PreS1Ag、抗HBc-IgM和HBV-DNA聯(lián)合監(jiān)測相關(guān)性分析

劉勇波1，陳燕如2

(廣東省佛山市南海經(jīng)濟開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.內(nèi)科528237)

目的通過聯(lián)合檢測健康體檢者和乙型肝炎患者的乙型肝炎兩對半、HBV前S1抗原(PreS1Ag)、抗HBV核心抗體IgM(HBc-IgM)、HBV核酸定量(HBV-DNA)等各項指標(biāo)，探討它們之間的相關(guān)性及臨床意義。方法采用時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)定量檢測“乙型肝炎兩對半”，PreS1Ag與抗HBc-IgM檢測均采用ELISA檢測，HBV-DNA采用實時熒光定量PCR方法檢測。結(jié)果乙型肝炎組中PreS1Ag、抗HBc-IgM、HBV-DNA的陽性率都明顯高于對照組的陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在4種不同HBV感染模式組別中，抗PreS1Ag和HBc-IgM的陽性率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.469，P<0.05；χ2=9.922，P<0.05)，HBV-DNA的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.848，P>0.05)。114例乙型肝炎患者中，PreS1Ag陽性90例，陽性率為78.9%，HBV-DNA陽性101例，陽性率為88.6%，符合率為89.1%(90/101)，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.451，P>0.05)，結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.863)。結(jié)論PreS1Ag不僅與HBV-DNA檢出率高度符合，且是比HBeAg更敏感的判斷HBV感染和復(fù)制的重要指標(biāo)，同時抗HBc-IgM與HBV的活動性復(fù)制呈正相關(guān)，抗HBc-IgM也是HBV在體內(nèi)復(fù)制的重要指標(biāo)，因此PreS1Ag、抗HBc-IgM以及HBV-DNA 聯(lián)合乙型肝炎“兩對半”對診斷乙型肝炎具有更好的臨床意義。

乙型肝炎；乙型肝炎病毒前S1抗原；乙型肝炎病毒核酸定量；抗乙型肝炎病毒核心抗體IgM

目前診斷乙型肝炎最常用的指標(biāo)是HBV血清學(xué)標(biāo)志物，即乙型肝炎兩對半檢測[1],而乙型肝炎兩對半只能反映人體對HBV的免疫反應(yīng)狀態(tài)，不能直接反映HBV在患者體內(nèi)的復(fù)制情況[2]。HBV前S1蛋白是HBV表面蛋白成分中與乙型肝炎表面抗原(HBsAg)氨基末端相連接的多肽，是HBV入侵肝細胞的主要結(jié)構(gòu)成分，在病毒入侵肝細胞過程中起主要作用[3]。國外研究表明，HBV前S1抗原(PreS1Ag)與病毒復(fù)制關(guān)系密切[4]。因此，PreS1Ag作為HBV感染的標(biāo)志物越來越被臨床重視?？笻BV核心抗體IgM(HBc-IgM)出現(xiàn)于HBV感染早期，也是慢性肝炎復(fù)發(fā)之前，故HBc-IgM陽性是HBV急性感染和復(fù)制活躍的指征[5]。因此，抗HBc-IgM的檢測在急性乙型肝炎發(fā)病機制中起著重要的作用，并可為這些肝病的臨床治療研究提供新的參考數(shù)據(jù)。HBV核酸定量(HBV-DNA)是直接反映HBV復(fù)制狀態(tài)及傳染性的最佳指標(biāo)，同時也可用于判斷乙型肝炎感染的嚴重程度和傳染性，長期以來有不少專家學(xué)者認為HBV-DNA是診斷乙型肝炎，提示病毒復(fù)制的“金標(biāo)準(zhǔn)”[6-8]。本研究中收集114例乙型肝炎患者與51例健康患者血清，同時進行PreS1Ag、抗HBc-IgM和HBV-DNA的聯(lián)合檢測，探討乙型肝炎患者各項指標(biāo)的相關(guān)性及臨床意義，為臨床診治乙型肝炎患者提供重要實驗室依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料2014年4月至2015年6月在南海經(jīng)濟開發(fā)區(qū)醫(yī)院內(nèi)科住院及門診確診為乙型肝炎患者的114例納入乙型肝炎組，其中男56例，女58例，年齡23～79歲，平均(43.7±6.1)歲；乙型肝炎患者病例的診斷均符合2000年中華醫(yī)學(xué)會西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選擇該院預(yù)防保健科健康體檢者51例納入對照組，其中男26例，女25例，年齡23～67歲,平均(39.8±8.2)歲。

1.2儀器與試劑乙型肝炎兩對半診斷試劑盒購于蘇州新波生物技術(shù)有限公司，HBc-IgM檢測試劑盒和PreS1Ag檢測試劑盒購于上?？迫A生物工程有限公司，HBV-DNA檢測試劑盒購于中山大學(xué)達安基因股份有限公司。檢測儀器包括時間分辨熒光免疫分析儀(ANYTEST-2000，上海新波生物技術(shù)有限公司)、全自動酶標(biāo)洗板機(Egate-2310，上海新波生物技術(shù)有限公司)、酶標(biāo)變頻振蕩器(新波2510，上海新波生物技術(shù)有限公司)。

1.3檢測方法

1.3.1“乙型肝炎兩對半”定量檢測分別加入100 μL陰性、陽性對照和待檢血清到反應(yīng)孔，加完后用封口膜封板。在振蕩儀慢速振蕩孵育40 min(室溫20～25 ℃)。揭下封口膜并棄掉，用洗板機洗滌4次，最后扣干。每孔加入已稀釋的銪標(biāo)記物100 μL，用封口膜封板。然后置于振蕩儀慢速振蕩孵育40 min(室溫20～25 ℃)。揭下封口膜并棄掉，用洗板機洗滌6次。每孔加入增強液100 μL，慢速振蕩孵育5 min。用時間分辨熒光測定儀測定各孔的熒光讀數(shù)。

1.3.2HBV-DNA定量檢測用無菌的干燥玻璃管采靜脈血2 mL，1 500 r/min離心5 min，吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至1.5 mL滅菌離心管。取100 μL血清加入等量DNA濃縮液，振蕩混勻5 s；12 000 r/min離心10 min；去上清，沉淀中加入20 μL DNA提取液，振蕩混勻5～10 s，瞬時離心數(shù)秒，100 ℃恒溫處理(10±1)min；12 000 r/min離心5 min。取PCR反應(yīng)管若干，分別加入處理后的樣品上清液2 μL，8 000 r/min離心數(shù)秒，放入PCR擴增儀樣品槽。將各反應(yīng)管放入ABI Prism 7300 PCR儀器的微孔反映槽內(nèi)，在電腦上按對應(yīng)順序設(shè)置陰性、陽性質(zhì)控品以及未知標(biāo)本，并設(shè)置樣品名稱、標(biāo)記熒光基團種類和循環(huán)條件，2 h擴增結(jié)束后，在電腦的分析菜單下選擇自動分析。

1.3.3PreS1Ag和抗HBc-IgM定性檢測待測孔加入標(biāo)本、陰陽性對照各50 μL，封板，置于37 ℃孵育30 min。使用洗板機洗滌5次后拍干。接著每孔加酶結(jié)合物50 μL(空白對照孔不加)，充分混勻，再次封板，37 ℃孵育30 min。再用洗板機洗滌5次后拍干。每孔加顯色劑A、B各50 μL，充分混勻后封板，37 ℃孵育15 min。每孔加終止液50 μL，混勻。立即用酶標(biāo)儀讀數(shù)(波長450 nm)，讀取各孔吸光度(OD)值。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.12組3項指標(biāo)陽性率比較與對照組比較，乙型肝炎組中抗HBc-IgM、PreS1Ag及HBV-DNA的陽性率均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1　2組3項指標(biāo)陽性率比較[n(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2乙型肝炎患者不同HBV感染模式與3項指標(biāo)的相關(guān)性在114例乙型肝炎患者中“大三陽”，“小三陽”，HBsAg與 HBeAg陽性、HBsAg與HBeAb陽性4種不同的感染模式組中，PreS1Ag和HBV-DNA的陽性率呈正相關(guān)。在4種不同HBV感染模式組別中，通過χ2檢驗，抗HBc-IgM和PreS1Ag的陽性率差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.922，P<0.05；χ2=9.469，P<0.05)，表明抗HBc-IgM和PreS1Ag在4種不同HBV感染模式組別中陽性檢出率差異明顯。4種不同HBV感染模式組別中，HBV-DNA的陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.848，P>0.05)，說明HBV-DNA的陽性檢出率沒有明顯差異。

表2　乙型肝炎患者不同HBV感染模式與3

2.3乙型肝炎患者PreS1Ag與HBV-DNA相關(guān)分析PreS1Ag與HBV-DNA結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.451，P>0.05)，兩者呈顯著正相關(guān)(r=0.863,P<0.05)。表明在114例乙型肝炎患者中PreS1Ag及HBV-DNA檢測結(jié)果有較高的符合率，PreS1Ag與HBV-DNA高度相關(guān)。

表3　乙型肝炎患者PreS1Ag與HBV-DNA

3討論

HBV是一種嗜肝細胞病毒，完整的HBV顆粒呈球形，直徑為42 nm，具有雙層衣殼蛋白，由外殼蛋白和核心成分組成。外殼蛋白即囊膜由脂質(zhì)雙層與蛋白質(zhì)構(gòu)成，由S、前S1和前S2組成，包膜內(nèi)部包裹的是二十面立體對稱的內(nèi)核，內(nèi)核表面含有乙肝病毒核心抗原(HBcAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)，內(nèi)核核心成分包括雙股DNA和DNA多聚酶[9]。相關(guān)研究表明，PreS1Ag已成為感染、復(fù)制和乙型肝炎患者診斷、治療和預(yù)后的一項重要指標(biāo)[10-12]。

本文通過對114例乙型肝炎患者血清檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，PreS1Ag在乙型肝炎組血清中陽性率為78.9%，提示PreS1Ag在一定程度上可作為HBV感染的又一血清標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，乙型肝炎組中抗HBc-IgM、PreS1Ag及HBV-DNA的陽性率都明顯高于對照組的陽性率。檢測中出現(xiàn)少數(shù)HBsAg陰性而PreS1Ag陽性的情況，經(jīng)過分析主要原因可能是HBsAg濃度過高引起的鉤狀效應(yīng)、HBV處于潛伏期或者HBsAg分泌量不足，同時也可因為編碼HBsAg的HBV中S區(qū)發(fā)生基因變異。本研究中還出現(xiàn)HBsAg陽性而PreS1Ag陰性的現(xiàn)象，因為PreS1Ag是HBsAg的組成成分之一，可作為HBV感染的標(biāo)志，但HBsAg不僅存在于完整的病毒顆粒表面，還存在于小球顆粒及管型顆粒，而PreS1Ag只能在完整病毒顆粒表面有效表達，因此可出現(xiàn)HBsAg陽性而PreS1Ag陰性的現(xiàn)象[13]。PreS1Ag陽性率為78.9%，HBV-DNA陽性率為88.6%，兩者符合率為89.1%(90/101),兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.451，P>0.05),提示呈正相關(guān)(r=0.863)，因此PreS1Ag與 HBV-DNA 是檢測率高度符合的重要病毒復(fù)制指標(biāo)，與鄒偉等[14]的研究結(jié)果一致。

在乙型肝炎兩對半中，HBeAg是HBV核心內(nèi)部成分，是HBV處于復(fù)制狀態(tài)的標(biāo)志，但HBeAg陰性并不意味著HBV復(fù)制的完全終止或病毒血癥的消失，可能是HBV基因組的前C區(qū)發(fā)生變異而導(dǎo)致HBeAg表達障礙，這時PreS1Ag檢測陽性比HbeAg更能反映HBV復(fù)制情況，因此，PreS1Ag作為HBV病毒感染、復(fù)制的指標(biāo)比HbeAg更敏感，有獨立檢測的價值，對乙型肝炎兩對半檢測起重要的補充作用。表2顯示，HBV-DNA和PreS1Ag在4種不同HBV感染模式組別的陽性率都較高，并且HBV-DNA和PreS1Ag的陽性率在HBeAg陽性組明顯高于HBeAg陰性組，提示PreS1Ag、HBV-DNA和 HBeAg三者關(guān)系密切，在HBV復(fù)制時表達最多，可作為HBV存在及病毒復(fù)制和有傳染性的指標(biāo)[15]。

HBV感染機體后，體液免疫反應(yīng)首先產(chǎn)生以抗HBc-IgM為主的免疫球蛋白，隨后IgM抗體滴度下降，而IgG效價迅速上升。因此，抗HBc-IgM可以作為HBV感染早期診斷的指標(biāo)，以往認為抗HBc-IgM可作為HBV近期感染的血清學(xué)標(biāo)記，但后來發(fā)現(xiàn)在慢性乙型肝炎中也有較多陽性者。因此，抗HBc-IgM陽性是HBV在體內(nèi)復(fù)制的重要指標(biāo)，提示患者近期有HBV感染或慢性乙型肝炎患者的HBV有活動性復(fù)制，患者有很強的傳染性。本研究結(jié)果顯示，在4種不同HBV感染模式組別中，抗HBc-IgM的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.922，P<0.05)，表明抗HBc-IgM在4種不同HBV感染模式組別中陽性檢出率具有明顯差異。本研究中，抗HBc-IgM在“大三陽”和“小三陽”中的陽性率分別為39.2%和29.2%。表明抗HBc-IgM與HBV的活動性復(fù)制呈正相關(guān)。

外周血清中HBV-DNA的檢測反映完整HBV顆粒的釋放，是檢測病毒復(fù)制最直接可靠的指標(biāo)。本研究中，HBV-DNA在“大三陽”組的檢出率為90.2%，但同時也存在HBV-DNA陰性的患者，其原因可能為藥物抑制HBV-DNA復(fù)制，但仍存在低水平病毒復(fù)制的可能，只是濃度低于檢測下限(<500)，也可能標(biāo)本內(nèi)含有抑制擴增反應(yīng)的物質(zhì)，如含有Taq DNA聚合酶抑制物。在4種不同HBV感染模式組別中HBV-DNA的陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.848，P>0.05)，說明HBV-DNA的陽性檢出率沒有明顯差異。熒光定量PCR對實驗室要求條件較高，一般基層醫(yī)療單位還很難開展。相關(guān)研究報道，PreS1Ag與HBV-DNA有較好的一致性，但又存在一定的交叉陽性和交叉陰性[16]。因此，PreS1Ag不能等同或替代HBV-DNA的檢測，在臨床診斷中應(yīng)充分依據(jù)兩種指標(biāo)的獨立性和互補性來診治患者。

綜上所述，PreS1Ag是比HBeAg更敏感的判斷HBV感染和復(fù)制的重要指標(biāo)，能夠彌補由于HBeAg陰性情況下給臨床診斷和治療帶來的“誤導(dǎo)”，抗HBc-IgM與HBV的活動性復(fù)制呈正相關(guān)，可以作為乙型肝炎檢查的常規(guī)項目，因此抗HBc-IgM、PreS1Ag及HBV-DNA 聯(lián)合乙型肝炎“兩對半”對診斷乙型肝炎具有更好的意義。

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2016-01-28修回日期：2016-03-18)

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.055

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